付金鳳，姚紅柳，李美霖，尹廣婷，趙彬旭，崔晉瑋，蘇麗紅

(1.長春師范大學(xué)，吉林 長春130032；2.中國醫(yī)科大學(xué)，遼寧 沈陽 110122)

彈性蛋白酶(PPE)是一種蛋白水解酶，可以水解彈性蛋白、血漿蛋白等，是肺部重要組成部分[1]，還可以誘導(dǎo)上皮細(xì)胞釋放炎癥因子，與肺組織損傷關(guān)系密切，其過度表達(dá)會引發(fā)急性肺損傷、呼吸窘迫綜合征等炎癥性疾病[2]。彈性蛋白酶已成為抗炎藥物篩選的較佳酶靶[3]。

牛蒡子苷元(Arc)是一種苯丙素二苯基丁內(nèi)酯木脂素[4]，結(jié)構(gòu)如圖1，具有抗炎[5]、抗病毒等藥理作用[6]。SHI等[7]發(fā)現(xiàn)牛蒡子苷元可減輕由脂多糖(LPS)引起的急性肺損傷；ZHANG等[8]發(fā)現(xiàn)牛蒡子苷元(50 mg/kg)可顯著抑制LPS引起的肺組織炎癥反應(yīng)。對比幾種天然二苯基丁內(nèi)酯類木脂素對彈性蛋白酶的抑制作用[9]，選取活性最好的牛蒡子苷元進(jìn)一步研究。

圖1 牛蒡子苷元結(jié)構(gòu)

為新型彈性蛋白酶抑制劑的研究提供參考，本文以牛蒡子苷元作為研究對象，通過酶靶活性篩選模型，運用酶促反應(yīng)動力學(xué)研究牛蒡子苷元對彈性蛋白酶的抑制作用，包括半數(shù)抑制濃度(IC50)、抑制常數(shù)(Ki)以及抑制類型；通過紫外-可見吸收光譜、圓二色光譜、紅外光譜研究了Arc對PPE構(gòu)象的影響；通過分子對接模擬Arc與PPE的相互作用，分析了其作用力類型以及作用位點。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

牛蒡子苷元；Tris-HCl緩沖液；彈性蛋白酶(PPE,EC3.4.21.36)(Sigma公司)；N-Suc-Ala-Ala-Ala-pNA(Sigma公司)。

多功能讀板機(jī) FlexStation3(MolecularDevices公司)；96孔聚苯乙烯透明平底微孔板(COSTAR公司)；Cary 300紫外可見分光光度計(美國Agilent Technologies公司)；MOS-500圓二色譜儀(法國Biologic)；Nicolet IS50傅里葉變換紅外光譜儀(美國Thermo)。

1.2 實驗步驟

1.2.1 IC50值測定

彈性蛋白酶、底物、抑制劑均用Tris-HCl緩沖液配制。測定時在96孔板反應(yīng)，每孔中加入1 mmol/L的底物30 μL，1 μmol/L的彈性蛋白酶溶液30 μL，2 mmol/L的牛蒡子苷元溶液分別加0、20、40、50、60、80、100、120、140 μL，用緩沖液補(bǔ)充總體積為200 μL，以緩沖溶液為空白，用酶標(biāo)儀于波長405 nm計時測定303 K溫度下反應(yīng)的吸收值，并計算其抑制率。做三次平行實驗。

1.2.2 抑制常數(shù)Ki

測定時在96孔板反應(yīng)，每孔中加入1 μmol/L的彈性蛋白酶溶液30 μL，與0、50、100、140 μL的2 mmol/L牛蒡子苷元溶液，以及濃度分別為0.10、0.25、0.50、0.80、1.00 mmol/L的30 μL底物反應(yīng)，用緩沖液補(bǔ)充總體積為200 μL，以緩沖溶液為空白，用酶標(biāo)儀于波長405 nm計時測定303 K溫度下的酶解反應(yīng)速率。重復(fù)三次平行實驗。

1.2.3 紫外-可見吸收光譜

分別配制5×10-6mol/L PPE、2×10-5mol/L Arc、5×10-6～2×10-5mol/L Arc-PPE溶液，搖勻，室溫下靜置5 min。選1 cm吸收池，量取3 mL待測液體，用Tris-HCl緩沖溶液作空白參比，掃描并記錄200～500 nm范圍的紫外可見吸收光譜。

1.2.4 圓二色光譜

用PBS分別配置5×10-6mol/L的PPE、5×10-6～1×10-5mol/L的Arc-PPE溶液待測。選用1 mm的石英吸收池，移取300 μL待測液體掃描波長范圍設(shè)置為190～250 nm，狹縫寬度設(shè)置為2 nm，時間為1 s，以PBS緩沖溶液為背景，做三組平行實驗。

1.2.5 紅外光譜

采用壓片法，掃描PPE、Arc-PPE在400～4 000 cm-1波數(shù)范圍的紅外光譜。

1.2.6 分子對接模擬

通過Schrodinger軟件中的“Protein Preparation Wizard”程序?qū)Φ鞍走M(jìn)行加氫以及對蛋白晶體結(jié)構(gòu)中非完整氨基酸殘基進(jìn)行矯正，同時在Chem Bio 3D Ultra 14.0軟件中對PPE及Arc三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行能量最優(yōu)化。最后使用Auto Dock 4.2.6軟件進(jìn)行分子對接。

2 結(jié)果與討論

2.1 半數(shù)抑制濃度IC50值

半數(shù)抑制濃度(IC50)可以體現(xiàn)牛蒡子苷元對彈性蛋白酶的抑制作用，IC50即當(dāng)對彈性蛋白酶的抑制率為50%時牛蒡苷元的濃度。以牛蒡子苷元的濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)，繪制曲線，結(jié)果見圖2。抑制率隨著牛蒡子苷元濃度的增加而增加，趨勢先陡后趨于平緩，抑制率達(dá)到50%時牛蒡子苷元濃度為1.25 mmol/L，即IC50=1.25 mmol/L。

圖2 牛蒡苷元對彈性蛋白酶的百分抑制率

2.2 抑制常數(shù)Ki

圖3 Lineweaver-Burk曲線圖

計算得抑制常數(shù)Ki= 6.19×10-4mol/L。

2.3 紫外-可見吸收光譜分析

PPE的紫外吸收光譜中280 nm附近的吸收峰是由Tyr殘基中共軛雙鍵及Trp殘基的吲哚環(huán)所貢獻(xiàn)，但由于Trp的紫外吸收遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于Tyr，所以主要是Trp的貢獻(xiàn)[12]。圖4為PPE、Arc、Arc-PPE的紫外吸收光譜，且APPE+AArc≠AArc-PPE。PPE在280 nm附近出現(xiàn)的吸收峰在加入Arc后發(fā)生紅移，表明Arc與彈性蛋白酶結(jié)合改變了構(gòu)象。

(a)PPE；(b)Arc；(c)Arc-PPE圖4 PPE、Arc、Arc-PPE的紫外吸收光譜圖

2.4 圓二色光譜分析

圓二色光譜在遠(yuǎn)紫外區(qū)(185～245 nm)的特征峰可以判定蛋白質(zhì)多肽主鏈構(gòu)象變化，研究生色團(tuán)的微環(huán)境[13]。圖5分別表示PPE、PPE-Arc的圓二色光譜圖，從圖中可以看出，牛蒡子苷元加入使208 nm、200 nm附近的負(fù)帶增加，說明α-螺旋結(jié)構(gòu)所占比例增加，通過圓二色光譜儀所帶計算軟件Dicroport計算，彈性蛋白酶中α-螺旋結(jié)構(gòu)由6.909%增加至7.864%。牛蒡子苷元的加入使彈性蛋白酶的二級構(gòu)象發(fā)生了變化。

(a)PPE；(b)Arc-PPE圖5 PPE、Arc-PPE圓二色光譜

2.5 傅里葉變換紅外光譜分析

(a)PPE；(b)Arc-PPE圖6 PPE和Arc-PPE的紅外光譜

2.6 分子對接模擬

分子對接模擬結(jié)果如圖7所示，軟件計算最佳結(jié)合能為-30.932 kJ/mol。牛蒡子苷元具有二芐基丁內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，其中五元內(nèi)酯的羰基氧與彈性蛋白酶中纈氨酸(VAL99)產(chǎn)生了氫鍵作用力；苯環(huán)上甲氧基與蘇氨酸(THR175)產(chǎn)生了氫鍵作用力，苯環(huán)與精氨酸(ARG217A)產(chǎn)生了π-陽離子作用，并且與亮氨酸(LEU218)、賴氨酸(LYS224)、絲氨酸(SER217)、纈氨酸(VAL216)(VAL99)、精氨酸(ARG217A)、苯丙氨酸(PHE215)、組氨酸(HIS57)、色氨酸(TRP1729)、天冬氨酸(ASP97)有范德華作用；與蘇氨酸(THR175)(THR96)、丙氨酸(ALA99)有靜電作用；與精氨酸(ARG217A)、蘇氨酸(THR175A)、纈氨酸(VAL99)、色氨酸(TRP172)有疏水作用。牛蒡子苷元的二芐基丁內(nèi)酯結(jié)構(gòu)可以與彈性蛋白酶以π-陽離子作用、氫鍵作用、范德華作用、疏水作用以及靜電作用緊密結(jié)合。

圖7 Arc-PPE分子對接模擬

3 結(jié)論

以上研究表明，牛蒡子苷元對彈性蛋白酶有抑制作用，其抑制類型為競爭性抑制，半數(shù)抑制濃度IC50= 1.25 mmol/L，抑制常數(shù)Ki= 6.19×10-4mol/L，與目前臨床上使用的彈性蛋白酶抑制劑——西維來司鈉(Ki=2×10-4mol/L)的Ki在同一個數(shù)量級。紅外光譜、紫外光譜均表明，牛蒡子苷元與彈性蛋白酶產(chǎn)生了相互作用，并改變了彈性蛋白酶二級結(jié)構(gòu)。圓二色光譜表明牛蒡子苷元使彈性蛋白酶中α-螺旋所占比例增加，無規(guī)則卷曲所占比例增加。結(jié)合分子對接結(jié)果，牛蒡子苷元與彈性蛋白酶作用存在π-陽離子、氫鍵作用、范德華作用、疏水作用以及靜電作用等多種作用力，兩者可以較好地結(jié)合，干擾了彈性蛋白酶對底物的分解，從而降低酶的活性。二苯基丁內(nèi)酯結(jié)構(gòu)中五元內(nèi)酯的羰基氧結(jié)構(gòu)、苯環(huán)及甲氧基結(jié)構(gòu)均是很好的作用位點。以上研究可以為新的彈性蛋白酶抑制劑的設(shè)計、合成提供新的思路。