胡永彬，徐禮生

(1 新宇藥業(yè)股有限公司，安徽 宿州 234000；2 宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽 宿州 234000)

1 硫酸新霉素的性質(zhì)

從弗氏鏈霉菌的發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到的新酶素，是最早被發(fā)現(xiàn)的2-脫氧鏈酶胺氨基糖苷類抗生素[1]，具有抗菌能力強(qiáng)特點(diǎn)[2]。氨基糖苷類抗生素的產(chǎn)生菌對(duì)磷酸鹽極為敏感，僅在亞最適生長磷酸鹽的濃度時(shí)產(chǎn)量最高[3]. 氨基糖苷類抗生素產(chǎn)生菌被某些金屬離子如Ca、Cu、My、Na、Zn等刺激而產(chǎn)生抗生素[4]。新霉素是堿性水溶性抗生素，可在實(shí)際應(yīng)用過程中，中和酸性物質(zhì)，結(jié)合成鹽，所以工業(yè)用新霉素都是硫酸新霉素物質(zhì)。硫酸新霉素為白色粉末，不溶于有機(jī)溶媒，在pH 2～9的范圍內(nèi)抗菌效能穩(wěn)定，與酸一起加熱即失去大部分活力。硫酸新酶素能夠與細(xì)菌核糖體30S亞基結(jié)合，使mRNA錯(cuò)讀，進(jìn)而抑制翻譯過程，抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成。因此對(duì)革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、結(jié)核桿菌等發(fā)揮良好的抗菌作用，對(duì)放線菌、鉤端螺旋體、阿米巴原蟲有抑制作用，在堿性溶液中抗菌作用較強(qiáng)，是一種理想殺菌劑。硫酸新霉素可阻礙內(nèi)皮生長因子來干擾血管的形成[2]。氨基糖苷類藥物具有一定神經(jīng)毒性，新霉素的毒性也較大。長期使用硫酸新霉素會(huì)傷害第VIII對(duì)腦神經(jīng)，從而引起不可逆性耳聾[5]。也可造成對(duì)維生素A、維生素B12的吸收不良等癥狀[6]。

2 硫酸新霉素的作用機(jī)理

新霉素(neomycin，Nm)是弗氏鏈霉菌產(chǎn)物中純化得到的一種氨基糖苷類抗生素。其主要作用方式為與細(xì)菌核糖體16S rRNA結(jié)合，通過誘導(dǎo)密碼子誤讀和干擾起始和易位來抑制蛋白質(zhì)合成，從而導(dǎo)致細(xì)菌死亡[7-9]。硫酸新霉素可損害第8對(duì)腦神經(jīng)、前庭神經(jīng)和耳蝸神經(jīng)，導(dǎo)致失去平衡、姿勢異常，甚至可造成不可恢復(fù)性失聰[10]。硫酸新霉素在腎臟中以原形代謝，可累積在腎臟并損害腎小管上皮細(xì)胞，造成一定的腎毒性，根據(jù)臨床表現(xiàn)程度不同，可分為急性腎功能衰竭和無癥狀的輕度血清生化指標(biāo)異常[11]硫酸新霉素可蓄積在毛細(xì)胞的線粒體上，并與其膜上的rRNA結(jié)合，損壞線粒體膜及其功能，線粒體膜的能量供應(yīng)被阻斷，細(xì)胞得不到充分的能量供應(yīng)而死亡；并且儲(chǔ)存在膜內(nèi)間隙的細(xì)胞色素C被釋放到細(xì)胞質(zhì)中，并與其他蛋白質(zhì)結(jié)合，形成啟動(dòng)caspase-9激活復(fù)合體，活性的caspase-9以正反饋放大效應(yīng)在細(xì)胞內(nèi)激活非活性的caspase-9和caspase-3，使得細(xì)胞的凋亡程序被啟動(dòng)，引起細(xì)胞凋亡[12]。新霉素與TAR的小溝結(jié)合，使TAR的構(gòu)象發(fā)生變化，縮小了Tat在大溝中的結(jié)合區(qū)域，抑制Tat與TAR結(jié)合，新霉素通過與內(nèi)部環(huán)的結(jié)合，從而抑制Rev與病毒RNA結(jié)合[13]。新酶胺核心能夠與TAR、RRT發(fā)生相互作用，使得新霉素與HIV、TAR及RRE、RNA牢固結(jié)合，通過質(zhì)譜分析和凝膠法試驗(yàn)，TAR、RNA中有多個(gè)新霉素結(jié)合位點(diǎn)[14]。PDGF、VEGF和血管生成素是三種重要的血管發(fā)生因子，能夠在腦膠質(zhì)瘤中高效表達(dá)[15]，新霉素能夠抑制這三種血管發(fā)生因子的表達(dá)，并抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，心血管是腦膠質(zhì)瘤生長所必需的，所以，新霉素不僅可以阻礙心血管的發(fā)生，還能夠直接抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。因此，新霉素抗腫瘤的作用將會(huì)比單純抑制腫瘤血管發(fā)生或細(xì)胞增殖的抑制劑的作用更顯著[14]。

3 硫酸新霉素的應(yīng)用

根據(jù)發(fā)酵過程特性、發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的研究結(jié)果和淀粉酶活力變化規(guī)律，采用發(fā)酵過程優(yōu)化策略，發(fā)酵120 h，放罐效價(jià)提高，殘?zhí)菨舛葟?.0%下降到1.5%以下，淀粉單耗下降，同時(shí)減少排放COD量，達(dá)到“減污”、“增效”的目的[16]。采用化學(xué)誘變劑亞硝基胍(NTG)進(jìn)行誘變處理，使孢子發(fā)生DNA高頻率突變[17]，能夠?yàn)楣I(yè)化高效發(fā)酵生產(chǎn)新霉素提供優(yōu)良菌種。針對(duì)提高新霉素產(chǎn)素率，可以采用不改變?cè)N遺傳性狀(DNA)，除去搖床發(fā)酵原培養(yǎng)基中玉米漿等添加促進(jìn)劑，同時(shí)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH，36e培養(yǎng)，縮短搖床發(fā)酵周期，新霉素產(chǎn)量提高40%以上[18]。利用花生粕取代花生餅作為硫酸新霉素發(fā)酵的原料，避免發(fā)酵異常、菌絲畸形等，有效保障發(fā)酵生產(chǎn)。采用高效分離手段，如離子交換技術(shù)和膜分離技術(shù)，優(yōu)化新霉素發(fā)酵液的提取工藝，利用732樹脂動(dòng)態(tài)吸附與洗脫，使優(yōu)化后的硫酸新霉素的提取率達(dá)88.2%，降低環(huán)境污染[19]?；诙嗫装灏l(fā)酵及酶標(biāo)儀檢測高通量選育模型，建立酶標(biāo)儀測定發(fā)酵液中硫酸新霉素的方法，并對(duì)24孔板發(fā)酵條件進(jìn)行單因素和正交優(yōu)化，使硫酸新霉素的效價(jià)較原發(fā)酵條件有所提高[20]，能夠快速篩選誘變后硫酸新霉素高產(chǎn)菌株。建立HPLC法，以金黃色葡萄球菌作為實(shí)驗(yàn)菌株，采用抗生素微生物檢定法中管碟法中的二計(jì)量法測定硫酸新霉素的效價(jià)[21]。因硫酸新霉素質(zhì)子化而帶正電荷，可通過靜電引力作用與帶負(fù)電荷的鋅試劑陰離子結(jié)合成離子締合物，建立鋅試劑共振散射譜新方法，用于實(shí)際樣品中硫酸新霉素含量的測定[22]。硫酸新霉素可阻遏奧尼羅非魚的嗜水氣單胞菌病，并且，由硫酸新霉素引起的淡水魚類出血性疾病的病原體，可被良好的控制和殺滅，因此促進(jìn)禽畜生長[23]。通過正己烷溶解曲安奈德新霉素貼膏，采用水萃取的方法提取貼膏劑中的硫酸新霉素，建立HPLC法測定其含量[24]。針對(duì)硫酸新霉素化合物的特殊性，建立通用性強(qiáng)、靈敏度高的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(HPLC-MS/MS)測定飼料中硫酸新霉素含量，經(jīng)磷酸鹽緩沖液提取，用C18固相凈化、進(jìn)行高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜儀測定[25]提高飼料利用率，促進(jìn)禽畜生長，廣泛用于畜牧業(yè)。HPLC-PDA法可同時(shí)測定硫酸新霉素可溶粉中非法添加甲硝唑、水楊酸、乙酰甲喹、甲氧芐啶，用乙醇提取，經(jīng)C18柱分離，磷酸鹽緩沖液作為流動(dòng)相洗脫，并采用二極管陣列檢測器進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果表明，這四種化學(xué)藥物在0.01～0.12 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回收率在98.0%～99.9%之間，能夠?yàn)楂F藥市場提供一定的技術(shù)支撐[26]。對(duì)發(fā)酵液中新霉素B組分的含量進(jìn)行測定，可采用高效液相-脈沖安培檢測法，能夠有效跟蹤發(fā)酵過程，為發(fā)酵過程中補(bǔ)料、換罐等操作提供依據(jù)[27]。通過研究新霉素A、B及其衍生物的作用機(jī)理，從而為研制高效、低毒的抗HIV藥物提供更多的研究方向和借鑒方法。新霉素在弗氏鏈霉菌合成途徑如下：2-脫氧青蟹肌醇糖合成酶(由neoC基因編碼調(diào)控)以D-葡萄糖磷酸(G6P)為原料，對(duì)其進(jìn)行催化反應(yīng)生成2-脫氧青蟹肌醇糖(2DOI)，谷氨酰胺在2DOI轉(zhuǎn)氨酶(由neoS基因編碼調(diào)控)作用下被轉(zhuǎn)化為2-脫氧青蟹肌醇糖胺(2DOIA)[10]。2DOIA被NAD依賴性脫氫酶(由neoE基因編碼調(diào)控)催化， C-1位發(fā)生脫氫形成3-氨基-2，3-脫氧青蟹肌糖。3-氨基-2，3-脫氧青蟹肌糖被2DOI轉(zhuǎn)氨酶(由neoS基因編碼調(diào)控)催化轉(zhuǎn)化為2-脫氧鏈霉胺(2DOS，這類抗生素合成過程中重要中間產(chǎn)物)。2DOS在糖基轉(zhuǎn)移酶(由neoM基因編碼調(diào)控)與糖基供體(尿苷二磷酸-N-乙酰-D-葡萄糖)作用下發(fā)生糖基化反應(yīng)形成2-氨基-乙酰巴龍霉胺，后者在脫乙酰酶(由neoD基因編碼調(diào)控)的催化作用下進(jìn)一步脫去2-N-乙?；罱K反應(yīng)生成巴龍霉胺[11]。巴龍霉胺的C-6′由neoQ基因編碼調(diào)控的催化下發(fā)生氧化，經(jīng)過轉(zhuǎn)氨酶(由neoB基因編碼調(diào)控)催化生成新霉素A(Neamine)。在糖基轉(zhuǎn)移酶(由neoF基因編碼調(diào)控)的作用下，核糖霉素發(fā)生糖基化，隨后在脫乙酰酶(由neoD基因編碼調(diào)控)的催化下生成新霉素Y2。新霉素Y2在FAD依賴性脫氫酶(由neoQ基因編碼調(diào)控)和轉(zhuǎn)氨酶(由neoB基因編碼調(diào)控)催化作用下生成新霉素C(neomycin C)。新霉素C在差向異構(gòu)酶(由neoN基因編碼調(diào)控)催化作用下C-5?發(fā)生差向異構(gòu)化形成新霉素B。

4 結(jié) 語

抗生素是由微生物及其他有生命的體系所產(chǎn)生的，具有抑制和殺滅其他微生物及抗癌能力的化合物。采用NTG誘變與鏈霉素抗性突變株篩選新霉素高產(chǎn)菌株，獲得Streptomyces fradiae Str63高產(chǎn)突變菌株，奠定了工業(yè)化生產(chǎn)新霉素的基礎(chǔ)。新霉素的傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝產(chǎn)率低，排污量大，采用發(fā)酵過程優(yōu)化策略，減少環(huán)境污染，提高效價(jià)。優(yōu)化后的新霉素發(fā)酵液提取工藝不僅提取率高，節(jié)省水資源，而且污染物排放量少，是一種環(huán)境友好的提取工藝?？刹捎梦⑸锓ā⒚庖叻治龇?、色譜法、分光光度法、熒光分析法、電化學(xué)分析法、共振散射光譜法和比色法等測定硫酸新霉素。硫酸新霉素在堿性溶液中抗菌作用較強(qiáng)，對(duì)于相當(dāng)多的抗生素都有很見效的作用，能夠發(fā)展為抗癌、抗HIV、抗腫瘤藥物等。硫酸新霉素的微生物發(fā)酵生產(chǎn)過程需要繼續(xù)進(jìn)一步研究，對(duì)菌株進(jìn)行優(yōu)化改造，硫酸新霉素的作用機(jī)理需要更深入的探究，但隨著新霉素的研究不斷深入，未來會(huì)逐漸解決有關(guān)硫酸新霉素的工業(yè)應(yīng)用的難題。