趙 凱 樊 艷 鄒圣強(qiáng) 郇旭輝 杜淑輝 韓有志 王升級

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院 太谷 030801)

植物由于自身生長的固著性，在自然環(huán)境中非常容易遭受到逆境脅迫的影響。隨著全球氣候環(huán)境的不斷惡化，逆境脅迫對植物生長發(fā)育造成的影響越來越嚴(yán)重(Lobelletal., 2011)。在長期適應(yīng)的過程中，植物已經(jīng)進(jìn)化出了一系列分子機(jī)制來應(yīng)對這些逆境脅迫，涉及到許多復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(Luetal., 2018)。轉(zhuǎn)錄因子基因因其強(qiáng)大的調(diào)控功能，在植物應(yīng)對生物及非生物脅迫方面發(fā)揮了重要的作用，植物中過量或抑制表達(dá)一些脅迫應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子基因會對其抗逆能力產(chǎn)生顯著影響。

MYB轉(zhuǎn)錄因子家族是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，隨著1982年在禽成髓細(xì)胞瘤病毒中發(fā)現(xiàn)首個MYB家族基因v-myb(Klempnaueretal., 1982)，以及1987年從玉米(Zeamays)中鑒定出首個植物MYB基因ZmMYBC1(Paz-Aresetal., 1987)，越來越多的MYB家族基因被挖掘。MYB轉(zhuǎn)錄因子包含高度保守的由1～4個不完全相同的R序列重復(fù)組成的MYB結(jié)構(gòu)域(Dubosetal., 2010)。每一個R序列由約52個氨基酸構(gòu)成，形成3個α螺旋，其中規(guī)則間隔的色氨酸殘基可與第2和第3螺旋形成螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋(HTH)結(jié)構(gòu)疏水核心(Dubosetal., 2010; Kanei-Ishiietal., 1990)。在以往的研究中，根據(jù)MYB結(jié)構(gòu)域中R序列重復(fù)的數(shù)量，將該家族成員分為MYB-related、R2R3-MYB、3R-MYB和4R-MYB 4個亞家族。

MYB轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控多種重要的生物學(xué)過程。植物中4R-MYB蛋白的數(shù)量很少，到目前為止很少有人關(guān)注，其中擬南芥(Arabidopsisthaliana)4R-MYB蛋白AtSNAPc4在配子體和受精卵發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用(Thiedigetal., 2020)。植物3R-MYB亞家族同樣具有較少的成員，參與調(diào)控植物生長發(fā)育及非生物脅迫應(yīng)答等過程(Fengetal., 2017)。水稻(Oryzasativa)OsMYB3R-2不僅參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期過程，還可以正向調(diào)控植物的耐寒性(Maetal., 2009)。在擬南芥中過表達(dá)TaMYB3R1會導(dǎo)致植物在生殖階段發(fā)育遲緩，但對干旱和鹽脅迫的耐受能力增強(qiáng)(Caietal., 2015)。玉米3R-MYB轉(zhuǎn)錄因子基因ZmMYB3R可被干旱、鹽、脫落酸處理誘導(dǎo)表達(dá)，過表達(dá)該基因可以增強(qiáng)植物對干旱和鹽脅迫的耐受能力(Wuetal., 2019)。R2R3-MYB亞家族是MYB家族中成員最多、研究最為廣泛的亞家族，有研究表明全基因組復(fù)制事件和基因片段重復(fù)事件是導(dǎo)致該亞家族擴(kuò)張的主要原因(Duetal., 2015)。許多R2R3-MYB蛋白都可以與MYB-core和AC-rich元件結(jié)合，在植物生長發(fā)育及脅迫應(yīng)答等諸多方面發(fā)揮重要作用(Millardetal., 2019)。R2R3-MYB蛋白AtMYB12和AtMYB111可以調(diào)控?cái)M南芥根和葉中類黃酮的生物合成(Strackeetal., 2007)。楊樹(Populusspp.)PtoMYB216可以激活木質(zhì)素生物合成過程，參與調(diào)控其木材形成(Tianetal., 2013)。白樺BplMYB46可以調(diào)控植物次生壁生物合成及對鹽和滲透脅迫的耐受性(Guoetal., 2017)。MYB-related蛋白屬于MYB家族的第2大亞家族，隨著首個植物MYB-related蛋白馬鈴薯(Solanumtuberosum)MybSt1被鑒定(Baranowskijetal., 1994)，不同物種中的該亞族蛋白也逐漸被分離出來。結(jié)構(gòu)多樣的MYB-related蛋白可以被分為CCA1-like/R-R、CPC-like、TBP-like、I-box-like、TRF-like和GARP 6個亞家族(Yangetal., 2021)，同樣參與調(diào)控植物生長發(fā)育過程與脅迫應(yīng)答。MYB-related蛋白CCA1 和 LHY可以協(xié)同調(diào)控?cái)M南芥晝夜節(jié)律(Luetal., 2009)。過表達(dá)CCA1還會導(dǎo)致擬南芥的下胚軸變長，開花時(shí)間推遲(Luetal., 2012)。葡萄GARP 型轉(zhuǎn)錄因子VaAQUILO可以正向調(diào)控植物對寒冷的耐受性(Sunetal., 2018)。近年來圍繞MYB-related蛋白開展了一些研究，也對楊樹MYB-related轉(zhuǎn)錄因子家族及其基因表達(dá)模式進(jìn)行系統(tǒng)的分析(Yangetal., 2021)，但楊樹中關(guān)于該亞族成員的研究鮮有報(bào)道。

土壤鹽堿化是全球性環(huán)境問題，且在我國的許多省區(qū)均有分布，總面積已經(jīng)達(dá)到了9 900萬公頃(廖婕等, 2021)。楊樹生長快，適應(yīng)性強(qiáng)，分布廣闊，被廣泛用于綠化、造林和制造業(yè)，是重要的經(jīng)濟(jì)用材樹種。而土壤鹽堿化極大地限制了楊樹的生長發(fā)育及空間分布，而氣候異常、工業(yè)污染、灌溉施肥方式不當(dāng)?shù)雀黝愐蛩赜绊懯惯@一情況越來越嚴(yán)峻(冷春旭等, 2020)。因此，鑒定出關(guān)鍵的楊樹鹽脅迫應(yīng)答基因并解析其作用機(jī)制具有重要意義。本研究通過對轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)一個銀腺楊84K(Populusalba×P.glandulosa‘84K’)新的鹽脅迫應(yīng)答基因PagMYBR96，對該基因進(jìn)行克隆，得到其蛋白序列，利用生物信息學(xué)分析揭示了其蛋白特征。通過亞細(xì)胞定位及轉(zhuǎn)錄激活活性分析發(fā)現(xiàn)該蛋白為核定位蛋白，但在酵母中沒有自激活活性?；驎r(shí)空表達(dá)模式分析結(jié)果表明，PagMYBR96在葉和根中具有相似的表達(dá)模式，均在鹽脅迫前期上調(diào)表達(dá)隨后恢復(fù)。通過對24份轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到了518個PagMYBR96的共表達(dá)基因，利用基因功能注釋及富集分析初步揭示了他們的分子功能及參與到的生物學(xué)過程，可為深入探究PagMYBR96基因功能及其調(diào)控機(jī)制，利用基因工程技術(shù)改善楊樹抗逆能力提供理論支持和基因資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

植物材料為在溫室中生長1個月的84K楊組培苗，培養(yǎng)條件如下： 光照/黑暗周期為16 h/8 h，平均溫度為25 ℃，相對濕度為60%～70%。

1.2 基因克隆

通過在Phytozeme數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索(Goodsteinetal., 2012)，得到PagMYBR96在毛果楊(Populustrichocarpa)中的同源基因PtrMYBR96(Potri.010G193000.1)的轉(zhuǎn)錄本序列，在5′ 和3′ UTR區(qū)設(shè)計(jì)基因擴(kuò)增引物PagMYBR96-F和PagMYBR96-R(表1)。剪取84K楊組培苗葉片組織，速凍于液氮中后，使用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit試劑盒提取樣品RNA，然后使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以該cDNA為模板，使用設(shè)計(jì)好的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。得到目標(biāo)片段后，將其與pMD19-T載體連接后送至生物公司進(jìn)行測序。將測得的序列與PtrMYBR96轉(zhuǎn)錄本序列進(jìn)行比對，確定PagMYBR96的編碼區(qū)序列。

表1 本研究使用的引物Tab.1 Primer sequences used in this study

1.3 生物信息學(xué)分析

使用ProtParam工具對蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進(jìn)行分析(Gasteigeretal., 2005)。在NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的blastp對同源蛋白進(jìn)行檢索。使用BioEdit軟件進(jìn)行序列相似性比較及可視化分析(Hall, 1999)。使用SMS工具對構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的最佳模型進(jìn)行篩選(Lefortetal., 2017)。使用MEGA11、極大似然法、1 000次重復(fù)的bootstrap測試、SMS工具篩選出的最佳模型進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建(Koichiroetal., 2021)。使用ProtScale工具進(jìn)行蛋白親疏水性分析(Gasteigeretal., 2005)。使用Tmpred工具對蛋白的跨膜區(qū)域進(jìn)行預(yù)測(Hofmannetal., 1993)。使用在線軟件SignalP 4.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)對蛋白的信號肽進(jìn)行預(yù)測。使用在線工具NetPhos 3.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)對蛋白的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測。使用在線工具SOPMA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)對蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。使用在線軟件ProtComp(http://linux1.softberry.com/berry.Phtml?topic=protcomppl&group=programs&subgroup=proloc)和WoLF PSORT(https://wolf psort.hgc.jp/)對蛋白的亞細(xì)胞定位情況進(jìn)行預(yù)測。

1.4 亞細(xì)胞定位

為了對PagMYBR96的亞細(xì)胞定位情況進(jìn)行分析，構(gòu)建了GFP蛋白融合表達(dá)載體。首先，去掉PagMYBR96基因編碼區(qū)序列的終止密碼子，然后設(shè)計(jì)酶切引物(表1)，以PagMYBR96的T載質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，收回目標(biāo)片段。使用XbaI和SalI對收回的基因片段和pBI121-GFP空載質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切。使用T4 DNA連接酶對酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌(Escherichiacoli)后，對陽性克隆進(jìn)行測序確認(rèn)。提取構(gòu)建成功的pBI121-PagMYBR96-GFP質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌(Agrobacterium)EHA105中，使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草(Nicotianatabacum)葉片瞬時(shí)轉(zhuǎn)化試驗(yàn)進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，具體步驟參考之前的研究(趙凱, 2021)。

1.5 轉(zhuǎn)錄激活活性分析

為探究PagMYBR96蛋白是否具有自激活活性，使用酵母(Saccharomyces)試驗(yàn)對其進(jìn)行分析。首先，基于PagMYBR96的編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)同源融合引物(表1)。以PagMYBR96的T載質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后收回目標(biāo)片段。使用BamH I對pGBKT7空載質(zhì)粒進(jìn)行酶切，利用同源重組試劑盒將目標(biāo)片段整合到pGBKT7載體上。提取構(gòu)建成功的pGBKT7-PagMYBR96載體質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)入到Y(jié)2Hgold酵母細(xì)胞中。在SD/-Trp和SD/-Trp/-His/-Ade/X-α-Gal固體培養(yǎng)基上對轉(zhuǎn)入不同質(zhì)粒的酵母細(xì)胞進(jìn)行劃線培養(yǎng)，通過觀察細(xì)胞的生長情況來判斷蛋白是否具有轉(zhuǎn)錄激活活性。轉(zhuǎn)入pGBKT7空載質(zhì)粒的Y2Hgold酵母細(xì)胞用作陰性對照，轉(zhuǎn)入pGBKT7-53/pGADT7-T載體的Y2Hgold酵母細(xì)胞用作陽性對照。

1.6 基因表達(dá)模式分析

為了探究PagMYBR96基因?qū)}脅迫的應(yīng)答情況，對該基因在鹽脅迫條件下的時(shí)空表達(dá)模式進(jìn)行分析。首先，將在組培瓶中生長1個月的84K楊野生型幼苗移栽到土盆中，在溫室中繼續(xù)培養(yǎng)1個月。將生長健壯的植株分為6組(每組8株)，使用150 mmol·L-1NaCl溶液分別脅迫處理3、6、12、24和48 h，水處理作為對照，設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。處理結(jié)束后，同時(shí)收集植株的葉和根組織，提取RNA后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用表1中設(shè)計(jì)好的定量引物進(jìn)行RT-qPCR試驗(yàn)，Actin基因用作內(nèi)參基因。以基因在對照樣品中的表達(dá)水平為基準(zhǔn)，用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對表達(dá)水平。使用IBM SPSS Statistics 21.0 (http://www.ibm.com/us/en/)對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(t檢驗(yàn)，P<0.05)。

1.7 基因共表達(dá)分析

利用美吉生物云平臺(www.majorbio.com)對基因表達(dá)相關(guān)性進(jìn)行分析，挖掘與PagMYBR96具有相似表達(dá)模式的基因。基于實(shí)驗(yàn)室前期研究中測得的24個樣品的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，包含鹽脅迫處理的根、莖、葉、芽組織及對照樣品。各個樣品中的基因表達(dá)量(TPM值)之和≥10的基因被用于表達(dá)相關(guān)性分析，相關(guān)性算法為Spearman，相關(guān)性系數(shù)為0.8，多重檢驗(yàn)校正方法為Benjamini-Hochberg，閾值為padj值≤0.05。

1.8 基因功能注釋與富集分析

利用美吉生物云平臺(www.majorbio.com)對上一步分析中獲得的共表達(dá)基因集進(jìn)行GO功能注釋、GO富集分析和KEGG富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 84K楊PagMYBR96基因克隆及其氨基酸理化性質(zhì)分析

以84K楊的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長度約為1 388 bp的DNA片段。隨后，通過與PtrMYBR96的轉(zhuǎn)錄本序列進(jìn)行比對，得到長度為882 bp的PagMYBR96編碼區(qū)序列(GenBank登錄號： ON862133)。通過對該基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)PagMYBR96蛋白由293個氨基酸組成，分子質(zhì)量為33 306.33 Da，理論等電點(diǎn)為 6.32，分子式為 C1475H2283N413O453S8，總原子數(shù)為 4 632，脂肪系數(shù)為 67.54。該蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)(II)為43.10，總平均親水性為-0.707，表明其為不穩(wěn)定的親水性蛋白質(zhì)。

2.2 生物信息學(xué)分析

通過NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的blastp對PagMYBR96蛋白的氨基酸序列進(jìn)行檢索，得到10個不同物種中與其同源性最高的蛋白。通過系統(tǒng)發(fā)育分析這些蛋白之間的進(jìn)化關(guān)系。由圖1可知，84K楊PagMYBR96與長梗柳(Salixdunnii)中的MYB蛋白的親緣關(guān)系最近，與麻風(fēng)樹(Jatrophacurcas)、蓖麻(Ricinuscommunis)、木薯(Manihotesculenta)、橡膠樹(Heveabrasiliensis)中的MYB蛋白的親緣關(guān)系較近，而與楊梅(Morellarubra)、歐洲栓皮櫟(Quercussuber)、克萊門柚(Citrusclementina)、哥倫比亞錦葵(Herraniaumbratica)、榴蓮(Duriozibethinus)中的MYB蛋白的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖1A)。多序列比對的結(jié)果顯示，這些蛋白均含有保守的MYB結(jié)構(gòu)域和特征氨基酸(2個色氨酸和1個丙氨酸)(圖1B)。此外，包括PagMYBR96在內(nèi)的9個蛋白均含有保守的SHAQKYF基序，表明它們屬于CCA1-like/R-R亞家族(圖1B)。

圖1 不同物種中MYB蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析及多序列比對Fig.1 Multiple sequence alignment and phylogenetic analysis of MYB proteins of different speciesA: PagMYBR96及其同源蛋白間的系統(tǒng)發(fā)育分析； B: PagMYBR96及其同源蛋白的氨基酸序列比對結(jié)果。A: Phylogenetic analysis of PagMYBR96 and its homologous proteins; B: Multiple sequence alignment results of the amino acid sequences of PagMYBR96 and its homologous proteins.

通過對PagMYBR96蛋白的親疏水性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白可能是親水性蛋白質(zhì)，這與蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析的結(jié)果一致?？缒^(qū)域分析結(jié)果顯示，PagMYBR96蛋白沒有跨膜區(qū)域。

信號肽一般位于蛋白的N端，也可分布于蛋白的其他位置，長度變化較大，由15～50個以上氨基酸構(gòu)成，具有蛋白質(zhì)定向轉(zhuǎn)運(yùn)的功能(彭佳師等, 2011)。信號肽預(yù)測結(jié)果表明，PagMYBR96蛋白中不存在信號肽。

蛋白質(zhì)磷酸化主要發(fā)生在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸上，是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的主要方式，在調(diào)節(jié)植物生命過程方面發(fā)揮重要作用(趙曉亭等, 2021)。通過對PagMYBR96蛋白的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測發(fā)現(xiàn)，該蛋白存在20個絲氨酸位點(diǎn)，11個蘇氨酸位點(diǎn)，3個酪氨酸位點(diǎn)。

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測的結(jié)果顯示，PagMYBR96蛋白中參與形成無規(guī)則卷曲的氨基酸最多，為163個，占到氨基酸總數(shù)的55.63%； 參與形成β-轉(zhuǎn)角的氨基酸數(shù)量最少，為8個(2.73%)； 此外，還有72個氨基酸(24.57%)參與形成α-螺旋，50個氨基酸(17.06%)參與形成延伸鏈。

2.3 PagMYBR96的亞細(xì)胞定位

在線軟件ProtComp和WoLF PSORT的預(yù)測結(jié)果表明，與大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子一樣，PagMYBR96也定位在細(xì)胞核中。為了對預(yù)測結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化試驗(yàn)在煙草葉片中表達(dá)PagMYBR96-GFP融合蛋白，并在激光共聚焦顯微鏡下觀察。如圖2所示，對照35 S:GFP蛋白的熒光信號可以在整個細(xì)胞中觀察到，而PagMYBR96-GFP融合蛋白的熒光信號只存在于細(xì)胞核中。以上試驗(yàn)結(jié)果表明，PagMYBR96是一個核定位蛋白，這與預(yù)測的結(jié)果一致。

圖2 PagMYBR96蛋白的亞細(xì)胞定位Fig.2 Subcellular localization of PagMYBR96 proteinA, D: GFP熒光； B, E: 明場； C, F: GFP熒光和明場的組合圖。A, D: GFP fluorescence; B, E: Bright field; C, F: Combination of GFP fluorescence and bright field.

2.4 PagMYBR96的轉(zhuǎn)錄激活活性分析

為了探究PagMYBR96蛋白是否具有轉(zhuǎn)錄激活活性，將PagMYBR96基因的編碼區(qū)序列連入pGBKT7 載體，并將pGBKT7-PagMYBR96質(zhì)粒、pGBKT7空載質(zhì)粒(陰性對照)和pGBKT7-53/pGADT7-T質(zhì)粒(陽性對照)分別轉(zhuǎn)入Y2HGold酵母菌株。挑取轉(zhuǎn)化成功的酵母細(xì)胞振蕩培養(yǎng)，并分別接種到SD/-Trp和SD/-Trp/-His/-Ade/X-α-Gal 固體培養(yǎng)基上觀察生長狀態(tài)。由圖3可知，含有pGBKT7-PagMYBR96質(zhì)粒的酵母細(xì)胞與陰性對照一樣只能在SD/-Trp固體培養(yǎng)基上生長，而不能在SD/-Trp/-His/-Ade/X-α-Gal 固體培養(yǎng)基上生長； 而陽性對照可以在兩種培養(yǎng)基上生長，并在SD/-Trp/-His/-Ade/X-α-Gal 固體培養(yǎng)基上變藍(lán)。以上結(jié)果表明，PagMYBR96蛋白在酵母中沒有轉(zhuǎn)錄激活活性。

圖3 PagMYBR96的轉(zhuǎn)錄激活活性分析Fig.3 Transcriptional activation activity analysis of PagMYBR96

2.5 PagMYBR96基因應(yīng)答鹽脅迫的時(shí)空表達(dá)模式分析

轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析表明PagMYBR96基因可以在84K楊葉片中應(yīng)答鹽脅迫，使用RT-qPCR對基因的表達(dá)水平進(jìn)行分析，該基因應(yīng)答鹽脅迫的時(shí)空表達(dá)模式。試驗(yàn)結(jié)果表明，在鹽脅迫條件下，PagMYBR96基因在84K楊的葉和根中整體呈現(xiàn)先升高后回調(diào)的表達(dá)模式，且均在鹽脅迫處理12 h時(shí)達(dá)到最高的表達(dá)水平(圖4)。此外，PagMYBR96基因在根中的上調(diào)表達(dá)程度大于葉片，在鹽脅迫處理6 h和12 h時(shí)該基因分別上調(diào)表達(dá)了3.62和7.28倍，均高于鹽脅迫處理后葉片中的最高表達(dá)水平(2.45倍)。

圖4 PagMYBR96基因應(yīng)答鹽脅迫的時(shí)空表達(dá)模式分析Fig.4 Temporal and spatial expression pattern analysis of PagMYBR96 gene in response to salt stress使用150 mmol·L-1 NaCl溶液進(jìn)行鹽脅迫處理，以未脅迫處理的樣品中基因的表達(dá)水平為基準(zhǔn)計(jì)算其他樣品中基因的相對表達(dá)水平，星號代表處理樣品與對照樣品間有顯著差異(t檢驗(yàn)，P <0.05)。150 mmol·L-1 NaCl solution was used for salt stress treatment. The relative expression levels of genes were calculated based on the expression levels of genes in untreated samples. The asterisk represents a significant difference between the treated sample and the control sample (t test, P <0.05).

2.6 基因共表達(dá)分析

共表達(dá)分析可以挖掘到一些具有相似表達(dá)模式的基因，這些基因的功能可能是緊密相關(guān)的，也可能參與到一些相同的信號通路或生理過程(Zhaoetal., 2021)。基于本課題組前期研究中的24個樣品的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)(樊艷等, 2021)，建立以PagMYBR96為中心的基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。如圖5A所示，共鑒定出518個與PagMYBR96共表達(dá)的基因，其中有29個為轉(zhuǎn)錄因子基因(表2)，這些基因可能與其介導(dǎo)的一些重要的生物學(xué)過程相關(guān)。

2.7 基因功能注釋與富集分析

為了探究PagMYBR96及其共表達(dá)基因的分子功能及參與到的生物學(xué)過程，對這些基因進(jìn)行GO注釋分析。結(jié)果表明，PagMYBR96及其共表達(dá)基因與催化活性、轉(zhuǎn)運(yùn)活性、結(jié)構(gòu)分子活性和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性等功能相關(guān)，主要參與到細(xì)胞過程、代謝過程、生物調(diào)節(jié)、對刺激應(yīng)答和發(fā)育過程等(圖5B)。基因富集分析的結(jié)果顯示，PagMYBR96及其共表達(dá)基因顯著富集到類泛素蛋白結(jié)合酶活性、類泛素蛋白轉(zhuǎn)移酶活性、泛素蛋白轉(zhuǎn)移酶活性、泛素結(jié)合酶活性等GO term中(圖5C)。此外，這些基因還被顯著富集到氨酰-tRNA生物合成、泛素介導(dǎo)的蛋白水解和丙酮酸代謝等通路中(圖5D)。

圖5 基因共表達(dá)及富集分析Fig.5 Gene co-expression and enrichment analysisA: 以PagMYBR96為中心的基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)； B: 共表達(dá)基因集的GO注釋分析； C: 共表達(dá)基因集的GO富集分析； D: 共表達(dá)基因集的KEGG富集分析。A: Gene co-expression network centered on PagMYBR96; B: GO annotation analysis of co-expressed gene set; C: GO enrichment analysis of co-expressed gene set; D: KEGG enrichment analysis of co-expressed gene set.

3 討論

植物MYB-related轉(zhuǎn)錄因子亞家族成員眾多，廣泛參與到晝夜節(jié)律、次生代謝及細(xì)胞和器官形態(tài)建成等生理過程(Yangetal., 2021)。隨著對MYB家族和MYB-related亞家族進(jìn)行深入分析，MYB-related蛋白的特征、基因表達(dá)模式及可能參與到的生物學(xué)過程也逐漸被揭示。但是相較于對R2R3-MYB蛋白在調(diào)節(jié)花青素、木質(zhì)素和次生壁合成等方面的深入研究，關(guān)于MYB-related蛋白的功能分析及調(diào)控機(jī)制的研究是有限的。對毛果楊MYB-related基因家族進(jìn)行綜合分析將這些成員分為6組，并對其組織差異表達(dá)模式及脅迫應(yīng)答情況進(jìn)行了系統(tǒng)的分析，發(fā)現(xiàn)這些基因可能參與抗氧化防御系統(tǒng)和各種信號通路的調(diào)節(jié)(Yangetal., 2021)。但目前對楊樹MYB-related蛋白的功能分析卻鮮有報(bào)道。本研究通過對轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，挖掘到一個應(yīng)答鹽脅迫的84K楊MYB-related基因PagMYBR96，隨后將其克隆出來并進(jìn)行了較為系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析。亞細(xì)胞定位試驗(yàn)的結(jié)果表明，PagMYBR96蛋白同大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子一樣，定位在細(xì)胞核中，可能在細(xì)胞核中發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控的功能。自激活活性分析試驗(yàn)表明PagMYBR96蛋白在酵母中沒有轉(zhuǎn)錄激活活性，這一結(jié)果表明該蛋白可能需要在植物體內(nèi)進(jìn)行翻譯后修飾來獲得轉(zhuǎn)錄激活活性或與其他具有轉(zhuǎn)錄激活活性的蛋白相互作用從而起到轉(zhuǎn)錄激活作用。基因時(shí)空表達(dá)模式分析試驗(yàn)結(jié)果表明，PagMYBR96在84K楊的葉和根中均可以應(yīng)答鹽脅迫，且具有相似的表達(dá)模式。此外，鹽脅迫條件下該基因在根中的上調(diào)表達(dá)程度高于葉片，這可能與根組織直接暴露于脅迫處理下有關(guān)。以上的研究結(jié)果均表明PagMYBR96可能在楊樹鹽脅迫應(yīng)答方面發(fā)揮重要的作用，因此本研究對24份轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘，利用基因共表達(dá)分析將未知功能的基因與生物過程聯(lián)系起來。

通過對26 583個基因在24個測序樣品中的表達(dá)情況進(jìn)行分析，共鑒定到518個與PagMYBR96共表達(dá)的基因。通過對這些基因進(jìn)行注釋，發(fā)現(xiàn)其中有29個轉(zhuǎn)錄因子基因，涉及21個轉(zhuǎn)錄因子家族，包括一些常見的AP2、bHLH、bZIP、MYB、NAC等家族成員。通過對這些基因進(jìn)行檢索發(fā)現(xiàn)它們參與到許多不同的生物學(xué)過程。PtrARF2.2下調(diào)表達(dá)會導(dǎo)致葉片表型輕微變化(Fuetal.， 2019)。Potri.015G105200是ICEs的直系同源基因，在冷脅迫條件下上調(diào)表達(dá)(楊艷梅, 2019)。PtrAREB1-4是擬南芥抗旱基因AtAREB1的同源基因，可以被干旱脅迫高度誘導(dǎo)表達(dá)(Lietal.， 2018)。PtrGATA34是楊樹 GATA 亞家族 III 基因，在啟動子序列中具有CGTCA 基序和 TGACG 基序，可能參與茉莉酸應(yīng)答反應(yīng)(Anetal., 2019)。小黑楊(Populussimonii×P.nigra)PsnHSF20在高溫和鹽脅迫處理?xiàng)l件下顯著上調(diào)表達(dá)(王雪怡等, 2021)。楊樹MYB-related蛋白LHY2在晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用，抑制該基因的表達(dá)會導(dǎo)致植物生物量降低(Edwardsetal.， 2018)。PtrNF-X1-4在楊樹的韌皮部表達(dá)量較高(Heetal.， 2021)。PtrGRF1/2b在休眠芽和幼葉中高表達(dá)，且與GIF基因共表達(dá)(Zhangetal.， 2021)。Potri.011G096600是楊樹葉片發(fā)育調(diào)控因子miR319a可能的靶基因(Chengetal., 2021)。通過對這些共表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子基因在擬南芥中的同源基因進(jìn)行檢索，發(fā)現(xiàn)一些在植物應(yīng)對非生物脅迫過程中發(fā)揮重要功能的基因。如，在冷脅迫應(yīng)答過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的基因AtICE1和AtMYC70； 可增強(qiáng)植物抗旱性的基因AtAREB1和AtHSFA1b。以上研究結(jié)果表明，PagMYBR96很可能在楊樹生長發(fā)育及脅迫應(yīng)答方面發(fā)揮重要作用。

為了進(jìn)一步探究PagMYBR96與其共表達(dá)基因參與到的生物學(xué)過程，對這些基因進(jìn)行GO注釋分析。這些基因廣泛參與到細(xì)胞過程、代謝過程、生物調(diào)節(jié)、對刺激應(yīng)答和發(fā)育過程等重要的生物學(xué)過程中，表明這些基因具有重要的功能。GO富集分析的結(jié)果顯示，這些基因被顯著富集到類泛素蛋白結(jié)合酶活性、類泛素蛋白轉(zhuǎn)移酶活性、泛素蛋白轉(zhuǎn)移酶活性和泛素結(jié)合酶活性等GO term中。泛素蛋白酶體系統(tǒng)是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的主要途徑，廣泛存在于真核生物中，在植物生長發(fā)育和逆境脅迫應(yīng)答方面起到關(guān)鍵作用。泛素結(jié)合酶(E2)是泛素蛋白酶體系統(tǒng)的重要組成部分，在植物應(yīng)對非生物脅迫過程中發(fā)揮重要作用(張洪雨等, 2020)。值得注意的是，KEGG富集分析同樣將這些基因富集到泛素介導(dǎo)的蛋白水解通路中。以上結(jié)果表明，PagMYBR96與其共表達(dá)基因在植物生長發(fā)育及逆境應(yīng)答方面發(fā)揮重要作用，且與泛素蛋白酶體系統(tǒng)介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解過程相關(guān)。此外，這些基因還被顯著富集到氨酰-tRNA生物合成和丙酮酸代謝等通路中，其中丙酮酸作為糖酵解的終產(chǎn)物和線粒體呼吸的主要底物，在碳代謝調(diào)節(jié)過程中起到重要作用(Leetal., 2021)，這也是今后研究中應(yīng)探索的方向。本研究為解析楊樹MYB-related基因的功能及調(diào)控機(jī)制提供了基礎(chǔ)，也為楊樹抗逆分子育種提供了科學(xué)依據(jù)與基因資源。

4 結(jié)論

基于轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析，在銀腺楊84K中鑒定到一個應(yīng)答鹽脅迫的MYB-related基因PagMYBR96，其編碼區(qū)序列為882 bp，編碼293個氨基酸，含有一個保守的MYB結(jié)構(gòu)域和特征氨基酸。該基因在銀腺楊84K的根和葉中均可應(yīng)答鹽脅迫，且呈現(xiàn)出脅迫前期上調(diào)表達(dá)隨后漸漸恢復(fù)的表達(dá)模式，其編碼蛋白為核定位蛋白且在酵母中沒有轉(zhuǎn)錄激活活性。與PagMYBR96共表達(dá)的518個基因中包含29個與植物生長發(fā)育及脅迫應(yīng)答密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子基因，且被顯著富集到在植物中發(fā)揮重要作用的丙酮酸代謝及泛素蛋白酶體系統(tǒng)相關(guān)的GO term及通路中。