徐西彬, 朱 青, 張 恩

(北京師范大學認知神經(jīng)科學與學習國家重點實驗室,北京 100875)

獼猴是最常見的非人靈長類實驗動物。獼猴在生理機能、形態(tài)結(jié)構(gòu)和生化代謝等許多方面都與人類高度相似。因此，應用獼猴進行科學實驗研究，對理解人類自身至關重要。尤其是獼猴有發(fā)達的大腦皮層和復雜的認知能力，是腦與認知科學研究領域中理想的實驗模型動物［1］。通常情況下，經(jīng)過一定訓練的獼猴能夠很好地完成實驗所要求的認知任務。將電極植入獼猴腦中可以對其大腦與認知功能進行研究，尤其是在長期記錄或刺激神經(jīng)元活動的研究中該方法已被廣泛應用，具有重要的研究意義。

近年來，本實驗室采用先進的神經(jīng)信號采集和處理技術，多次將微電極陣列植入獼猴大腦皮層，實現(xiàn)了對同一群神經(jīng)元穩(wěn)定且長期的跟蹤，揭示了獼猴在經(jīng)過長期知覺訓練后，神經(jīng)元和神經(jīng)網(wǎng)絡水平的可塑性變化過程及其與感知和行為的關系［2-3］。然而，動物的機體功能狀態(tài)會在電極植入手術后發(fā)生明顯的改變，需要良好的護理工作以提高動物成活率，并促進動物機體快速恢復健康。本文根據(jù)本實驗室在2019—2021 年對獼猴腦皮層手術前后護理的實踐探索經(jīng)驗，擬介紹與獼猴電極植入手術相關的實驗動物護理和福利內(nèi)容，供同行參考與借鑒。

1 實驗動物與研究方法

2019—2021 年，本實驗室對6 只獼猴在電極植入手術前后開展護理工作。所有獼猴均為雄性，體質(zhì)量5～8 kg，年齡4～8歲，均購自北京中科靈瑞生物技術股份有限公司［SCXK（京）2018-0001］。實驗動物在進入本實驗室［SYXK（京）2015-0044、SYXK（京）2021-0003］的動物飼養(yǎng)房之前均進行了嚴格的檢疫工作，B 型皰疹病毒、各種肝炎病毒和結(jié)核桿菌等檢測均為陰性（由蘇州西山生物技術有限公司完成檢測）。實驗動物的使用和處理所涉及的各個環(huán)節(jié)均依據(jù)國家科學技術委員會頒發(fā)的《實驗動物管理條例》執(zhí)行，遵從《實驗動物福利倫理審查指南》［4］及實驗動物相關福利要求［5］，并且通過北京師范大學動物倫理委員會批準［項目批準號為IACUC （BNU） -NKLCNL 2019-6］。

本課題組的相關研究通常需要獼猴在長達1～2個月的實驗過程中，頭部處于固定狀態(tài)時能夠觀察并判斷屏幕上的視覺圖形，從而產(chǎn)生特定的學習效應，以此檢測局部視覺特征差異并揭示其學習的神經(jīng)機制［6］。因此在正式實驗前，需要通過外科手術，在獼猴的顱骨表面安裝一個基座來固定頭部。為了探討這種學習行為背后的神經(jīng)機制，還需要通過手術打開與研究相關腦皮層區(qū)所對應的顱骨區(qū)域，并將電極陣列埋藏于腦皮層的表面。這種電極移植手術可使研究者能夠?qū)υ撈訁^(qū)神經(jīng)元的動作電位和局部場電位信號進行長期追蹤，從而考察這些信號與認知及行為的關系。

2 電極植入腦皮層手術前護理

2.1 術前準備

手術前應完成獼猴的常規(guī)體檢和生化指標檢查，全面了解其各項機能，確保實驗動物和工作人員的安全。由于獼猴對麻醉藥品較敏感，在使用麻醉藥品后可產(chǎn)生嘔吐等不良反應，嚴重時嘔吐物可進入呼吸道導致吸入性肺炎。因此，全身麻醉前應至少禁食12 h，禁水2 h。

2.2 術前用藥

獼猴在手術前12 h 肌內(nèi)注射類固醇地塞米松（0.5 mg/kg），以增強其抗病毒、抗炎性反應、抗過敏反應的能力。手術前30 min 再次給予地塞米松肌內(nèi)注射（0.5 mg/kg），肌內(nèi)注射阿托品（0.05 mg/kg）和靜脈注射安定（0.2 mg/kg），使動物鎮(zhèn)靜、肌肉松弛，并且抑制呼吸道的黏液分泌，減少唾液分泌，防止嘔吐。20 min后再使用鹽酸氯胺酮（80 mg/kg體質(zhì)量，肌內(nèi)注射）對獼猴進行基礎麻醉。氣管插管后轉(zhuǎn)移到手術室，接醫(yī)用呼吸麻醉機，用異氟烷（isoflurane，1.0%～2.5%）進行深度麻醉。恒溫熱水毯置于獼猴周圍以保持體溫。

2.3 頭顱固定及備皮

待獼猴進入穩(wěn)定麻醉階段后，借助動物立體定位儀來固定獼猴頭顱。獼猴采取俯臥式，耳棒插入外耳孔，牙托固定下牙槽，同時為了使氣道保持通暢，獼猴頭顱應稍微背伸。另外為減少手術感染，應用推毛剪剃光獼猴頭顱上的毛發(fā)，并用肥皂水刷洗，擦干后，用2%碘伏和75%乙醇溶液各擦洗消毒兩次。為了更好地保證手術區(qū)的無菌狀態(tài)，需要對手術部位為中心、周圍8～10 cm的區(qū)域做備皮消毒處理。

3 電極植入腦皮層術中護理

3.1 生理指標的監(jiān)護

獼猴被轉(zhuǎn)移到手術室后，首先進行氣管插管并建立靜脈輸液通道，連接麻醉呼吸機（購自北京航天長峰股份有限公司，型號ACM608）。整個手術過程中，通過氣管插管輸入含有1.0%～2.5%異氟烷的醫(yī)用氧氣以維持麻醉狀態(tài)，并用生理監(jiān)護儀（購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，型號PM-9000）密切觀測獼猴的各項生理指標，包括心率、心電圖、血壓、血氧濃度、二氧化碳分壓和肛溫。若術中出現(xiàn)個別指標波動較大的情況，則適時做出相應的調(diào)整。誘導麻醉時，異氟烷體積分數(shù)可升高為2.0%～2.5%，以便獼猴快速進入麻醉狀態(tài)，減少痛苦；誘導麻醉時間一般為10～30 min，此后維持麻醉的異氟烷體積分數(shù)為1.0%～1.5%。

麻醉所需異氟烷體積分數(shù)可根據(jù)動物的年齡、體質(zhì)量、強健程度和所要進行的手術來確定。例如檢測到麻醉程度不足（心率約在100以上），而此時異氟烷體積分數(shù)在1%時，可適當增加其體積分數(shù)1.2%～1.5%，以減弱獼猴感覺上可能存在的不適或痛苦。

另外，麻醉手術會使動物產(chǎn)熱減少，體溫丟失，嚴重時可能導致動物術后無法恢復而死亡。因此在手術過程中，可使用恒溫水循環(huán)裝備（購自北京恒江儀器有限公司，型號YP-472）將加熱墊置于獼猴周圍以保持適當?shù)捏w溫，一般設定溫度為40 ℃。循環(huán)水泵將加熱的水均勻分布到加熱毯上，這樣可以減少手術風險，并使獼猴在手術后更快地復蘇。麻醉手術過程中，動物的潮氣量為50～60 mL；在皮膚縫合后，停止輸送麻醉氣體，潮氣量變?yōu)?0 mL?？梢酝ㄟ^減少輸送氧氣的速度（氧流量從0.5 減至0.3）來達到增加CO2濃度、刺激呼吸的目的。

3.2 腦皮層植入手術

手術中使用Utah Array植入式微電極陣列（購自北京科圣科技有限公司，Blackrock Microsystem 型號6252）進行長期的電生理記錄。電極陣列由陣列和基座組成，其中陣列部分的電極間距為400 μm，每個陣列通常有96 或128 根電極；基座部分用于將電極記錄到的信號引出并連接至記錄儀器，下有8 個螺絲孔用于固定在顱骨上，基座與電極陣列間由柔性連接線相連。植入時，在獼猴大腦視皮層計劃植入電極處切開一個尺寸約1.5 cm×1.5 cm 的骨窗，并剪開硬腦膜，用配套的氣動植入裝置（購自北京科圣科技有限公司，Blackrock Microsystem）把電極植入皮層后，將硬腦膜縫合，蓋回取下的骨片并使用鈦網(wǎng)固定。電極基座使用鈦合金骨釘固定在植入處旁邊的顱骨上?？p合肌肉和皮膚，并使基座頂部暴露在外。由于獼猴手指較細，指甲通常較長，為了避免獼猴抓撓縫合線造成感染，一般需要用薇喬抗菌縫合線（美國強生Ethicon公司產(chǎn)品，型號4-0）采用皮下間斷縫合的方法進行皮膚縫合，縫合后使用金霉素軟膏涂抹切口。

在獼猴蘇醒前，將其從立體定位儀上取下。并在它可以開始自主呼吸后，將氣管插管去除，同時移去血氧飽和度監(jiān)控器、心電圖儀探頭等監(jiān)控設備。

4 電極植入腦皮層術后護理

4.1 蘇醒環(huán)境

手術后應悉心護理和監(jiān)護獼猴。獼猴蘇醒期，取側(cè)臥位，切口一側(cè)朝上，放在寬敞的籠子里。低體溫的獼猴放在加熱毯上，保持干爽、溫暖，并給予足夠的墊料，避免碰撞，防止獼猴在麻醉未清醒期受傷。準備高強度的照明設備，以便隨時觀察體溫、呼吸、動物精神狀態(tài)和術部情況等，看護30 min～2 h。四肢不便行動的動物定時翻身，交替左右側(cè)臥，等動物完全清醒后再放回猴籠。在獼猴放回猴籠后的24 h 內(nèi)，每隔2～3 h 持續(xù)觀察其狀態(tài)。術后2～4 h 如果獼猴能站立起來，精神活潑，意識清醒，說明電極植入后顱內(nèi)正常。如果術后4～6 h 長時間不能清醒或者獼猴精神意識狀態(tài)惡化，提示可能顱內(nèi)因手術有繼發(fā)出血，考慮再次手術清理出血塊并處理出血點。

4.2 動物護理

術后的獼猴需要單籠喂養(yǎng)。在術后的一周內(nèi)，每天給獼猴注射兩次頭孢曲松鈉（1.0 g/次）來預防切口的感染，使用鹽酸曲馬多（2 mL：100 mg）來為獼猴鎮(zhèn)痛，肌內(nèi)注射一次30 mg，連續(xù)注射3 d。因為獼猴自身不能合成維生素C，為了促進手術切口的愈合，可以肌內(nèi)注射維生素C 注射液（2 mL：0.5 g），每日0.1～0.3 g，每天1～2次。另外為了減小感染風險，還需要在術后1 周左右持續(xù)每天對電極連接器周圍的組織進行清創(chuàng)：首先將清創(chuàng)的手術器械、紗布等用高壓蒸汽滅菌鍋消毒滅菌，并提前半小時打開手術室紫外燈進行環(huán)境消毒；然后更換一次性無菌手套，用碘伏擦拭消毒清理獼猴頭部，用滅菌的手術刮勺仔細清理創(chuàng)口增生的息肉；最后用生理鹽水和紗布保持創(chuàng)口清潔，達到實驗的標準。

由于電極植入手術是異氟烷全身麻醉，麻醉時間長達68 h，術后易出現(xiàn)感染、體溫降低、休克、嘔吐和窒息等危險情況，一旦發(fā)現(xiàn)獼猴有胃內(nèi)返流物流出口腔，應立即清理清除。此外需要保持飼養(yǎng)環(huán)境溫度在18～22 ℃，必要時使用電暖器進行取暖。此外，2～3 d定期更換清潔干燥的墊料。

全麻和手術導致的損傷通常會讓獼猴食欲降低。在手術后的4～6 h 內(nèi)，由于吞咽肌功能還未能完全恢復，容易因為誤吸導致死亡，因此不宜喂食喂水。這種情況下，需要細心觀察獼猴的精神狀態(tài)，選用少量柔軟易消化的食物如香蕉、紅薯等進行飼喂，一般根據(jù)動物年齡和恢復狀況于手術完成12 h 后飼喂正常飼料。

4.3 實驗操作

腦皮層植入手術30 d 后，獼猴身體基本恢復，即可以進行清醒猴實驗。在整個清醒猴實驗過程中，獼猴需要坐在特制的猴椅里。猴椅上裝有讓獼猴進行行為報告的拉桿裝置，而視覺刺激是通過放在猴椅正前方的顯示器向獼猴呈現(xiàn)。此外，實驗系統(tǒng)還配套有眼動跟蹤系統(tǒng)和飲水獎勵裝置。實驗過程中，獼猴可以通過拉桿和眼動對它所看到的視覺刺激進行報告，正確的報告將會使實驗獼猴得到一定量的水或果汁作為獎勵。

5 護理要點總結(jié)及討論

6只獼猴的電極植入腦皮層手術均較成功，單次手術時間一般長約6～8 h。手術操作順利，未出現(xiàn)感染和其他并發(fā)癥。術后6～8 h 獼猴即可進食，狀態(tài)和機能恢復正常。因此，在手術前，需要充分準備好與動物手術和護理相關的儀器和耗材，且考慮到每一步細節(jié)和可能發(fā)生的意外。在手術過程中，需要關注手術對動物可能產(chǎn)生的傷害和痛苦，并盡可能地通過各種方式來降低或消除這些傷害和痛苦。

5.1 術前準備和麻醉選擇

動物在麻醉前12 h 進行禁食，有助于防止反胃和胃內(nèi)容物流入氣管對獼猴造成傷害。良好的麻醉前準備可以減少并發(fā)癥，減輕動物疼痛，縮短麻醉誘導時間，有利于實驗的順利進行。采用氯胺酮作為誘導麻醉，肌內(nèi)注射10 mg/kg 體質(zhì)量，必要時可以追加1～2次。腦皮層植入手術時間較長，選擇異氟烷氣體吸入麻醉可使動物較快進入麻醉，且容易控制麻醉深度，安全性好，動物麻醉意外的發(fā)生率和死亡率低，手術成功率高，但需要購置呼吸麻醉機。

充分的麻醉準備不僅有利于獲得良好的麻醉效果，更能充分體現(xiàn)3R原則，體現(xiàn)人道主義精神，從而更好地保證動物福利，確保動物實驗結(jié)果的可靠性、可重復性和可信性［7］。

5.2 腦皮層手術中情況處理

腦皮層手術根據(jù)麻醉過程中全身麻醉深度來進行相關操作。麻醉深度主要通過呼吸頻率、心率、瞳孔、肌肉緊張度和二氧化碳含量等變化來判斷。氣管插管后接醫(yī)用呼吸麻醉機，用異氟烷進行麻醉，10～20 min 后觀察麻醉深度。進入淺外科期時心率降低，對非疼痛刺激無肢體動作反應，以胸式呼吸為主，眼瞼和角膜反射存在，此時可以固定獼猴頭顱并備皮。麻醉深度進入深外科期后，心率和二氧化碳參數(shù)均有所下降，呼吸方式漸以腹式呼吸為主，瞳孔縮小，疼痛刺激不會引起有害的自主神經(jīng)反射，開顱和腦皮層植入手術等操作應在這一時期進行。腦皮層手術應避免麻醉藥物過量進入過深期，若出現(xiàn)此種狀況應立即停止手術，并使用腎上腺素等急救藥品進行搶救。

獼猴的頭皮松弛容易移動，可在開顱前用記號筆標記切口線。頭部毛發(fā)在手術前剃盡，獼猴的頭皮較薄，缺乏皮下組織支持［8］。皮膚切開后止血以無菌紗布壓迫止血為主，頭皮出血盡量少用止血電凝，以免皺縮而影響切口愈合。顱骨出血時涂抹骨蠟止血，開顱后操作應盡量仔細、輕柔，減少損傷和出血，視皮層小靜脈出血后用雙極電凝止血。硬腦膜應盡量縫合，然后再縫合頭皮，防止腦脊液滲漏。

5.3 術后感染防護

術后的感染可能與多種因素有關。實驗動物手術后恢復情況除了與術中操作、清創(chuàng)、動物抵抗力有關外，也與術后的護理有關，有時護理不良甚至可以導致術后感染。術前護理是基礎，術后護理是保障，做好護理能夠有效降低動物手術死亡率，提高手術動物生活質(zhì)量和手術成功率，避免不必要的重復手術和實驗，可以將實驗動物的使用量降到最低［9］，同時減輕對動物造成的疼痛和傷害，盡最大限度使用較少量動物獲取實驗所需數(shù)據(jù)，保障動物福利，保證后續(xù)科研實驗結(jié)果的準確性，促進認知神經(jīng)科學研究的良性發(fā)展［10］。

綜上，在進行獼猴腦皮層手術的前、中、后期加強實驗動物護理和福利很重要。其中，手術前應進行細致和耐心的準備和檢查；手術過程中進行嚴密的手術操作和手術監(jiān)護，盡量將皮層植入手術中發(fā)生風險的可能性降到最低，保證植入手術的成功率；手術后進行密切監(jiān)測和精心護理，緩解動物疼痛并加強動物營養(yǎng)，保證動物健康生存及福利。實踐證明這些護理工作有助于保障獼猴術前的正常訓練、手術的順利進行，以及術后的機能恢復，是整個實驗研究中不可或缺的部分。