李振坤 ，白團(tuán)麗 ，楊璘宇 ，王 穎

（1）昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，云南 昆明 650101;2）昆明醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500）

肺栓塞（pulmonary embolism）是一種常見且可能致命的肺血管疾病[1]，尋找新的藥物一直是臨床研究熱點。急性右心衰竭是肺栓塞患者主要死亡原因，右心的炎癥因子改變在肺栓塞發(fā)病中非常重要，可以作為肺栓塞的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后評估指標(biāo)[2]。肺栓塞與中性粒細(xì)胞趨化因子（cytokine-induced neutrophil chemoattractants，CINC）相關(guān)的炎癥效應(yīng)密切相關(guān)[3-4]，中性粒細(xì)胞相關(guān)的炎癥在肺栓塞后的多種并發(fā)癥中發(fā)揮作用。燈盞花素廣泛用作治療心血管疾病，具有強大的心血管藥理作用。多項藥理研究表明，燈盞花素對缺血性疾病及肺外的血栓性疾病具有治療作用[5-6]。本課題前期研究顯示：燈盞花素有抗急性肺栓塞的作用，燈盞花素可以下調(diào)肺組織單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant-1，MCP-1）、白細(xì)胞介素-13（interleukins-13，IL-13）基因、蛋白水平發(fā)揮肺栓塞保護(hù)作用[7]，但燈盞花素對右心的炎癥因子影響如何還不得而知。本研究擬通過大鼠肺栓塞模型評估燈盞花對其右心室的保護(hù)作用，并通過檢測右心室 CINC-1、CINC-2 基因及蛋白表達(dá)水平，驗證燈盞花對肺栓塞后右心室炎癥損傷的保護(hù)作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

燈盞花素購自廣東彼迪藥業(yè)有限公司（批號：20180101）；醫(yī)用低分子肝素購自河北常山生化藥業(yè)股份有限公司（批號：F402180807）；PCR 引物設(shè)計：Beacon Designer 7.90；引物合成：廣州invitrogen Trizol Reagent：Lifetech 15 596026；WB試劑：RIPA 裂解液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液（6X）均購自碧云天，內(nèi)參一抗：β-actin 抗體購自 abcam 生物醫(yī)藥公司，CINC1 抗體批號 ab86436、CINC2 抗體批號ab 220431；檢測二抗：山羊抗小鼠（HRP 標(biāo)記）通用型二抗，購自美國 CST 公司，批號 cst 7074，7076。

1.2 動物

SD 雄性大鼠30 只，周齡7～9 周，體重250～300 g，購自昆明醫(yī)科大學(xué)，許可證號：SCXK（滇）K2015-0002，標(biāo)準(zhǔn)喂養(yǎng)室 溫 20 ℃，濕度 60%。本研究符合昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會所制定的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn) 。

1.3 儀器

上海UNICO 全波長分光光度計；Thermo 酶標(biāo)儀；ABI StepOne 定量PCR 儀；BIO-RAD 凝膠成像儀；BIO-RAD 垂直電泳槽；BIO-RAD 濕式轉(zhuǎn)膜槽；威恒電子天平；其林貝爾靜音混合儀。

1.4 方法

1.4.1 制備自體血栓每組大鼠標(biāo)記稱重并記錄，大鼠尾靜脈取血 600 μL，立馬注入外徑 1 mm 導(dǎo)管，37 ℃溫箱進(jìn)行孵育 30 min，放入-20 ℃冰箱中 1 min，進(jìn)行血栓凝固，30 min 后將導(dǎo)管置入 70 ℃水浴鍋 10 min。取出導(dǎo)管并將導(dǎo)管用刀片切成 2 mm 長度，顯微鑷取出血栓，放入裝有0.002 L 生理鹽水離心管中，制備自體靜脈血栓。

1.4.2 肺栓塞模型建立及給藥處理（1）SD 大鼠隨機分為 5 組（每組6只）：假手術(shù)組（Control），模型組（Model），燈盞花素低劑量組（Bre10 g/L），燈盞花素高劑量組（Bre 20 g/L），低分子肝素陽性藥組（LMWH 10.250 IU/L），使用小動物生理儀監(jiān)測大鼠的心率與呼吸次數(shù)。（2）造模 用 2% 戊巴比妥鈉進(jìn)行動物麻醉后，所有組均沿頸前正中線做長約 2 cm 的切口，鈍性分離大鼠右側(cè)的頸總靜脈，并用導(dǎo)管將混有自體血栓 20 個栓子的0.002 L生理鹽水注入到頸總靜脈，縫合切口。假手術(shù)組：右側(cè)頸總靜脈注射0.002 L 生理鹽水；模型組及給藥各組：右側(cè)頸總靜脈注射0.002 L 生理鹽水+血栓塊（20 個）。（3）給藥處理 經(jīng)大鼠肺栓塞燈盞花素量效實驗確定燈盞花素最佳低、高劑量分別為10 g/L 及20 g/L（表1），于建立模型前 2 h，假手術(shù)組與模型組腹腔注射0.002 L 生理鹽水，燈盞花素低劑量、高劑量與低分子肝素陽性藥組腹腔分別注射低劑量燈盞花素（10 g/L）、高劑量燈盞花素（20 g/L）及低分子肝素（10.250 IU/L）。血栓輸注 24 h 后，再次記錄大鼠的心率與呼吸次數(shù)，觀察大鼠一般情況。打開腹腔切斷下腔動靜脈放血處死動物，取右下肺組織 HE 染色；右心室組織放入 0.001 L trizol 裂解液（-80 ℃保存），后期進(jìn)行 Q-PCR 及 WB。

表1 燈盞花素對大鼠肺栓塞影響的量效關(guān)系（ ）Tab.1 Dose-effect relationship of breviscapine on pulmonary embolism in rats（）

表1 燈盞花素對大鼠肺栓塞影響的量效關(guān)系（ ）Tab.1 Dose-effect relationship of breviscapine on pulmonary embolism in rats（）

與假手術(shù)組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01；與模型組比較，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01。

1.4.3 HE 染色右下肺組織放入 50 mL 4% 多聚甲醛（常溫固定備用），脫水包埋制備切片，經(jīng)蘇木精-伊紅染色后于顯微鏡下觀察肺組織的病理變化，普通光學(xué)顯微鏡下觀察顯色結(jié)果并分別在4 倍鏡、10 倍鏡下拍照。每組6例大鼠，每張切片隨機選5 個高倍視野。

1.4.4 Q-PCR 檢測mRNA 表達(dá)Q-PCR 引物序列如下（F 代表上游引物forward；R 代表下游引物reverse），見表2。

表2 Q-PCR 引物序列Tab.2 Q-PCR primer sequences

取20 mg 大鼠右心室組織，液氮研磨后，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)體積為20 μL，42 ℃ 溫育60 min，70 ℃ 加熱10 min 后終止反應(yīng)，冰浴冷卻，得到逆轉(zhuǎn)錄的cDNA 第一條鏈。進(jìn)行Q-PCR 擴增，放入ABI Stepone 儀器中。

設(shè)置PCR 循環(huán)反應(yīng)條件，預(yù)變性，變性（95 ℃）15 s，退火及延伸（60 ℃）30 s，共40～45 循環(huán)，對循環(huán)產(chǎn)物進(jìn)行溶解曲線分析，反應(yīng)結(jié)束，收集信息，做Ct 值分析。Q-PCR 的實驗結(jié)果采用2-△△Ct法進(jìn)行分析，＞ 1，參考公式2-△△Ct==2^-[（Ct 實驗組目的基因-Ct 實驗組內(nèi)參基因）-（Ct 對照組目的基因-Ct 對照組內(nèi)參基因）]，得到Ct 數(shù)據(jù)后再與內(nèi)參作除法比較。

1.5 Western-blot 檢測蛋白表達(dá)

取-80 ℃ 的肺栓塞大鼠左下肺，每100 mg組織中加入500 μL 的RIPA 裂解液（含50 μL 蛋白酶抑制劑），剪碎組織后，冰浴環(huán)境下用超聲細(xì)胞破碎儀勻漿20 s，冰浴上靜置裂解 20 min。4 ℃，12 000 r/min 離心10 min，收集上清液，根據(jù)BCA 試劑盒測定蛋白濃度。10% 的 SDS-聚丙烯酰胺凝膠，每孔加入蛋白樣品 50 μg，進(jìn)行電泳；然后進(jìn)行濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜（260 mA 轉(zhuǎn)膜 70 min 至PVDF 膜上）；5% 脫脂奶粉室溫封閉 2 h；特異性一抗（1∶1 000）封閉 4 ℃ 過夜，TBST 洗膜3 次；二抗IgG-HRP（1∶5 000）室溫封閉 1 h，TBST 洗膜3 次，每次15 min。將 PVDF 膜置于化學(xué)發(fā)光成像儀進(jìn)行成像，采用 Image Lab 分析軟件對各組條帶的光密度值進(jìn)行分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

研究數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較使用獨立樣本t檢驗，多組間的比較使用單因素方差分析（One-way ANOVAs），統(tǒng)計結(jié)果采用Graphpad Prism 8.0 作柱狀圖，P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般狀況，生命體征情況

模型組大鼠心率、呼吸次數(shù)增快、面色青紫，各組分別給與燈盞花素低、高劑量及低分子肝素后有所改善。心率監(jiān)測顯示：假手術(shù)組（356±14）次/min，模型組（428±31）次/min，燈盞花素低劑量組（374±25）次/min，燈盞花素高劑量組（357±19）次/min，低分子肝素組（385±33）次/min。模型組大鼠與與假手術(shù)組相比，模型組心率增快有明顯統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.15，P＜ 0.01）；燈盞花素低劑量組與模型組比較，心率下降有明顯統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.30，P＜ 0.01）；燈盞花素高劑量組與模型組比較，心率下降有明顯統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.75，P＜ 0.01）；低分子肝素組與模型組比較，心率下降有明顯統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.30，P＜ 0.01），見表3，圖1。

表3 燈盞花素對大鼠肺栓塞生命體征影響（ ）Tab.3 The effect of breviscapine on the vital signs of pulmonary embolism in rats（）

表3 燈盞花素對大鼠肺栓塞生命體征影響（ ）Tab.3 The effect of breviscapine on the vital signs of pulmonary embolism in rats（）

與假手術(shù)組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01；與模型組比較，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01。

圖1 給藥后大鼠心率、呼吸變化Fig.1 Changes in heart rate and respiration in rats after administration

呼吸監(jiān)測顯示：假手術(shù)組呼吸（82±9）次/min，模型組（94±9）次/min，燈盞花素低劑量組（76±37）次/min，燈盞花素高劑量組（84±10）次/min，低分子肝素組（83±7）次/分。模型組大鼠與與假手術(shù)組比較，模型組呼吸增快有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.44，P＜ 0.05）；低分子肝素組與模型組比較，呼吸下降有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.34，P＜ 0.05），見表3，圖1。

2.2 病理學(xué)改變

HE 染色肺組織病理的變化顯示：假手術(shù)組肺動脈內(nèi)干凈無血栓，模型組肺小動脈內(nèi)血管內(nèi)多發(fā)血栓，肺動脈內(nèi)血管內(nèi)間質(zhì)炎癥反應(yīng)明顯，肺泡內(nèi)紅色炎癥樣物質(zhì)滲出，右心室擴張，可確定肺栓塞模型組大鼠上述指標(biāo)相比正常組有損傷，造模成功。分別給予高、低劑量燈盞花素后，上述病理改變分別在4 倍鏡、10 倍鏡下好轉(zhuǎn)，肺血管內(nèi)多發(fā)血栓減輕、間質(zhì)炎癥反應(yīng)減輕、肺泡內(nèi)紅色炎癥樣物質(zhì)減少，見圖2。

圖2 各組大鼠肺組織病理檢查Fig.2 Pathological examination of lung tissue of rats in each group

2.3 Q-PCR 顯示基因水平改變

各組右心室Q-PCR 結(jié)果：CINC-1 的溶解曲線Ct 值與內(nèi)參比值顯示假手術(shù)組（1.19±0.18），模型組（15.11±2.35），燈盞花素低劑量組（7.40±1.50），燈盞花素高劑量組（2.27±0.45），低分子肝素組（3.20±0.58）。與假手術(shù)組比較，模型組比值明顯升高，差別具有明顯統(tǒng)計學(xué)意義（t=14.46，P＜ 0.01）；與模型組比較，燈盞花素低劑量組比值明顯降低，差別具有明顯統(tǒng)計學(xué)意義（t=6.77，P＜ 0.01）；與模型組比較，燈盞花素高劑量組比值明顯降低，差別具有明顯統(tǒng)計學(xué)意義（t=13.13，P＜ 0.01）；與低分子肝素組比較，燈盞花素高劑量組比值明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.06，P＜ 0.05），見圖3。

圖3 Q-PCR 檢測燈盞花素干預(yù)肺栓塞大鼠右心室CINC-1、CINC-2 基因表達(dá)Fig.3 Q-PCR detection of right ventricular CINC-1 and CINC-2 gene expression in rats with breviscapine intervention with pulmonary embolism

各組右心室Q-PCR 結(jié)果：CINC-2 的溶解曲線Ct 值與內(nèi)參比值顯示假手術(shù)組1.27±0.26，模型組11.89±1.82，燈盞花素低劑量組6.12±1.11，燈盞花素高劑量組2.63±0.94，低分子肝素組3.41±0.92。與假手術(shù)組比較，模型組比值明顯升高，差別具有明顯統(tǒng)計學(xué)意義（t=14.14，P＜ 0.01）；與模型組比較，燈盞花素低劑量組比值明顯降低，差別具有明顯統(tǒng)計學(xué)意義（t=6.62，P＜ 0.01）；與模型組比較，燈盞花素高劑量組比值明顯降低，差別具有明顯統(tǒng)計學(xué)意義（t=11.06，P＜ 0.01）；與低分子肝素組比較，燈盞花素高劑量組比值沒有統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.45，P＞ 0.05），見圖3。

2.4 Western-blot 顯示蛋白表達(dá)水平改變

各組右心室CINC-1 的Western-blot 結(jié)果：CINC-1 蛋白表達(dá)水平與內(nèi)參比值顯示假手術(shù)組（0.393±0.168），模型組（0.879±0.132），燈盞花素低劑量組（0.616±0.145），燈盞花素高劑量組0.411±0.74，低分子肝素組0.576±0.138。與假手術(shù)組比較，模型組比值明顯升高，差別具有明顯統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.57，P＜ 0.01）；與模型組比較，燈盞花素低劑量組比值明顯降低，差別具有明顯統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.29，P＜ 0.01）；與模型組比較，燈盞花素高劑量組比值明顯降低，差別具有明顯統(tǒng)計學(xué)意義（t=7.58，P＜ 0.01）；與低分子肝素組比較，燈盞花素高劑量組比值明顯降低，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.58，P＜ 0.05），見圖4，圖5。

圖4 WB 檢測肺栓塞大鼠右心室CINC-1、CINC-2 蛋白表達(dá)Fig.4 The protein expression of CINC-1 and CINC-2 in the right ventricle of rats with pulmonary embolism detected by WB

各組右心室 CINC-2 的 Western-blot 結(jié)果：CINC-2 蛋白表達(dá)水平與內(nèi)參比值顯示假手術(shù)組0.462±0.229，模型組 0.934±0.250，燈盞花素低劑量組0.730±0.220，燈盞花素高劑量組 0.506±0.171，低分子肝素組 0.677±0.199。與假手術(shù)組比較，模型組比值明顯升高，差別具有明顯統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.41，P＜ 0.01）；與模型組比較，燈盞花素高劑量組比值明顯降低，差別具有明顯統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.47，P＜ 0.01）；與模型組比較，燈盞花素低劑量組比值差別無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.50，P＞ 0.05）；與低分子肝素組比較，燈盞花素高劑量組比值差別無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.60，P＞ 0.05），見圖4，圖5。

圖5 WB 檢測燈盞花素干預(yù)肺栓塞大鼠右心室CINC-1、CINC-2 蛋白表達(dá)Fig.5 WB detection of right ventricular CINC-1 and CINC-2 protein expression in rats with breviscapine intervention withpulmonary embolism

3 討論

隨著各地診斷水平的提高，肺栓塞被越來越多的重視，每年的肺栓塞確診病例不斷增加。在美國，每年診治超過 600 000 例 急性肺栓塞病例，肺栓塞是急診科的常見疾病[8]。來自發(fā)達(dá)國家的一項十年的研究顯示：肺栓塞和深靜脈血栓的在癌癥患者中高發(fā)，而且發(fā)生肺栓塞后死亡風(fēng)險極高[9]。肺栓塞危害極大，常常引起急性右心衰竭、呼吸衰竭、呼吸困難、胸痛甚至猝死等嚴(yán)重并發(fā)癥?；趙estern-blot 和蛋白組學(xué)的研究，肺栓塞導(dǎo)致肺動脈高壓和肺部損傷，激活炎癥系統(tǒng)，導(dǎo)致肺部、右心多種炎癥微蛋白表達(dá)差異，炎癥因子可以作為肺栓塞很好的評估指標(biāo)。肺栓塞的治療一直是臨床棘手的問題，主要的治療方案包括抗凝和溶栓藥物治療，但是核心的抗凝藥物肝素可能誘導(dǎo)血小板減少癥、致命性出血、截肢，急性心肌梗塞和中風(fēng)等致命的并發(fā)癥[10]，而溶栓治療大規(guī)模 meta 分析甚至顯示其導(dǎo)致的主要器官出血率高達(dá) 6%，顱內(nèi)出血率高達(dá) 2%[11]。新的治療肺栓塞的藥物開發(fā)很有必要。

CINC 系列因子包括中 CINC-1、CINC-2（α、β）等，在嗜中性粒細(xì)胞浸潤的炎癥中扮演重要角色[12]。Watts 等[13]報道肺栓塞使中性粒細(xì)胞右心導(dǎo)致功能障礙，CINC-1、CINC-2 的巨噬細(xì)胞聚集在右心衰肌細(xì)胞損傷的心臟地區(qū)，電子顯微鏡顯示肌細(xì)胞壞死和炎癥細(xì)胞的吞噬作用，CINC系列炎癥因子可以作為肺栓塞評估指標(biāo)。本研究顯示：肺栓塞模型組大鼠心率、呼吸有增快，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義，病理示大鼠肺組織內(nèi)見動脈血栓、右心室擴張，提示肺栓塞可以導(dǎo)致右心衰，誘發(fā)大鼠生命體征惡化。Q-PCR、WB 顯示模型組大鼠右心室心肌 CINC1 及CINC-2 基因、蛋白水平明顯升高，結(jié)果有明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P＜ 0.01），可能的機制為急性肺栓塞廣泛堵塞下游肺血管床，誘發(fā)肺動脈高壓及急性右心衰相關(guān)炎癥反應(yīng)，而急性右心衰繼發(fā)右心室明顯增大、擴張、炎癥反應(yīng)，增加了炎癥因子 CINC-1 及 CINC-2 水平。

燈盞花素對缺血性疾病及肺外的血栓性疾病具有治療作用。也有較強的抗炎效應(yīng)。燈盞花素還有有抗急性肺栓塞的作用，HU 等在大鼠急性肺栓塞模型中證實了燈盞花素對肺栓塞動物動脈血氣的氧分壓、二氧化碳分壓水平異常具有改善作用，但具體機制及藥物作用的靶點未明確[14]。本課題前期研究顯示燈盞花素有肺內(nèi)抗肺栓塞作用[7]，但對肺栓塞繼發(fā)右心損傷的炎癥機制未知。本研究顯示燈盞花素高、低劑量組及低分子肝素組均能改善肺栓塞大鼠心率、呼吸次數(shù)及顯著下調(diào)明顯升高的 CINC-1 及 CINC-2 基因和蛋白水平，提示燈盞花素具有改善肺栓塞后大鼠心率及呼吸增快的效應(yīng)，CINC-1 及 CINC-2 可能作為燈盞花素發(fā)揮抗肺栓塞炎癥作用的新靶點。另外，在大鼠右心 CINC-1 基因和蛋白表達(dá)水平上，燈盞花素高劑量組優(yōu)于陽性藥低分子肝素組和燈盞花素低劑量組，燈盞花素具有劑量相關(guān)性。這一結(jié)果證實了燈盞花素在肺栓塞大鼠模型中具有改善右心室中性粒細(xì)胞驅(qū)化因子的作用可能優(yōu)于低分子肝素。

燈盞花素可以下調(diào)急性肺栓塞大鼠右心室CINC-1、CINC-2 的基因和蛋白表達(dá)水平，可能發(fā)揮抗肺栓塞炎癥的作用。