范若楠孟金柱楊曉馬曉婉肖麗琳王水蓮

牛卵巢膜細(xì)胞和大黃體細(xì)胞差異表達(dá)基因的篩選

范若楠,孟金柱,楊曉,馬曉婉,肖麗琳王水蓮*

湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院, 湖南 長沙 410128

為探索牛卵巢膜細(xì)胞（TCs）和大黃體細(xì)胞（LLCs）的差異表達(dá)基因并揭示其中潛在的生理關(guān)系，從NCBI中GEO（GENE EXPRESSION OMNIBUS）數(shù)據(jù)庫中獲取GSE83524芯片數(shù)據(jù)，并利用R軟件limma包中的DESeq2進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以篩選出TCs和卵巢黃體中LLCs之間的差異性表達(dá)基因；使用DAVID軟件對上述所獲得的差異性表達(dá)基因分別進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG信號通路分析；利用String數(shù)據(jù)庫和Cytoscape軟件構(gòu)建了差異表達(dá)基因之間的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI），并通過Cyto-Hubba插件中的MCC算法篩選出連通度最大的前10位的關(guān)鍵基因，結(jié)合數(shù)據(jù)庫查找出卵泡發(fā)育相關(guān)的候選基因。結(jié)果顯示，經(jīng)DESeq2分析后，共獲得差異性表達(dá)基因228個(gè)（上調(diào)基因143個(gè)，下調(diào)基因85個(gè)）；GO功能富集分析結(jié)果顯示，富集到生物學(xué)過程、細(xì)胞組分及分子功能的差異表達(dá)基因分別占比33．8%、55．7%和10．5%；KEGG信號通路分析共獲得18條信號通路，其中，HTLV-I感染通路中基因富集最多（16個(gè)）；PPI網(wǎng)絡(luò)互作分析并篩選出了連通度最大的前10位的關(guān)鍵基因；進(jìn)一步通過數(shù)據(jù)庫查找發(fā)現(xiàn)、、、和分別在卵泡發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用。本研究結(jié)果為進(jìn)一步探究卵泡膜細(xì)胞黃體化以及牛卵泡發(fā)育的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

牛; 細(xì)胞; 基因表達(dá)

卵泡膜細(xì)胞（Thecal Cells，TCs）是存在于雌性哺乳動(dòng)物卵泡中的一種生殖細(xì)胞[1]。TCs起源于卵巢中的成纖維樣基質(zhì)細(xì)胞[2]，可在黃體生成素（Luteinizing Hormone，LH）的刺激下合成雄激素，進(jìn)一步被轉(zhuǎn)運(yùn)到顆粒細(xì)胞（Granulosa cells, GCs），在卵泡刺激素（Follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）的協(xié)同作用下，將雄激素轉(zhuǎn)化為雌二醇（Estrogen，E2），從而誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟[3]。哺乳動(dòng)物卵泡成熟并排卵后，會(huì)形成一種內(nèi)分泌腺——黃體(Corpus Luteum，CL)，其主要由卵泡TCs和GCs分化形成，CL內(nèi)的黃體細(xì)胞又分為大黃體細(xì)胞（large luteal cells, LLCs）和小黃體細(xì)胞（small luteal cells, LLCs），在奶牛和綿羊卵巢的研究中發(fā)現(xiàn)，LLC和SLC均有分泌孕酮(Progesterone，P)的能力，且LLC的孕酮分泌量是SLC的20倍[4-6]，但其具體的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。關(guān)于細(xì)胞類型特異性受體和類固醇生成酶已有文獻(xiàn)報(bào)道[7]，但是不同細(xì)胞類型之間基因表達(dá)的差異仍鮮有報(bào)道。

洪小曼等[8]對妊娠期前后的母牛進(jìn)行特異性轉(zhuǎn)錄組研究發(fā)現(xiàn)，排卵前其體內(nèi)的CL數(shù)量存在顯著性增多，并且在TCs中發(fā)現(xiàn)許多新的可以調(diào)控LH的基因，如在妊娠前后，TCs中的CYP19A1基因表達(dá)明顯上調(diào)。孟金柱等[9]研究了顆粒細(xì)胞和黃體細(xì)胞的差異基因表達(dá)，篩選出5個(gè)與GCs增殖和卵泡黃體化相關(guān)的差異表達(dá)基因。但上述研究主要集中在顆粒細(xì)胞和LLCs或TCs之間的關(guān)系，尚未存在學(xué)者對TCs與LLCs之間的細(xì)胞基因差異表達(dá)方面的研究。張華[10]等研究顯示，在黃體化過程中，卵泡膜細(xì)胞會(huì)有一個(gè)快速增殖過程，在LH的作用下膜細(xì)胞與顆粒細(xì)胞會(huì)失去原有的形態(tài)形成黃體，但對于卵泡膜細(xì)胞黃體化的機(jī)制尚不清楚。因此，本研究基于GEO數(shù)據(jù)庫GSE83524芯片數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)方法獲取LLCs和TCs間的差異表達(dá)基因，對卵泡膜細(xì)胞黃體化的重要基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為卵泡膜細(xì)胞黃體化機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 芯片數(shù)據(jù)

本研究中使用的與牛卵泡發(fā)育相關(guān)的表達(dá)譜數(shù)據(jù)選自GEO數(shù)據(jù)庫（www．ncbi．nlm．nih．gov/geo），并下載了GSE83524芯片數(shù)據(jù)，其中包含了牛優(yōu)勢卵泡的3個(gè)TCs樣本和牛黃體的3個(gè)LLCs樣本。

1.2 差異表達(dá)基因篩選

利用R語言中的limma包中的DESeq2進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，篩選存在于牛卵泡中TCs和卵巢黃體中LLCs之間的差異性表達(dá)基因，閾值設(shè)定為FPKM≥2，|1b差異倍數(shù)|≥1，校正后的<0.01。

1.3 GO及KEGG信號通路分析

使用DAVID在線軟件（https://david．ncifcrf．gov/）對上述所獲得的TCs和LLCs之間的差異性表達(dá)基因進(jìn)行了GO功能富集分析，將差異表達(dá)基因按功能分為生物學(xué)過程、細(xì)胞組分和分子功能3類，并利用KEGG進(jìn)行通路分析。

1.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）的構(gòu)建和關(guān)鍵基因的選取

利用String數(shù)據(jù)庫和Cytoscape軟件構(gòu)建了差異表達(dá)基因之間的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI），利用Cyto-Hubba插件中的MCC算法篩選出連通度最大的前10位的關(guān)鍵基因，并通過Uniprot（https://www．uniprot．org/）及Gene card（https://www．genecards．org/）數(shù)據(jù)庫對上述獲取的TCs與LLCs之間的差異表達(dá)基因進(jìn)行功能查找，找出與卵泡發(fā)育相關(guān)的候選基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 差異表達(dá)基因的篩選

根據(jù)R軟件中的DESeq2分析結(jié)果顯示，試驗(yàn)獲得了143個(gè)上調(diào)基因，85個(gè)下調(diào)基因，共計(jì)228個(gè)差異表達(dá)基因（圖1）。

圖 1 牛卵巢膜細(xì)胞與大黃體細(xì)胞差異表達(dá)基因?qū)哟尉垲悎D和火山圖

2.2 差異表達(dá)基因GO功能富集分析

通過DAVID軟件對TCs和LLCs間228個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集分析結(jié)果顯示（圖2），33.8%的總差異表達(dá)基因與生物學(xué)過程有關(guān)，分別富集在34個(gè)組分里，主要與RNA聚合酶II啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)控、DNA模板化的轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)控和細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)相關(guān)。55.7%總差異表達(dá)基因的與細(xì)胞組分有關(guān)，分別富集在14個(gè)組分里，其中細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和細(xì)胞外外分泌體富集的基因最多。10.5%總差異表達(dá)基因與分子功能相關(guān)，分別富集在10個(gè)組分，主要富集在轉(zhuǎn)錄因子活性和生長因子活性等功能上，并且其中存在CYP19A1，其可參與類固醇激素的生物合成，在卵泡發(fā)育過程中起了至關(guān)重要的作用[11]。

圖 2牛卵巢膜細(xì)胞與大黃體細(xì)胞差異表達(dá)基因GO功能注釋分析

2.3 差異表達(dá)基因KEGG信號通路分析

為了獲得與卵泡TCs增殖和黃體化相關(guān)的信號通路，用DAVID軟件對獲得的差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG信號通路分析，結(jié)果如圖3所示，共獲得18條信號通路。其中，HTLV-I感染通路上基因富集最多，有16個(gè)基因。而參與PI3K/AKT信號通路的13個(gè)基因，結(jié)合熱圖分析，有5個(gè)基因（NR4A1，TNN，PRLR，IL6，CDKN1A）表達(dá)上調(diào)，8個(gè)基因（GHR，COL1A1，COL1A2，COL6A3，JAK3，PDGFRA，COL3A1）表達(dá)下調(diào)，其中，已有研究證明PRLR，COL1A1這些基因與卵泡發(fā)育相關(guān)，通過參與PI3K/AKT信號通路來影響黃體生成以及卵泡發(fā)育[12]。

圖 3 牛卵巢膜細(xì)胞與大黃體細(xì)胞差異表達(dá)基因KEGG信號通路分析

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)互作分析

用String軟件分析228個(gè)差異表達(dá)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)互作，利用Cytoscape軟件的可視化分析產(chǎn)生的PPI互作數(shù)據(jù)，并利用MCC算法篩選出連通度最大的前10位的關(guān)鍵基因（圖4、圖5），即：UBE2C、ANLN、PBK、CENPF、BUB1B、CDKN3、ASPM、KIF11、CDC20、MKI67

圖 4 牛卵巢膜細(xì)胞與大黃體細(xì)胞差異表達(dá)基因PPI網(wǎng)路互作分析

圖 5 牛卵巢膜細(xì)胞與大黃體細(xì)胞關(guān)鍵基因PPI網(wǎng)路互作分析

2.5 卵泡發(fā)育相關(guān)的候選基因篩選

進(jìn)一步通過Uniprot和Gene Card等數(shù)據(jù)庫搜索發(fā)現(xiàn)、、、、、、、、等基因都在一定程度上在卵泡發(fā)育過程中起著關(guān)鍵作用（表1）。

表 1 牛卵泡發(fā)育相關(guān)候選基因

3 討論

卵泡是雌性動(dòng)物中卵母細(xì)胞成熟和生長發(fā)育的必要環(huán)境[13]。CL則是決定哺乳動(dòng)物成功妊娠的關(guān)鍵內(nèi)分泌器官[14]。目前對卵泡發(fā)育的研究表明，黃體由卵泡分化而來，卵泡中的顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞分別分化為黃體中的大黃體細(xì)胞和小黃體細(xì)胞[15]。孟金柱的研究表明在顆粒細(xì)胞黃體化過程中PRLR、SPARCL1、INHA、GREB1、CYP19A1五個(gè)基因起了重要作用[9]，其中PRLR、INHA、GREB1、CYP19A1與本研究結(jié)果相同，說明這四個(gè)基因無論是在顆粒細(xì)胞黃體化或者膜細(xì)胞黃體化過程中均有重要作用，但尚未有研究明確表明膜細(xì)胞黃體化的機(jī)制。

在黃體化過程中，雌激素及雄激素分泌量下降，LH、催乳素（PRL）和生長因子受體的表達(dá)升高，其中E2是主要胚胎信號[16]，可以促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖[17]，當(dāng)顆粒細(xì)胞分化為LLCs時(shí)，大量前列腺素F2α（PGF2α）受體（PTGFR）就會(huì)得到表達(dá)，抑制垂體分泌LH[9]；且已有文獻(xiàn)證明PTGFR與卵泡發(fā)育密切相關(guān)[18]。此外，郭淑華[19]等也發(fā)現(xiàn)在黃體化過程中，前列腺素 F2α(PGF2α)的含量會(huì)大幅上升。排出的卵子若不能受精形成受精卵，PGF2α就會(huì)與LLCs中PTGFR結(jié)合，誘導(dǎo)黃體溶解、退化，使卵泡的發(fā)育得以繼續(xù)[20]。參與卵巢功能的基因的表達(dá)還包括芳香酶;CYP19A1，芳香酶是參與雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素的關(guān)鍵酶，在卵泡生長發(fā)育過程中CYP19A1起了關(guān)鍵作用[21]。

本研究利用GEO數(shù)據(jù)庫GSE83524來分析LLCs與TCs的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，在兩種細(xì)胞中得到了228個(gè)差異表達(dá)基因，其中，表達(dá)上調(diào)的基因有143個(gè)，表達(dá)下調(diào)的基因有85個(gè)。CYP19A1，GREB1是篩選出差異倍數(shù)最高的前十個(gè)基因中與乳腺癌有關(guān)的基因，其中有研究表明，GREB1是通過與染色質(zhì)結(jié)合激活雌激素受體α（EstrogenReceptor，ER），對ER介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄至關(guān)重要，因?yàn)樗€(wěn)定了ER與其他輔因子之間的相互作用，在三種異種移植腫瘤中顯示出GREB1-ER相互作用，并使用定向蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)方法，發(fā)現(xiàn)GREB1-ER相互作用在一半的ER+原發(fā)性乳腺癌中[22]。COL1A1也被證明與乳腺癌有關(guān)，COL1A1細(xì)胞表達(dá)可促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移，是乳腺癌新的預(yù)后生物標(biāo)志物和潛在治療靶點(diǎn)，特別是在ER+患者中[12]。

PI3K/Akt信號通路與卵巢功能相關(guān)，包括原始卵泡募集、顆粒細(xì)胞增殖、黃體存活和卵母細(xì)胞成熟[23]。本試驗(yàn)分析了GO、KEGG信號通路及PPI網(wǎng)絡(luò)的相互作用，共有13個(gè)基因在此通路中扮演了重要角色。胚胎著床期間的子宮內(nèi)膜合成的PRL是卵巢調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中的一個(gè)重要因素，子宮內(nèi)膜上存在的PRLR可以為胚泡著床提供適宜的微環(huán)境，以此來提高子宮內(nèi)膜容受性，因此，PRL及其受體是胚泡著床和妊娠維持所必須的[24]。

綜上所述，已經(jīng)可以證明、、、和等基因在卵泡膜細(xì)胞的黃體化過程中發(fā)揮了重要作用。

4 結(jié)論

本研究對牛TCs與LLCs之間的差異表達(dá)基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)和等基因可能在卵泡膜細(xì)胞黃體化過程中發(fā)揮重要作用，為進(jìn)一步探究牛卵泡發(fā)育的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。在后續(xù)研究中，需要使用Q-PCR等實(shí)驗(yàn)技術(shù)來進(jìn)一步驗(yàn)證，有助于更加深入的分析卵泡發(fā)育的分子機(jī)制。

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Screening of Differentially Expressed Genes in Ovarian Theca Cells and Large Luteal Cells of Cattle

FAN Ruo-nan, MENG Jing-zhu, YANG Xiao, MA Xiao-wan, XIAO Li-lin, WANG Shui-lian*

410128,

To explore the potential physiological relationship between bovine ovarian theca cells (TCs) and large luteal cells (LLCs), we analyzed the differentially expressed genes between the two cells using bioinformatics. The GSE83524 chip data was obtained from the GEO (GENE EXPRESSION OMNIBUS) database in NCBI. Then, R DESeq2 in R software limma was employed to screen differentially expressed genes between TCs and LLCs from GSE83524 chip data. Next, DAVID software was used to analyze GO function enrichment and KEGG signal pathway of the differentially expressed genes obtained; The protein interaction network (PPI) between differentially expressed genes was constructed using String database and Cytoscape software. Finally, the top 10 key genes with the highest connectivity were screened through the MCC algorithm in the Cyto Hubba plug-in and Candidate genes related to follicular development were found according to the database. The results showed that 228 differentially expressed genes (143 up-regulated genes and 85 down-regulated genes) were obtained through DESeq2 analysis; The results of GO function enrichment analysis showed that the differentially expressed genes of biological processes, cell components and molecular functions accounted for 33.8%, 55.7% and 10.5% respectively; The results of KEGG signal pathway analysis showed that 18 signal pathways were obtained, mainly focusing on HTLV-I infection pathway. Further analysis of the top 10 key genes screened from PPI network interaction analysis showed that PRLR, COL1A1, INHA, GREB1 and CYP19A1 played an important role in follicular development. These results provide a basis for exploring the molecular mechanism of TCs and the development of LLCs.

Bovine; cell; gene expression

S823

A

1000-2324(2022)06-0900-06

2022-10-18

2022-11-07

國家自然科學(xué)基金(31672507);湖南省自然科學(xué)基金(2020JJ4359);湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)雙一流建設(shè)項(xiàng)目(SYL201802017)

范若楠(1999-),女,碩士研究生,主要從事動(dòng)物生殖方面的研究. E-mail:2291498777@qq.com

Author for correspondence. E-mail:wangshuilian1234@126.com

10.3969/j.issn.1000-2324.2022.06.014