高曉新 李雪梅 王佳帥 朱春玥 曹春然

北京市藥品檢驗(yàn)研究院藥理毒理室，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局創(chuàng)新藥物安全研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中藥成分分析與生物評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，102206，中國(guó)

肝臟是人體重要的器官，具有消化、吸收、代謝、解毒和造血等多種功能，是人體解毒、物質(zhì)貯藏和代謝的重要場(chǎng)所。多種因素可致急性肝損傷，應(yīng)及時(shí)去除病因并加以治療，長(zhǎng)期的肝損傷會(huì)導(dǎo)致肝組織的纖維化，還可能進(jìn)一步引起肝硬化、肝癌的發(fā)生。因此防治急性肝損傷和肝纖維化具有重要的臨床意義。

組方黃甲軟肝顆粒，主要成分是黃芪、葛根、靈芝、鱉甲、三七等，基于中醫(yī)中藥理論具有理氣疏肝，活血軟堅(jiān)的功效。有研究發(fā)現(xiàn)，黃芪粗提物、黃芪總皂苷、黃芪甲苷對(duì)大鼠急性肝損傷和肝纖維化均具有緩解作用［1-5］，同時(shí)葛根素也具有一定的治療急性肝損傷和抗肝纖維化作用［6-9］。本文通過(guò)建立小鼠急性肝損傷和肝纖維化模型來(lái)考察黃甲軟肝顆粒對(duì)肝的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)ICR 小鼠、BALB/c 小鼠，體質(zhì)量均為（18～22）g，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0011，使用許可證號(hào)：SCXK（京）2015-0033，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.1.2 藥物與試劑

黃甲軟肝顆粒，由A 公司提供，批號(hào)：HJ 170206；復(fù)方鱉甲軟肝片，由A 公司提供，批號(hào)：20170604。

D-氨基半乳糖（D-galactosamine，D-Gal N），批號(hào)20170102，Sigma 公司；刀豆素蛋白A（concanavalin A，Con A），批號(hào)066K7031，Sigma 公司。

1.1.3 儀器

AU400 型 生化 儀，OLYMPUS；XH6080 γ計(jì)數(shù) 器，西核儀廠；Typ3151 準(zhǔn)自動(dòng)化化學(xué)發(fā)光儀，德國(guó)Lumino。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 D-Gal N 致小鼠急性肝損傷的作用

選用健康ICR 小鼠，體質(zhì)量（18～20）g，84 只，雌雄各半，按體質(zhì)量隨機(jī)分成6 個(gè)組，分別為陰性對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性藥組（復(fù)方鱉甲軟肝片，2.0 g·kg-1），黃甲軟肝顆粒高、中、低劑量組（生藥20.6、10.3、5.2 g·kg-1）。按20 mL·kg-1每天小鼠灌胃給藥一次，陰性對(duì)照組和模型組灌胃同體積的去離子水，連續(xù)給藥14 d。給藥后d 13，除陰性對(duì)照組以外，其余各組小鼠均腹腔注射D-Gal N 0.8 g·kg-1，禁食禁水16 h 后，于末次給藥后60 min，小鼠眼底靜脈叢取血，測(cè)定血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）和門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）的值［10］。摘取肝臟、脾臟稱(chēng)重，計(jì)算肝指數(shù)、脾指數(shù)（g·10 g-1）

組織病理學(xué)檢查：選取相同部位肝臟制作HE 切片。每張切片隨機(jī)選3 個(gè)視野，分別按照下面的標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)病變程度進(jìn)行病理分級(jí)，并取其平均值作為該動(dòng)物肝臟的病理分級(jí)。各組與模型對(duì)照組比較，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

病變程度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0 級(jí)：肝臟組織結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)異常病變；1 級(jí)：肝細(xì)胞輕度濁腫；2 級(jí)：肝細(xì)胞濁腫/水樣變/脂肪變性，肝灶狀壞死，壞死面積較小，壞死灶內(nèi)可見(jiàn)均質(zhì)圓球狀嗜酸性小體；3 級(jí)：肝細(xì)胞濁腫/水樣變/脂肪變性、肝灶狀壞死，壞死灶面積較大，嚴(yán)重時(shí)發(fā)生融合。壞死灶內(nèi)可見(jiàn)均質(zhì)圓球狀嗜酸性小體，數(shù)量較多。

1.2.2 Con A 致小鼠肝纖維化小鼠的作用

選用健康BALB/c 小鼠，體質(zhì)量（18～20）g，96 只，雌雄各半，按體質(zhì)量隨機(jī)分成陰性對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性藥組（復(fù)方鱉甲軟肝片，2.0 g·kg-1）、黃甲軟肝顆粒高、中、低劑量組（生藥20.6、10.3、5.2 g·kg-1）。除陰性對(duì)照組以外的動(dòng)物按照12.5 mg·kg-1尾靜脈注射Con A（Con A以無(wú)菌的PBS 配制成0.625 mg·mL-1的濃度，小鼠按照0.2 mL·10 g-1尾靜脈注射），陰性對(duì)照組動(dòng)物注射同體積的無(wú)菌PBS，各組每周注射1 次，共注射7 次［11-12］。于第4 次注射當(dāng)天，各組開(kāi)始灌胃給藥，陰性對(duì)照組及模型組給予同體積去離子水，1 次·d-1，連續(xù)給藥4 周（遇到注射日，則注射與給藥分別進(jìn)行）。于末次給藥后 24 h，小鼠眼靜脈叢取血，分離血清，測(cè)定ALT 和AST，摘取肝、脾稱(chēng)重，計(jì)算肝脾指數(shù)（g·10 g-1），各組與模型比較，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，病理分級(jí)數(shù)據(jù)采用卡方檢驗(yàn)，其它數(shù)據(jù)用組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 D-Gal N 致小鼠急性肝損傷的作用

小鼠血清ALT、AST 的變化如Tab.1 所示。與陰性對(duì)照組比較，小鼠腹腔注射D-Gal N 后血清ALT、AST 顯著增高（P＜0.01）；與模型組比較，黃甲軟肝顆粒各劑量組及陽(yáng)性藥組的ALT、AST 均顯著降低（P＜0.01）。

Tab.1 Effects of Huangjiarangan granules on serum biochemistry of D-Gal N induced acute liver injury mice（±s，n=14）

Tab.1 Effects of Huangjiarangan granules on serum biochemistry of D-Gal N induced acute liver injury mice（±s，n=14）

Note：##P＜0.01 vs negative control group；**P＜0.01 vs model group.

各組小鼠肝脾指數(shù)的變化如Tab.2 所示。與陰性對(duì)照組比較，小鼠注射D-Gal N 后肝脾指數(shù)均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠的肝指數(shù)有降低趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；各給藥組的脾指數(shù)均降低且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05，P＜0.01）。

Tab.2 Effect of Huangjiaruangan granule on liver and spleen index of D-Gal N induced acute liver injury mice（±s，n=14）

Tab.2 Effect of Huangjiaruangan granule on liver and spleen index of D-Gal N induced acute liver injury mice（±s，n=14）

Note：##P＜0.01 vs negative control group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group.

病理學(xué)分級(jí)結(jié)果如Tab.3 所示。小鼠注射D-Gal N 后肝損傷程度明顯比陰性對(duì)照組動(dòng)物嚴(yán)重，具有顯著差異，陽(yáng)性藥組動(dòng)物及黃甲軟肝顆粒各劑量組動(dòng)物肝損傷程度與模型對(duì)照組比較顯著減輕。

Tab.3 Effects of Huangjiaruangan gruanules on liver histopathology of D-Gal N induced acute liver injury in mice（n=14）

2.2 Con A 致肝纖維化小鼠的影響

小鼠生化指標(biāo)的變化如Tab.4 所示。與陰性對(duì)照組比較，小鼠注射Con A 后血清ALT、AST 顯著增高（P＜0.01）；與模型組比較，黃甲軟肝顆粒高、中劑量組及陽(yáng)性藥組的ALT 及AST 值均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

Tab.4 Effects of Huangjiaruangan granules on serum biochemistry of mice with liver fibrosis induced by Con A（±s，n=16）

Tab.4 Effects of Huangjiaruangan granules on serum biochemistry of mice with liver fibrosis induced by Con A（±s，n=16）

Note：##P＜0.01 vs negative control group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group.

小鼠肝脾指數(shù)的變化如Tab.5 所示。與陰性對(duì)照組比較，小鼠注射刀豆素蛋白A 后肝脾指數(shù)均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，黃甲軟肝中劑量組的肝指數(shù)明顯減?。≒＜0.05），其它給藥組肝脾指數(shù)有降低趨勢(shì)但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Tab.5 Effects of Huangjiaruangan granules on liver and spleen index of mice with liver fibrosis induced by Con A（±s，n=16）

Tab.5 Effects of Huangjiaruangan granules on liver and spleen index of mice with liver fibrosis induced by Con A（±s，n=16）

Note：##P＜0.01 vs negative control group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group.

3 討論

Gal N 具有很強(qiáng)的毒性，進(jìn)入肝臟后引起肝細(xì)胞變性壞死，使細(xì)胞內(nèi)大量ALT 和AST 大量釋放，引起肝細(xì)胞變性，炎性浸潤(rùn)以及壞死等。D-Gal N 致急性肝損傷是利用D-Gal N 的肝毒性造成急性肝損傷的動(dòng)物模型，是目前公認(rèn)的較為經(jīng)典的研究急性肝損傷的動(dòng)物模型［10］。ALT 分布在肝細(xì)胞漿、AST 分布在肝細(xì)胞線(xiàn)粒體中，ALT、AST 升高分別反應(yīng)了肝細(xì)胞膜和肝細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的損傷，是反應(yīng)肝損傷的敏感指標(biāo)［11］。臟器系數(shù)是毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)中的常用指標(biāo)，臟器系數(shù)增大或減少在一定程度上反應(yīng)臟器的損傷程度。本研究小鼠注射D-Gal N 后血清ALT、AST 和肝脾系數(shù)明顯升高、肝臟出現(xiàn)組織病理?yè)p傷。與模型組比較，黃甲軟肝顆粒各組均能顯著降低血清ALT 和AST 的水平、均降低肝脾指數(shù)且脾指數(shù)降低有顯著性，組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)各給藥組動(dòng)物肝損傷程度顯著減輕。綜上所述，黃甲軟肝顆粒對(duì)D-Gal N 所致的小鼠急性肝損傷有明顯的保護(hù)作用。

小鼠反復(fù)注射Con A 致肝纖維化［12-13］，該模型中肝細(xì)胞受損不嚴(yán)重，炎癥反應(yīng)引起膠原沉積為其主要表現(xiàn)，適合予以研究肝纖維化免疫疾病、吞噬細(xì)胞、Ito細(xì)胞及自身免疫性肝病等方面問(wèn)題［14］。本研究中，小鼠注射Con A 可引起血清ALT、AST 和肝脾指數(shù)顯著升高；黃甲軟肝顆粒高、中劑量組可有效降低模型動(dòng)物血清ALT、AST 升高水平，且黃甲軟肝中劑量組的肝指數(shù)明顯減小、其它給藥組肝脾指數(shù)有降低趨勢(shì)。綜上所述，黃甲軟肝顆粒對(duì)Con A 引起的肝纖維化有一定的治療作用。

綜合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可證實(shí)黃甲軟肝顆粒對(duì)小鼠D-Gal N 致急性肝損傷有明顯的保護(hù)作用并對(duì)Con A引起的肝纖維化有一定的治療作用，為其臨床使用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。