劉俊華，周憶蓮，崔垚鑫，劉燕霏，楊建德

（天津農(nóng)學(xué)院 動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津市農(nóng)業(yè)動物繁育與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300392）

埃希氏菌（Escherichia）是重要的人畜共患病病原菌，目前已知有七個物種，分別是大腸埃希氏菌（CASTELLANI&CHALMERS，1919）、赫爾曼埃希氏菌、傷口埃希氏菌（BRENNER等，1982）、弗格森埃希氏菌（FARMER等，1985）、蟑螂埃希氏菌、艾伯特埃希氏菌（HUYS等，2003）以及從中國青藏高原旱獺糞便中發(fā)現(xiàn)和命名的旱獺埃希氏菌[1-3]。大腸埃希氏菌俗稱大腸桿菌，有一部分血清型常引起幼齡動物發(fā)生嚴(yán)重腹瀉和敗血癥等疾病，且這類具致病性的大腸桿菌能在不同種動物之間進(jìn)行傳播[4-6]。赫爾曼埃希氏菌是條件性致病菌，可引起人的原發(fā)和繼發(fā)性感染，如呼吸道、泌尿系統(tǒng)感染及傷口化膿性感染等[7]。弗格森埃希氏菌是對人類少見的條件致病菌，可引起人和動物創(chuàng)傷感染、尿道感染、菌血癥、腹瀉和胸膜感染等[8-11]。艾伯特埃希氏菌在一處人類病例中導(dǎo)致患病者出現(xiàn)血性/非血性腹瀉、 嘔吐、脫水、發(fā)熱、腹脹等臨床癥狀，是一種重要的潛在新發(fā)食源性致病菌[12]。蟑螂埃希氏菌、旱獺埃希氏菌經(jīng)查閱現(xiàn)有資料未得到具體臨床癥狀信息。埃希氏菌在致病性上或多或少誘發(fā)人畜表現(xiàn)出相同或相似的臨床癥狀，同時又致人畜表現(xiàn)出其他完全不同的臨床癥狀，使疾病防治難度加大。

16S rRNA是所有原核生物蛋白質(zhì)合成必需的1種核糖體RNA，大約由1 550個核苷酸組成，其長度能夠表現(xiàn)足夠的種間多態(tài)性，又便于序列分析[12]。細(xì)菌基因組中16S rRNA在漫長進(jìn)化中表現(xiàn)出高度保守性，有微生物“化石”之稱。它的結(jié)構(gòu)中保守區(qū)域與變異區(qū)域共存，形成了不同微生物的特征核苷酸序列，是較好的生物標(biāo)志物，可作為微生物多樣性分析的分子基礎(chǔ)，用來鑒定細(xì)菌的進(jìn)化距離和親緣關(guān)系。2005年，基于焦磷酸測序法的高通量測序系統(tǒng)為測序技術(shù)帶來革命性進(jìn)步，16S rRNA數(shù)據(jù)庫得到迅速擴(kuò)大[11]。本試驗(yàn)通過對實(shí)驗(yàn)室分離菌及 NCBI數(shù)據(jù)庫檢索的多種埃希氏菌菌株的16S rRNA進(jìn)行篩選、整理，經(jīng)同源序列比對分析構(gòu)建分子進(jìn)化樹，探究不同地區(qū)埃希氏菌的進(jìn)化與遺傳演化關(guān)系，揭示埃希氏菌在畜禽疾病傳播與突變中的遺傳進(jìn)化規(guī)律，為防治該病提供理論參考依據(jù)。

1 材料

在本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)并分離出4株菌株，GenBank序列號分別為MK729003.1（E. coli1 106，1 481 bp）、MK729001.1（E. fergusoniijoe，1 483 bp）、MK729002.1（E. coli1 018，1 475 bp）、MK685226.1（E. marmotaeEy-zq，1 480 bp）。其余16S rRNA序列均來自美國國立生物技術(shù)信息中心（The National Center for Biotechnology Information，NCBI），進(jìn)入NCBI主頁（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）選擇需要的序列進(jìn)行下載。

BioEditv7.0.5軟件下載自 http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html，MEGA X軟件下載自https://www.megasoftware.net，DNASTAR軟件下載自https://www.dnastar.com。

2 方法

2.1 基因序列篩選

在 NCBI網(wǎng)站搜索框中，通過 Nucleotide BLAST將實(shí)驗(yàn)室分離的 4組基因序列分別運(yùn)行BLAST比對，檢索NCBI數(shù)據(jù)庫中16S rRNA序列。本試驗(yàn)以埃希氏菌屬16S rRNA作為研究范圍，探究不同地區(qū)埃希氏菌的進(jìn)化與遺傳演化關(guān)系。試驗(yàn)排除了序列檢索到的非埃希氏菌基因序列信息，而選擇BLAST比對結(jié)果中同源相似性較高、序列一致性在95%以上的序列[12-13]。同時檢索其他未進(jìn)行比對的埃希氏菌16S rRNA序列，以此擴(kuò)大試驗(yàn)菌株的地域范圍及菌株多樣性。對這些序列進(jìn)行下載，在 NCBI中收集序列信息，包括 GenBank序列號、菌株編號、序列來源地區(qū)、序列長度，整理數(shù)據(jù)。

2.2 基因同源性比較及分子進(jìn)化樹構(gòu)建

2.2.1 使用BioEdit軟件對基因序列進(jìn)行處理

打開 BioEdit軟件運(yùn)用 ClustalW Multiple alignment方法對42個基因序列進(jìn)行整合、比對、分析，得到長度約為1 100～1 483 bp之間的基因序列。

2.2.2 基因同源性比較

打開 DNASTAR軟件導(dǎo)入已做處理序列，進(jìn)行基因同源性比較。

2.2.3 利用MEGA X軟件構(gòu)建分子進(jìn)化樹

在 MEGA軟件中，用 Neighbor-Joining（NJ，鄰接法）和 p-distance模型按照軟件原始參數(shù)構(gòu)建分子進(jìn)化樹使已經(jīng)修剪對齊的 16S rRNA基因序列生成鄰接樹，估計它可以引導(dǎo)支持運(yùn)行100 000次重復(fù)檢測[13-14]。同時采用Bootstrap法進(jìn)行Bootstrap values（步長值）為1 000的重排構(gòu)樹檢驗(yàn)所計算的進(jìn)化樹各分支的可信度，估計 95%的可信限度，完成分子進(jìn)化樹構(gòu)建[15]。

3 結(jié)果與分析

3.1 基因篩選

基于16S rDNA序列（16S rRNA基因）分析是細(xì)菌系統(tǒng)分類的“金標(biāo)準(zhǔn)”[16]，在NCBI數(shù)據(jù)庫中分別以 MK729003.1、MK729001.1、MK729002.1、MK68526作為目的基因進(jìn)行搜索，通過BLAST中的Nucleotide BLAST選項(xiàng)，共得到400個部分重復(fù)的基因序列，同時在NCBI總數(shù)據(jù)庫中搜索得到100個埃希氏菌16S rRNA基因序列，經(jīng)過進(jìn)一步篩選，得到42個來源明確、長度適中的埃希氏菌16S rRNA基因序列，見表1。

表1 埃希氏菌屬16S rRNA基因序列信息

3.2 基因同源性比較及分子進(jìn)化樹構(gòu)建

根據(jù)表1數(shù)據(jù)，運(yùn)用DNASTAR、MEGA X軟件進(jìn)行同源性比較和序列比對，用鄰接法構(gòu)建鄰接分子進(jìn)化樹，見圖1。

圖1 42株埃希氏菌株分子進(jìn)化樹分析

由圖1可以看出，所有菌株根據(jù)在進(jìn)化樹中的分布可以分為四大分支：大腸埃希氏菌與弗格森埃希氏菌集中分布一支，艾伯特埃希氏菌、旱獺埃希氏菌及傷口埃希氏菌分成三支且各自獨(dú)立集中分布。四大分支遺傳距離遠(yuǎn)近呈現(xiàn)有序的狀態(tài)，總體來看，旱獺埃希氏菌分支在進(jìn)化樹中結(jié)點(diǎn)最為靠前，其后依次是大腸埃希氏菌、弗格森埃希氏菌、艾伯特埃希氏菌、傷口埃希氏菌。傷口埃希氏菌絕大多數(shù)與其他四種菌處于完全不同的一支上，同源性僅在 94.0%左右。同時在大腸埃希氏菌、弗格森埃希氏菌、艾伯特埃希氏菌、旱獺埃希氏菌中，或多或少的有某些菌株交叉在一起，同源性在 96.0%左右，如 HQ259947.1E.vulnerisM3 （China）遠(yuǎn)離本菌群分支靠近旱獺埃希氏菌分支，與MF682954.1（Korea）同源性98.8%，與MK685226.1（China）同源性99.6%，另外大腸埃希氏菌與弗格森埃希氏菌完全混雜在一起，大部分菌株同源性高達(dá) 98.0%。這反映出四大分支菌的基因同源性大小和親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，也反映出菌株之間存在著程度不同變異，且不同類種菌株間相互變異度不同，推測大腸埃希氏菌和弗格森埃希氏菌之間變異度最高，其余分支在菌種之間變異較低，存在較高保守性[16-18]。

在進(jìn)化樹中，每一大分支中多數(shù)菌株支長存在較小差異，且有著非常明顯的地域特征。這些基因序列在較小的距離內(nèi)發(fā)散，最終聚類到一起，且各類聚合支之間的地域特征非常明顯[19]。

3.2.1 大腸埃希氏菌和弗格森埃希氏菌共同進(jìn)化

大腸埃希氏菌和弗格森埃希氏菌混雜在一起，它們的遺傳距離較近，如 NR 114042.1E. coliNBRC 102203 （Japan）與 KJ726590.1E. fergusoniiGen8 （U.S.A）的同源性高達(dá)98.9%，MK729003.1E. coli1106 （China）與 KC986847.1E. fergusoniiBI03 （New Zealand）、KC986857.1E. fergusoniiBI13 （New Zealand）、MK729001.1E. fergusoniijoe（China）的同源性分別為99.3%、99.1%、100.0%。另外，KJ626264.1E. fergusoniiE10 （Netherlands）與MK729002.1E. coli1018（China）分支相距較遠(yuǎn)，但這兩種不同菌種菌株的同源性高達(dá) 99.4%。由此推測兩種菌在很早的時期是由共同的原始菌株演化而來，且兩種菌之間發(fā)生變異而相互轉(zhuǎn)化的可能性也極高[19]。在圖 1 中，KF938590.1（Korea）、KJ806495.1（China）與 KJ626246.1（Netherlands）聚為一支，KC986847.1（New Zealand）與KC986857.1（New Zealand）、MK729001.1（China）、MK729003.1（China）聚為一支，這兩支同源性高、遺傳距離較近，且前一支結(jié)點(diǎn)靠前，推測弗格森埃希氏菌可能在跨區(qū)域傳播過程中發(fā)生變異形成新的本菌群菌株，部分菌株變異成大腸埃希氏菌屬[17-18]。

3.2.2 艾伯特埃希氏菌單獨(dú)進(jìn)化

由圖1也可以看出在艾伯特埃希氏菌中，來自南極的KF891382.1（Antarctica）和KF891381.1（Antarctica）兩株聚類到一支，同源性高達(dá)98.2%；來自中國的KX765467.1 （China）遠(yuǎn)離KX765475.1（China）且與之同源性高達(dá) 99.8%，兩株菌株都遠(yuǎn)離來自日本的AB594160.1 （Japan），卻與南極的兩株聚類到一個結(jié)點(diǎn)，同源性分別為 97.9%、96.8%、97.7%、96.6%；同時KX765475.1（China）與 KT333052.1（Australia）聚類為一支，同源性高達(dá) 99.2%。由此可以推測，該菌型在同一地區(qū)存在高度保守菌株與保守性較低菌株共存的情況，且在亞洲與大洋洲、南極洲三大洲間存在著交叉進(jìn)化。

3.2.3 旱獺埃希氏菌兩枝進(jìn)化，與傷口埃希氏菌關(guān)系較為密切

在圖1中，可以發(fā)現(xiàn)一個明顯的中國地區(qū)旱獺埃希氏菌聚集，KP263376.1 （China）、KP263379.1（China）、NR 136472.1（China）、KP263378.1（China）四株構(gòu)成了進(jìn)化較近的中國基因型，呈現(xiàn)一種獨(dú)立的進(jìn)化分支，并遠(yuǎn)離其他分支，說明旱獺埃希氏菌在我國存在特有的菌型，其具有高度的保守性，但從圖中仍能夠發(fā)現(xiàn)另一株MK68526（China）不在本分支內(nèi)，體現(xiàn)出中國旱獺埃希氏菌分支的存在。從圖中還能發(fā)現(xiàn)MF682954.1（Korea）、MK68526 （China）、MH021660.1（India）、MF480443.1（Korea）聚類到一支，相互遺傳距離較近，且共同的結(jié)點(diǎn)位于中國地區(qū)旱獺埃希氏菌聚集分支結(jié)點(diǎn)前，推測中國地區(qū)旱獺埃希氏菌是由該分支進(jìn)化而來。同時發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)的菌株全部為亞洲大陸的，沒有發(fā)現(xiàn)其他大陸地區(qū)的蹤跡，說明旱獺埃希氏菌更適宜生存的地區(qū)可能在亞洲大陸，且可能是旱獺埃希氏菌的發(fā)源地[17-20]。

由圖 1還可以發(fā)現(xiàn)，在傷口埃希氏菌中，MF079358.1（China）、KX357823.1（India）、LT631770.1（Belgium）、LC040946.1（Pakistan）、AB681776.1（Japan）、JQ958880.1（France）、KR612005.1（India）、AF530476.1（Canada）在地域距離上相隔較遠(yuǎn)，彼此間遺傳距離較大，但最終聚類為一支。從圖中可以明顯發(fā)現(xiàn)，分支產(chǎn)生的順序在地理位置上有著一定的規(guī)律：東亞、南亞、西亞、歐洲、北美洲，說明傷口埃希氏菌的傳播可能發(fā)源于亞洲，并且在傳播過程中不斷發(fā)生不同程度變異。

4 討論

42株菌株分為四大分支[21]，不同分支間集中分布明顯，說明四個分支間存在較高保守性，且不同菌屬可能朝著不同的方向進(jìn)化[19]。大腸埃希氏菌與弗格森埃希氏菌分布為一支，相互之間同源性高，遺傳距離近，與其他菌型親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，在共同進(jìn)化中易發(fā)生變異，如 KF938590.1（Korea）、KJ806495.1（China）、KC986857.1（New Zealand）、MK729003.1（China）、NR 114042.1（Japan）、KJ726590.1（U.S.A），其進(jìn)化程度與地理位置關(guān)系不大。在艾伯特埃希氏菌中，來自南極洲的兩株在遺傳關(guān)系上距離較近，同源性高達(dá)98.2%，來自中國的兩株在遺傳關(guān)系上距離卻較遠(yuǎn)，表明艾伯特埃希氏菌的類型與生存環(huán)境條件有很大關(guān)聯(lián)性，該菌型進(jìn)化方向仍未突破地域，而基于16S rRNA序列分析，推測艾伯特埃希氏菌的起源可能是多源的，環(huán)境條件可能作為重要的進(jìn)化壓力，在艾伯特埃希氏菌長期演化過程中扮演重要角色[19]；另外，來自中國的一株與南極的兩株在遺傳關(guān)系上距離較近，另一株中國的與來自澳大利亞的一株在遺傳關(guān)系上距離較近，說明該菌型在亞洲與大洋洲、南極洲三大洲間可能存在著交叉進(jìn)化。

在進(jìn)化樹上，4 株中國基因型旱獺埃希氏菌菌株與其他不同地區(qū)菌株分離明顯，各自獨(dú)立進(jìn)化，且它們?nèi)课挥趤喼薮箨懀梢酝茰y旱獺埃希氏菌更適宜生存的地區(qū)在亞洲大陸，研究中國此類菌株更有利于揭示旱獺埃希氏菌基因的遺傳進(jìn)化規(guī)律，傷口埃希氏菌在地域距離上相隔較遠(yuǎn)且株間分布較散，可能與傷口埃希氏菌極易感染傷口的特性有關(guān)[17-21]。

在同源性比較與分子進(jìn)化樹中，也有一些菌株散落在不同菌種的分支間，并且與周邊菌株的同源性極高，除了基因變異，推測是由于一些特殊因素造成細(xì)菌傳播，如人口流動、物種引進(jìn)、候鳥遷徙、人工養(yǎng)殖和商貿(mào)交流。在進(jìn)化樹的分支中，接壤國家之間的菌株同源性相對較高，說明埃希氏菌在陸地之間傳播的可能性更高，但是不接壤國家間也存在同源性極高的菌株，不排除埃希氏菌間接傳播的可能。本研究在國內(nèi)首先開展埃希氏菌屬遺傳演化關(guān)系分析，從分子水平闡明各個菌株流行分布規(guī)律，為更好預(yù)防埃希氏菌病傳播提供理論依據(jù)。