劉洋，寧方瑞，周志峰

（大連理工大學(xué) 化工學(xué)院，遼寧大連 116024）

腫瘤對(duì)人類的生命健康存在著嚴(yán)重威脅，因此關(guān)于腫瘤治療的相關(guān)研究有著重要的現(xiàn)實(shí)意義。治療腫瘤的關(guān)鍵在于早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療。近年來，隨著研究人員對(duì)腫瘤認(rèn)識(shí)程度的不斷提升，許多癌癥標(biāo)志物被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，其可作為腫瘤診斷的受體[1]。熒光成像（Fluorescence Line Imager，F(xiàn)LI）具有靶向性強(qiáng)、靈敏度高、無輻射、速度快等特點(diǎn)，在腫瘤的早期檢測中具有細(xì)胞成像、靶向識(shí)別與探測的功能，其核心為熒光探針技術(shù)[2]。熒光探針是基于光譜化學(xué)與量測技術(shù)將分析對(duì)象的一些化學(xué)信息通過熒光信號(hào)的方式進(jìn)行表達(dá)的傳感裝置[3]，其通常包括識(shí)別、發(fā)光（報(bào)告）和連接基團(tuán)[4]。識(shí)別基團(tuán)可以與受體特異性識(shí)別，發(fā)光基團(tuán)將所識(shí)別的化學(xué)信息用熒光信號(hào)表達(dá)，而連接基團(tuán)則起到紐帶作用[5]。該技術(shù)用于腫瘤檢測是將熒光探針與腫瘤標(biāo)志物受體進(jìn)行靶向識(shí)別、結(jié)合，發(fā)光基團(tuán)被激活發(fā)出高亮熒光從而達(dá)到檢測目的。熒光探針傳感裝置圖見圖1。

圖1 熒光探針傳感裝置圖[6]

1 葉酸受體熒光探針靶向識(shí)別腫瘤細(xì)胞

1.1 葉酸在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)特點(diǎn)

葉酸是生物體內(nèi)一種水溶性維生素，是人體所必需的物質(zhì)，在人體中主要依靠葉酸受體進(jìn)行運(yùn)輸。二者具有較高的親和力，在細(xì)胞膜外特異性結(jié)合，依靠胞吞方式進(jìn)入細(xì)胞[7]。葉酸受體是細(xì)胞的一種膜內(nèi)蛋白，人體正常組織中含量有限，極少表達(dá)，但在腫瘤細(xì)胞中會(huì)呈現(xiàn)高水平表達(dá)[8]。根據(jù)葉酸受體的特點(diǎn)，可將葉酸與熒光分子通過生物化學(xué)方法連接成具有較高穩(wěn)定性和生物相容性的探針，輸送到腫瘤部位被葉酸受體特異性識(shí)別、吸收，采用光學(xué)成像方法產(chǎn)生熒光標(biāo)記，從而精確檢測腫瘤細(xì)胞[9]。

1.2 量子點(diǎn)熒光探針

量子點(diǎn)（Quantum Dots，DQ）是納米級(jí)分子和原子的集合體，可在激發(fā)光下呈現(xiàn)不同顏色，其熒光強(qiáng)度較普通熒光染料高，可長時(shí)間保存。CdTe/CdS量子點(diǎn)熒光探針[10]是通過水相法獲得CdTe/CdS量子點(diǎn)，再將其與葉酸進(jìn)行偶聯(lián)制得。探針與腫瘤細(xì)胞的葉酸受體靶向識(shí)別后，經(jīng)過一周的放置，仍可觀察到熒光，具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性。但該探針對(duì)細(xì)胞有毒性，在應(yīng)用中受到限制。CdSe納米探針[11]是將阿霉素和葉酸憑借CdSe納米片進(jìn)行連接，在細(xì)胞外部，熒光和毒性被淬滅，當(dāng)其與腫瘤細(xì)胞葉酸受體識(shí)別后進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，二硫鍵的斷裂使得探針被活化，阿霉素毒性釋放，同時(shí)發(fā)出熒光。該探針只在腫瘤細(xì)胞內(nèi)部活化，很大程度上避免了對(duì)正常細(xì)胞的毒性影響。

1.3 碳點(diǎn)熒光探針

碳點(diǎn)（Carbon Dots，CDs）[12]是一種新型納米熒光材料，具有耐漂白性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、生物相容性高等特點(diǎn)，可應(yīng)用于生物細(xì)胞成像分析。FA-AA-CDs探針是以烏頭酸（AA）為原料，通過反應(yīng)合成藍(lán)色熒光碳點(diǎn)（AA-CDs），再與葉酸共軛連接所得。葉酸與熒光碳點(diǎn)連接后，熒光淬滅。當(dāng)腫瘤細(xì)胞上過量表達(dá)的葉酸受體與探針靶向識(shí)別后，F(xiàn)A-AA-CDs進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，與此同時(shí)，葉酸與熒光碳點(diǎn)裂解，藍(lán)色熒光恢復(fù)。FA-PEI-CDs[13-14]探針通過一步水熱合成法生成CDs，并將PEI作為連接橋梁與葉酸耦合所得。同樣，該碳點(diǎn)在耦合葉酸后，熒光淬滅，在細(xì)胞內(nèi)解離后熒光恢復(fù)。該類型探針具有無毒、生物相容性高等特點(diǎn)。

1.4 二氧化硅納米粒子熒光探針

二氧化硅納米粒子具有較大的表面積，單個(gè)顆?？蓴y帶眾多熒光分子。葉酸功能化的熒光二氧化硅探針（RSiNPs-Folate）[14]先采用 St?ber法生成納米熒光SiO2作為發(fā)光基團(tuán)，再將疊氮基團(tuán)通過水解反應(yīng)引入，最后與炔丙基葉酸連接構(gòu)成完整熒光探針。RSiNPs-Folate對(duì)人體宮頸癌細(xì)胞（HeLa）有較好的選擇性，當(dāng)RSiNPs-Folate與HeLa接觸后，腫瘤細(xì)胞表面的葉酸受體將特異性識(shí)別探針，并通過介導(dǎo)途徑成功進(jìn)入細(xì)胞，在光學(xué)儀器下觀察到610 nm處呈現(xiàn)明亮的紅色。該探針反應(yīng)條件溫和，合成中沒有使用表面活性劑及有毒試劑，不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成毒性影響，在生物檢測方面有明顯優(yōu)勢。

1.5 金納米簇?zé)晒馓结?/h3>

金納米簇是貴金屬納米團(tuán)簇的一個(gè)重要分支，具有低毒性、較強(qiáng)的生物相容性和超快速激光響應(yīng)的特點(diǎn)[15]。以牛血清白蛋白為底物，將+3價(jià)金離子還原為+1價(jià)金離子，再經(jīng)過巰基處理生成金納米簇（BSA-AuNCs）[16]，其在光學(xué)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出強(qiáng)烈熒光。金納米粒子探針（AuNCs-FA）是由BSA-AuNCs經(jīng)過葉酸對(duì)其表面修飾而成，MTT法表明，該探針具有較低的毒性。通過靜脈注射的方式，將其用于活體小鼠實(shí)驗(yàn)中，正常細(xì)胞無現(xiàn)象，腫瘤部位發(fā)出強(qiáng)烈熒光，光學(xué)信號(hào)的強(qiáng)度與腫瘤大小成正比，且熒光可維持5周時(shí)間[17]。

2 β-半乳糖苷酶受體熒光探針靶向識(shí)別腫瘤細(xì)胞

β-半乳糖苷酶（β-Gal）作為生物體內(nèi)一種必不可少的水解酶，可以將β-半乳糖中的糖苷鍵斷裂水解為單糖，對(duì)人體的生命活動(dòng)有著重要的作用，其廣泛存在于人體細(xì)胞[18]。腫瘤細(xì)胞中β-Gal含量明顯升高，具有較高活性的β-Gal可以解離大分子蛋白從而破壞細(xì)胞屏障，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。由于β-Gal在腫瘤細(xì)胞中的異常現(xiàn)象，可將其作為腫瘤檢測標(biāo)志物，進(jìn)行前期診斷。針對(duì)于β-Gal的檢測，如今已開發(fā)了多種熒光探針，大體可分為比率型熒光探針、雙光子型熒光探針和增強(qiáng)型熒光探針。

2.1 比率型熒光探針

比率型熒光探針的原理是根據(jù)比較不同波長所表現(xiàn)的熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測，其檢測精度高、穩(wěn)定性好，適宜生物檢測。DCDHF-βgal[19]是一種比率型熒光探針，通過與肝細(xì)胞表面半乳糖受體進(jìn)行特異性識(shí)別，經(jīng)胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞。對(duì)DCDHF-βgal進(jìn)行單獨(dú)光學(xué)檢測時(shí)，發(fā)現(xiàn)其在615 nm附近信號(hào)最強(qiáng)，但當(dāng)其進(jìn)入靶向識(shí)別肝細(xì)胞后在615 nm處信號(hào)微弱，而在665 nm處出現(xiàn)最強(qiáng)熒光信號(hào)，且通過對(duì)照實(shí)驗(yàn)表明腫瘤肝細(xì)胞中熒光信號(hào)顯著高于正常肝細(xì)胞。因此，可通過熒光信號(hào)的強(qiáng)弱進(jìn)行腫瘤細(xì)胞的檢測。

BODIPY-βgal[20]探針取代了傳統(tǒng)的光子電子轉(zhuǎn)移模式，其采用分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移的響應(yīng)機(jī)制來實(shí)現(xiàn)比率傳感。BODIPY-βgal進(jìn)行單獨(dú)光學(xué)檢測時(shí)，峰值出現(xiàn)在575 nm處，當(dāng)和腫瘤細(xì)胞的β-Gal反應(yīng)后變成苯酚酸酯的形式，在575 nm處熒光微弱，而在730 nm處有強(qiáng)信號(hào)。DCM-βgal[21]探針也是根據(jù)分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移的響應(yīng)機(jī)制來設(shè)計(jì)，其在440 nm附近有較寬吸收帶，而與β-Gal靶向識(shí)別后，溶液顏色由淡黃色變?yōu)槊倒寮t，在440 nm處峰強(qiáng)度顯著降低，535 nm附近出現(xiàn)強(qiáng)的吸收峰。此外，與β-Gal識(shí)別的DCM-βgal在685 nm處的吸收峰較純探針增強(qiáng)了34倍，685 nm與500 nm處的吸收峰強(qiáng)度也增強(qiáng)了14倍。如今，該探針已成功應(yīng)用于活體細(xì)胞β-Gal活性的定量追蹤。

2.2 雙光子型熒光探針

雙光子型熒光探針具有兩個(gè)激發(fā)源光子，與單光子相比，有強(qiáng)大的穿透性，消除了明顯的光致毒作用，使得光漂白性降低，能維持更長的觀測時(shí)間，更適用于生物細(xì)胞檢測。G-GAL[22]熒光探針以綠色熒光蛋白（GFP）作為原料構(gòu)建GCTPOC發(fā)光基團(tuán)，再經(jīng)去半乳糖基團(tuán)處理后組成G-GAL探針。G-GAL與腫瘤細(xì)胞β-Gal靶向識(shí)別，釋放GCTPOC的羥基，促進(jìn)了細(xì)胞中推拉電子效應(yīng)，使得510 nm處熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。溶液顏色變化在純探針光譜檢測中由無色變?yōu)辄S色，而與腫瘤細(xì)胞β-Gal靶向識(shí)別后溶液顏色由無色變?yōu)榱脸壬?，區(qū)分效果更加明顯。

AHGa[23]探針是以含萘二甲酰亞胺為發(fā)光基團(tuán)，乙?；肴樘菫樽R(shí)別基團(tuán)并由L-組氨酸甲酯連接而成。該探針對(duì)正常細(xì)胞沒有熒光信號(hào)顯示，而在衰老的腫瘤細(xì)胞中，在750 nm激發(fā)下有強(qiáng)烈的熒光發(fā)射。該現(xiàn)象表明，雙光子探針AHGa可用于衰老細(xì)胞的檢測。

2.3 增強(qiáng)型熒光探針

增強(qiáng)型熒光探針包含熒光物質(zhì)及β-半乳糖基團(tuán)，當(dāng)探針與酶接觸后，會(huì)立即發(fā)生反應(yīng)，探針中β-半乳糖基團(tuán)的糖苷鍵被水解，熒光物質(zhì)將被釋放，發(fā)出信號(hào)。其中Gal-Pro[24]是將花青熒光團(tuán)作為發(fā)光基團(tuán)，憑借糖苷鍵與半乳糖殘基結(jié)合。該探針與β-Gal接觸后，會(huì)發(fā)生裂解反應(yīng)，解離成穩(wěn)定的離子，使得溶液呈現(xiàn)青色。該探針在檢測腫瘤衰老細(xì)胞中有明顯效果。FILHO等[25]將苯乙烯基-苯并噻唑作為發(fā)光基團(tuán)與半乳糖連接，得到的探針可以適應(yīng)較大劑量篩選，在活體細(xì)胞中有較好呈現(xiàn)。

3 E-選擇素受體熒光探針靶向識(shí)別腫瘤細(xì)胞

3.1 E-選擇素在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)特點(diǎn)

多數(shù)腫瘤的惡化、擴(kuò)散是通過血液循環(huán)從而到達(dá)身體其他部位，因此發(fā)現(xiàn)擴(kuò)散過程并阻斷有利于腫瘤早期的發(fā)現(xiàn)與治療。其關(guān)鍵在于腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，而E-選擇素會(huì)促進(jìn)該過程的進(jìn)行[26]。E-選擇素是一種跨膜蛋白，其在活化的內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)高效表達(dá)，可以與腫瘤細(xì)胞表面的某些相應(yīng)天然配體特異性結(jié)合，進(jìn)而隨著血液循環(huán)擴(kuò)散到全身。因此，設(shè)計(jì)一種特異性識(shí)別E-選擇素的配體將能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞表面糖脂蛋白配體與內(nèi)皮細(xì)胞中E-選擇素的黏附，阻斷其擴(kuò)散。

3.2 寡肽熒光探針

寡肽熒光探針[27]先采取傳統(tǒng)的固相法通過逐個(gè)增加的方式合成八肽序列（IELLQAR）作為識(shí)別基團(tuán)（其可以靶向識(shí)別E-選擇素），再與Fmoc-氨基己酸試劑反應(yīng)引入氨基己酸，增強(qiáng)了分子的裂解穩(wěn)定性，同時(shí)也減少了熒光基團(tuán)對(duì)氨基酸相互結(jié)合的影響。然后以氨基己酸和半胱氨酸作為連接基團(tuán)，與異硫氰酸熒光素（FITC）熒光基團(tuán)進(jìn)行組合，經(jīng)裂解和Fmoc保護(hù)基脫除后得到寡肽熒光探針（IELLQAR-FITC）。IELLQAR-FITC中的寡肽配體與血管中內(nèi)皮細(xì)胞的E-選擇素進(jìn)行靶向結(jié)合，在460～550 nm波長下FITC發(fā)出綠色熒光，可進(jìn)行細(xì)胞定量研究。寡肽熒光探針與內(nèi)皮細(xì)胞的特異性結(jié)合抑制腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附過程，從而阻斷了腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散。該探針合成簡便、成本低，經(jīng)MTT測試表明無毒性，不會(huì)影響正常細(xì)胞生命活動(dòng)，克服了天然E-選擇素配體結(jié)合弱、合成困難的缺點(diǎn)，有較好的研究應(yīng)用前景。但其弊端在于只有在較高濃度下才會(huì)顯示強(qiáng)熒光，因此仍需進(jìn)一步改善。

4 結(jié)語

腫瘤是影響人類身體健康的重要因素，對(duì)腫瘤的治療關(guān)鍵在于盡早發(fā)現(xiàn)。近些年許多腫瘤標(biāo)志物被科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，并將其作為腫瘤早期檢測的受體。熒光探針具有精準(zhǔn)檢測、靶向識(shí)別、快速分析等特點(diǎn)，現(xiàn)已被廣泛用于生物檢測領(lǐng)域。本文主要概述了近年以葉酸、β-半乳糖苷酶、E-選擇素為受體所設(shè)計(jì)的幾類熒光探針的研究進(jìn)展，介紹其設(shè)計(jì)策略、作用機(jī)制及各自特點(diǎn)，得知用于腫瘤檢測的理想熒光探針應(yīng)具有無毒性、靶向性高、生物相容性好以及光學(xué)性能優(yōu)（漂白性低、發(fā)光強(qiáng)烈、穩(wěn)定性好）等要求。隨著各項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展，更多具有優(yōu)良性能的熒光探針將被開發(fā)，將其應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，對(duì)腫瘤的早期檢測有很好的指導(dǎo)作用。