努爾滿古力·肉孜,彭 敏,張 玲
(廣元市中心醫(yī)院,廣元 628000)
惡性增殖是腫瘤的基本特征,腫瘤細(xì)胞可能改變物質(zhì)代謝譜式,以提供細(xì)胞增殖所需的原料,調(diào)整能量短缺狀態(tài)[1]。腫瘤細(xì)胞代謝重編程(tumor metabolic reprogramming)學(xué)說認(rèn)為,腫瘤細(xì)胞代謝調(diào)控可能是一種顛覆性的代謝調(diào)整,一方面獲得必要的能量供應(yīng),另一方面平衡能量供應(yīng)和生物大分子合成,以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞群體的快速增殖[2]。代謝重編程的前提是細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控,以此引起細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑功能及參與代謝調(diào)控的關(guān)鍵酶活性發(fā)生相應(yīng)變化,調(diào)整細(xì)胞代謝狀態(tài),影響代謝網(wǎng)絡(luò)中營養(yǎng)物質(zhì)和能量的流向和流量[3]。腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移、逃避免疫和抵制細(xì)胞凋亡為腫瘤細(xì)胞代謝重編程提供微環(huán)境[4]。宮頸癌癌前病變到宮頸癌過程是以人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)16型和18型等高危型HPV持續(xù)感染加快其病變感染過程,其檢出率高達(dá)90%以上[5]。按組織病理學(xué)分類,宮頸癌分為鱗狀細(xì)胞癌、腺癌、腺鱗癌及其他少見類型歸類,其中80%以上為鱗狀細(xì)胞癌,15%~20%屬于腺癌[6]。宮頸鱗癌的常見感染類型為HPV16,宮頸腺癌的常見感染類型為HPV18[7]。本團(tuán)隊(duì)前期研究中采用高分辨魔角核磁共振及超高效液相色譜聯(lián)合質(zhì)譜等高通量技術(shù),對宮頸癌、癌前病變組織進(jìn)行代謝組學(xué)研究,明確宮頸鱗癌發(fā)生及HPV16感染與腫瘤組織細(xì)胞內(nèi)代謝紊亂有關(guān),其中糖酵解、脂肪酸-β氧化和谷氨酰胺氧化代謝增強(qiáng),篩選出12種代謝標(biāo)志物[8-9]。可見,腫瘤發(fā)生伴有細(xì)胞代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)發(fā)生明顯改變,表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)小分子代謝物水平上發(fā)生“微調(diào)”,是腫瘤早期預(yù)警的重要標(biāo)記。但是,從HPV感染水平上研究腫瘤細(xì)胞代謝調(diào)控的研究甚少。本研究通過探討HPV感染與腫瘤細(xì)胞內(nèi)小分子化合物代謝調(diào)控的關(guān)系,為詮釋宮頸癌發(fā)病機(jī)制及早期預(yù)警提供依據(jù)。
1.1 主要儀器設(shè)備及試劑 600M核磁共振波譜儀(VARIAN,美國),核磁共振波譜儀工作站(Inova 600M,美國),熒光倒置顯微鏡(DMI6000B LEICA,德國),倒置顯微鏡(AE31,中國),共聚焦激光顯微鏡(C2尼康,日本),Real time RT-PCR SYBR Green1試劑盒(TAKARA,日本),RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo公司,美國),SiHa宮頸癌細(xì)胞(HPV16陽性)由中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所細(xì)胞庫提供,DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS),雙抗(青霉素和鏈霉素)和胰蛋白酶;Trizol試劑(DP405北京天根生物公司),氯仿(上海生工),異丙醇、乙醇(上海生工),聚酰胺(新疆恒博鑫業(yè)),旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Heidolph,德國),二氧化碳培養(yǎng)箱(HERAEUS,日本),生物安全柜(KS-18,Hereaus,德國)。
1.2 HPV16編碼基因E6和E7的RNAi載體構(gòu)建 根據(jù)HPV16編碼基因E6或E7在線數(shù)據(jù)庫序列,設(shè)計(jì)2對shRNA寡核苷酸片段,其中一對為E6特異性片段,另一對為E7基因特異性片段,見表1。通過RNAi寡核苷酸雙鏈的生成反應(yīng)、質(zhì)粒表達(dá)載體鏈接(克隆)、測序鑒定等過程,小規(guī)模制備用于轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的質(zhì)粒。
表1 HPV16編碼基因相應(yīng)的RNAi寡核苷酸單鏈信息
1.3 建立HPV編碼基因RNAi細(xì)胞模型 在常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)條件下,用含10%胎牛血清、100μg/mL鏈霉素的DMEM全培養(yǎng)基培養(yǎng)SiHa宮頸癌細(xì)胞。細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí),用胰蛋白酶(0.25%)消化收集細(xì)胞。選擇3μL X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent(Roche公司)添加至1μg質(zhì)粒DNA/100μL DMEM培養(yǎng)基,分別制備表達(dá)E6和E7 shRNA片段的RNAi細(xì)胞模型。分組:Control組(未轉(zhuǎn)染組),僅以含10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)人宮頸癌SiHa細(xì)胞,在轉(zhuǎn)染步驟加無血清無抗生素DMEM;pGFP載體組(空白對照組),轉(zhuǎn)染表達(dá)pGFP的空載體;pRNAi載體組,加pRNAi載體,轉(zhuǎn)染HPV16-E6-siRNA和HPV16-E7-siRNA載體并表達(dá)GFP的載體,又分為E6-pRNAi載體組,E7-pRNAi載體組,每組設(shè)3復(fù)孔。
1.4 激光共聚焦顯微鏡轉(zhuǎn)染效率的觀察 空載體攜帶綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP),SiHa細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后,轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞在熒光倒置顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察看到綠色熒光。
1.5 RNAi抑制HPV16編碼基因表達(dá)水平的RT-PCR分析 轉(zhuǎn)染后48h,分別收集各組細(xì)胞,提取細(xì)胞總RNA,以逆轉(zhuǎn)錄試劑盒在20μL體系中逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,以此cDNA為模板,用SYBR Green I嵌合熒光法對E6和E7基因轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行Real-time PCR分析。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
1.6 基于RNAi模型的核磁共振代謝譜分析 樣品取出,室溫解凍,取450μL加入重水配制的DSS緩沖溶液50μL(0.045mol/L NaH2PO4和0.045mol/L K2HPO4)。1H-NMR采用NOESYPRESAT-ID脈沖序列進(jìn)行氫譜測定,DSS作為內(nèi)標(biāo),其化學(xué)位移定為0ppm。采用預(yù)飽和方式抑制水峰,飽和時(shí)間2s,采樣點(diǎn)數(shù)32k,譜寬10000Hz,掃描128次,采樣時(shí)間均為1.64s,測試溫度為25℃。所有1H-NMR譜進(jìn)行相位和基線校正,并用增寬因子為0.5Hz的指數(shù)窗函數(shù)進(jìn)行處理。每一個(gè)1H-NMR譜的δ9.0~0.5ppm范圍以每段為δ0.003ppm分成2668段進(jìn)行分段積分并進(jìn)行歸一化處理,同時(shí)水分的信號(hào)范圍δH=4.70~4.95ppm移除掉。數(shù)據(jù)用SIMCA-P+11軟件進(jìn)行OPLS-DA分析。
代謝物在不同組(實(shí)驗(yàn)組、空白對照組和空載體組等)的差異性采用OPLS-DA分析中獲得的變量重要性參數(shù)(variable importance in the projection,VIP)值確定。VIP>1的代謝物被認(rèn)為是兩組中具有差異性的代謝物,而代謝物含量變化的方向采用OPLS-DA分析中的變量相關(guān)系數(shù)(correlation coefficient,r)判斷。
2.1 E6-shRNA和E7-shRNA干擾宮頸癌細(xì)胞模型的建立 參照NCBI數(shù)據(jù)庫提供的HPV16基因組序列,設(shè)計(jì)一系列E6和E7 mRNA特異性小干擾發(fā)夾RNA(small hairpin RNA),并選擇同步表達(dá)報(bào)告基因GFP(綠色熒光蛋白質(zhì))和shRNA的pcDNA3質(zhì)粒載體,構(gòu)建HPV16-E6-shRNA和HPV16-E7-shRNA表達(dá)載體。轉(zhuǎn)染SiHa宮頸癌細(xì)胞(HPV16陽性),通過不同載體的抑制效率篩選,建立E6-shRNA和E7-shRNA干擾宮頸癌細(xì)胞模型。激光共聚焦成像觀察,不同表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宮頸癌細(xì)胞后,均有細(xì)胞群體發(fā)出強(qiáng)烈的熒光,見圖1。
RNAi片段表達(dá)水平與GFP報(bào)告基因表達(dá)同步,根據(jù)熒光觀察數(shù)據(jù),推斷shRNA干擾效率較高。定量RT-PCR法結(jié)果顯示,sh-RNA干擾后,E6和E7 mRNA兩種由HPV16編碼基因的表達(dá)水平降低,見表2。提示shRNA表達(dá)后,可能影響細(xì)胞內(nèi)相對應(yīng)的目標(biāo)mRNA穩(wěn)定性,引起mRNA片段降解。
圖1 RNA干擾前后SiHa宮頸癌細(xì)胞內(nèi)GFP(綠色熒光蛋白)激光共聚焦成像(10×10)
表2 RNAi抑制對SiHa宮頸癌細(xì)胞內(nèi)E6和E7基因表達(dá)水平的影響
2.2 HPV16編碼蛋白表達(dá)對宮頸癌細(xì)胞代謝譜的影響 CPMG圖譜分析結(jié)果顯示,7.80~0.50ppm范圍內(nèi),1H-NMR檢測出13種小分子化合物表達(dá)水平存在差異,其峰值未發(fā)生重疊,滿足進(jìn)一步數(shù)據(jù)分析的條件。
對1H-NMR譜進(jìn)行CPMG分段積分及積分值OPLS-DA分析,獲得二維主成分得分圖(scores plots)和三維空間分布圖(3D plots)。選擇性抑制HPV16 E6及E7表達(dá)可能影響細(xì)胞內(nèi)代謝調(diào)控,引起代謝譜發(fā)生變化,與空白對照或GFP空載體轉(zhuǎn)染組比較,包括上述小分子化合物在內(nèi)的代謝譜發(fā)生明顯差異,但在空白對照與GFP空載體組未發(fā)生明顯變化。
在OPLS-DA分析基礎(chǔ)上,計(jì)算13種代謝物的相關(guān)系數(shù)表,正值表示代謝物含量降低,負(fù)值表示代謝物含量升高,見表3。選擇性抑制HPV16編碼的E6和E7蛋白表達(dá),宮頸癌細(xì)胞內(nèi)異亮氨酸(Ilu)、亮氨酸(Leu)、纈氨酸(Val)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phenylalanine)等多種氨基酸以及α-、β-葡萄糖(α-and β-glucose)、β-羥丁酸(β-hydrocxy butyrate)、乙酸(acetate)含量顯著升高,乳酸(Lactate)、丙氨酸(Ala)、甲酸(formate)、甲基組氨酸(Methylhistidine)含量顯著降低,提示抑制HPV16編碼蛋白質(zhì)表達(dá)后,恢復(fù)氨基酸代謝,抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)糖的有氧酵解(aerobic glycolysis)等可能在很大程度上逆轉(zhuǎn)HPV16感染引起的細(xì)胞代謝異常。
表3 抑制HPV編碼基因表達(dá)與宮頸癌細(xì)胞代謝1H-NMR譜的關(guān)系——OPLS-DA相關(guān)系數(shù)
Warburg效應(yīng)是指絕大多數(shù)腫瘤細(xì)胞為滿足快速增長的能量需求而在有氧條件下進(jìn)行的糖酵解[10]。乳腺癌發(fā)生伴有磷脂代謝異常,雌激素受體陽性和陰性乳腺癌組織之間可能有多種氨基酸表達(dá)差異[11]。早期和晚期結(jié)腸癌組織可能發(fā)生脂代謝模式轉(zhuǎn)換[12]。本課題組前期研究顯示,HPV16感染可能引起宮頸癌組織中α和β-葡萄糖、酪氨酸、苯丙氨酸、乙酸含量顯著下降,而乳酸、異亮氨酸、丙氨酸、甲基脯氨酸和低密度脂蛋白含量顯著上升,涉及糖脂和氨基酸代謝異常,但是E6和E7基因表達(dá)對細(xì)胞內(nèi)代謝的影響尚未見報(bào)道[8]。本研究對HPV16陽性宮頸癌細(xì)胞進(jìn)行RNA干擾,明確抑制E6和E7基因表達(dá),通過代謝組學(xué)研究,發(fā)現(xiàn)13種小分子化合物水平變化,其中α和β-葡萄糖、乙酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸含量顯著上升,而乳酸、丙氨酸、甲酸含量下降,提示HPV感染影響細(xì)胞內(nèi)糖脂和氨基酸代謝,其中E6和E7蛋白質(zhì)可能扮演重要角色。
HPV感染與子宮頸癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[13]。幾乎所有宮頸癌及絕大部分癌前病變(宮頸上皮內(nèi)瘤變)組織檢出高危型HPV16和18,其主要感染形式是病毒與宿主基因組整合[14]。HPV16編碼的E5、E6和E7蛋白可能干擾p53和pRB介導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)或免疫監(jiān)視,是一種較公認(rèn)的HPV致病、致癌及免疫逃逸機(jī)制[15]。據(jù)現(xiàn)有研究,HPV16編碼的E6蛋白可能促進(jìn)細(xì)胞糖酵解,抑制氧化磷酸化,呈典型的Warburg效應(yīng)[16]。頭頸部腫瘤與HPV感染的關(guān)系密切,其組織葡萄糖和核酮糖表達(dá)下降也是較典型的Warburg效應(yīng)[17]。E6和E7表達(dá)激活PI3K/Akt/mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,促進(jìn)能量代謝[18]。本研究中,抑制E6或E7蛋白表達(dá)后,α和β-葡萄糖含量顯著增加,乳酸含量下降,提示宮頸癌細(xì)胞內(nèi)可能存在上述有氧糖酵解過程。腫瘤組織內(nèi)氨基酸含量變化異常可能是雙刃劍,對于其促進(jìn)或抑制腫瘤細(xì)胞增殖存在分歧[19]。腫瘤組織可能極力動(dòng)用體內(nèi)游離氨基酸,彌補(bǔ)迅速增長所需的蛋白質(zhì)合成原料,并以氨基酸分解為代價(jià),解決能量代謝緊張狀態(tài)[20]。由上述分析,可推斷HPV編碼的E6和E7蛋白質(zhì)表達(dá)可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)有氧糖酵解過程,此伴有脂代謝和氨基酸代謝重編程,以維持腫瘤快速生長相關(guān)的蛋白質(zhì)生物合成和能量需求。
現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展2022年12期