◆成都市第四十九中學(xué)高一 張熙喬

經(jīng)常飲用活菌型乳酸菌飲料可改善腸道微生物的組成，提高人體免疫力。但是，體內(nèi)的乳酸菌活菌要積累到一定數(shù)量，才有機(jī)會(huì)到達(dá)并定植于小腸內(nèi)，抑制有害菌生長，保持腸道微生態(tài)平衡。所以，評(píng)價(jià)活菌型乳酸菌飲料的一個(gè)重要指標(biāo)是其活菌的含量。

目前，活菌型乳酸菌飲料都需冷藏保存。雖然大多數(shù)超市的乳酸菌飲料被存放在冰柜中，但有時(shí)為方便促銷，部分乳酸菌飲料被擺放在常溫柜臺(tái)或未密封的小冰柜里。

常溫下，乳酸菌飲料中的乳酸菌還能存活嗎？保質(zhì)期內(nèi)，冷藏保存的乳酸菌飲料中的活菌數(shù)真的達(dá)標(biāo)嗎？外出攜帶的乳酸菌飲料中的活菌數(shù)有什么變化？對(duì)于腸胃敏感的人來說，提前多久將乳酸菌飲料置于常溫下更合適？這些問題都值得深入探討。

一、市場調(diào)研

走訪成都市新都區(qū)的超市，挑選并記錄常溫、冷藏保存的乳酸菌飲料的種類及產(chǎn)品信息。

二、實(shí)驗(yàn)器材

4種活菌型乳酸菌飲料、MRS液體培養(yǎng)基、瓊脂粉、90 mm無菌培養(yǎng)皿、天平、三角瓶、微量移液器、酒精燈、普通光學(xué)顯微鏡、RO純水儀、超凈工作臺(tái)、滅菌鍋、培養(yǎng)箱等。

三、實(shí)驗(yàn)方法

參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.35—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》執(zhí)行，遵循無菌操作程序。

（一）分組

將購買的活菌型乳酸菌飲料分成兩組。第一組包含4種，每種12瓶，分別儲(chǔ)存于4 ℃和常溫環(huán)境中，在保質(zhì)期內(nèi)，每隔5天分別取1瓶檢測(cè)其活菌數(shù)。第二組由2種活菌型乳酸菌飲料組成，每種7瓶，分別考察它們于常溫下放置 2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h后的活菌數(shù)。

（二）制備平板培養(yǎng)基

稱取MRS液體培養(yǎng)基66.2 g，將其加熱溶解于1000 mL蒸餾水中，加入2%瓊脂粉。將配好的培養(yǎng)基用121 ℃高壓滅菌20 min后冷卻至50 ℃左右，在超凈工作臺(tái)內(nèi)制備平板。

圖1 制備平板培養(yǎng)基

（三）樣品稀釋、涂布及培養(yǎng)

1.樣品稀釋

將1 mL乳酸菌飲料制成1∶10的樣品稀釋液，混勻后取0.1 mL上述稀釋液加入0.9 mLRO水中，制成1∶100的稀釋液。按上述操作順序，做成10倍遞增樣品稀釋液。

2.涂布及培養(yǎng)

無菌條件下，取10-8、10-9或10-10稀釋梯度的稀釋液0.05 mL，分別均勻涂布于2個(gè)MRS平板內(nèi)，封口膜密封平板后于37 ℃環(huán)境中倒置培養(yǎng)48 h。

（四）平板計(jì)數(shù)

選取菌落數(shù)在30～300 CFU、無散延菌落生長的平板計(jì)菌落數(shù)。每個(gè)稀釋度的菌落數(shù)記錄為兩個(gè)平板的平均數(shù)。將上述平均值乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)，作為每毫升乳酸菌飲料中含有的活菌數(shù)。

（五）觀察菌落形態(tài)

將培養(yǎng)好的平板取出，肉眼觀察每個(gè)平板上的菌落形態(tài)。

（六）革蘭氏染色及觀察細(xì)胞形態(tài)

1.革蘭氏染色

用接種環(huán)挑取菌落形態(tài)不同的單菌落置于載玻片，均勻涂開后用酒精燈外焰烤干。載玻片上的菌體薄層用草酸銨結(jié)晶紫染色1 min。之后用RO水沖洗，再滴加碘液覆蓋涂面染色1 min后，用RO水沖洗，用干凈的吸水紙吸干多余水分，加入數(shù)滴質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%的酒精，并輕輕搖動(dòng)。脫色20 s后，再用RO水沖洗，用干凈的吸水紙吸去表面水分。最后用蕃紅復(fù)染1 min，RO水沖洗、干燥，用顯微鏡觀察。

2.觀察細(xì)胞形態(tài)

先用普通光學(xué)顯微鏡的低倍鏡找到待觀察物象，并移到視野中央，再切換到高倍鏡和油鏡，觀察菌體細(xì)胞形態(tài)和上述革蘭氏染色結(jié)果。

四、實(shí)驗(yàn)觀察

（一）選取實(shí)驗(yàn)對(duì)象

經(jīng)市場調(diào)研發(fā)現(xiàn)，2022年暑假期間成都市新都區(qū)售賣的乳酸菌飲料主要來自伊利、蒙牛、新希望、養(yǎng)樂多、菊樂等5個(gè)廠家，產(chǎn)品類型主要有10種。挑選其中4種明確標(biāo)識(shí)“活菌型乳酸菌”的產(chǎn)品作為本實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象，如表1。

表1 4種實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象的產(chǎn)品信息

（二）不同儲(chǔ)存溫度對(duì)保質(zhì)期內(nèi)活菌型乳酸飲料中活菌數(shù)的影響

將4種乳酸菌飲料分別儲(chǔ)存在4 ℃和常溫的環(huán)境中，30天內(nèi)其活菌數(shù)的變化如表2所示。

表2 4種乳酸菌飲料中的活菌數(shù)檢測(cè)數(shù)據(jù)

（三）短時(shí)間內(nèi)常溫環(huán)境中乳酸菌飲料中活菌數(shù)的變化

常溫下，上市5 d后的“蒙牛優(yōu)益C”和“養(yǎng)樂多”的活菌數(shù)變化如表3。

表3 常溫環(huán)境中24 h內(nèi)兩種乳酸菌飲料中活菌數(shù)的變化

（四）乳酸菌的菌落及細(xì)胞形態(tài)

如圖2，平板內(nèi)的菌落均為白色、圓形，有的菌落中等偏大，有的偏小，所有菌落表面凸起、濕潤，邊緣整齊。所有菌體細(xì)胞經(jīng)革蘭氏染色處理后呈紫色，表明這些菌體均為革蘭氏陽性菌(G+)。有的菌體細(xì)胞為直徑0.5～2.0 μm的球形（圖3b），有的為長桿或短桿形（圖3c），細(xì)胞均成對(duì)或成鏈排列，無芽胞、不運(yùn)動(dòng)。

圖2 乳酸菌的菌落形態(tài)

圖3 觀察到的乳酸菌菌體細(xì)胞形態(tài)（1000倍）

五、結(jié)果分析與結(jié)論

（一）在保質(zhì)期內(nèi)，冷藏與常溫條件下活菌數(shù)的變化

常溫儲(chǔ)存5～10 d時(shí)，雖然乳酸菌飲料中的活菌數(shù)仍然達(dá)標(biāo)，但還是建議市民購買活菌型乳酸菌飲料時(shí)，一定要從冷藏柜中挑選并盡量選擇生產(chǎn)日期較新的產(chǎn)品。買回家后若不能馬上飲用，一定要冷藏儲(chǔ)存并盡快飲用。

生產(chǎn)企業(yè)和超市應(yīng)始終對(duì)活菌型乳酸菌產(chǎn)品進(jìn)行冷鏈運(yùn)輸，并對(duì)超市銷售人員進(jìn)行培訓(xùn)，以便引導(dǎo)消費(fèi)者正確飲用。

（二）常溫條件下儲(chǔ)存24 h后，活菌數(shù)的變化

活菌型乳酸菌飲料常溫放置超過4 h時(shí)，其中的活菌數(shù)開始顯著下降。因此，建議腸胃敏感者可提前將活菌型乳酸菌飲料置于常溫下，但在常溫下放置的時(shí)間最好不要超過4 h。外出游玩時(shí)，未冷藏的活菌型乳酸菌飲料最好在4 h內(nèi)飲用。

（三）乳酸菌的菌落及細(xì)胞形態(tài)

本實(shí)驗(yàn)分離的乳酸菌均為革蘭氏陽性菌。目前，市面上銷售的乳酸菌飲料中主要含有乳桿菌屬、嗜熱鏈球菌和雙歧桿菌屬三類，本實(shí)驗(yàn)只觀察到了嗜熱鏈球菌和乳桿菌的細(xì)胞形態(tài)，未見雙歧桿菌?？赡苁且?yàn)殡p歧桿菌只能存活于絕對(duì)厭氧條件下，在兼性需氧條件下不生長。而我們的培養(yǎng)條件是兼性厭氧，未達(dá)到絕對(duì)厭氧，因此雙歧桿菌不能生長。

綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可得出結(jié)論：活菌型乳酸菌飲料中的活菌數(shù)與儲(chǔ)存條件比如溫度、時(shí)間密切相關(guān)。

六、創(chuàng)新性與實(shí)用性

首次探究了常溫條件下，活菌型乳酸菌飲料中活菌數(shù)在24 h內(nèi)的變化，為人們科學(xué)飲用活菌型乳酸菌飲料提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。同時(shí)，探索了冷藏和常溫兩種環(huán)境對(duì)活菌型乳酸飲料中活菌數(shù)在保質(zhì)期內(nèi)的變化，為企業(yè)生產(chǎn)活菌型乳酸菌飲料以及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。

實(shí)用性體現(xiàn)在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可引導(dǎo)人們正確選購與飲用活菌型乳酸菌飲料，以保證攝入足夠的活菌，充分發(fā)揮乳酸菌促消化、抑制有害微生物在人體腸道內(nèi)生存等作用。

感謝指導(dǎo)老師為本研究提供的實(shí)驗(yàn)條件和指導(dǎo)！