湯娜娜，張海玲，蔣波，王曉松，王曉燕

宿遷市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科，江蘇宿遷 223800

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2020年我國(guó)結(jié)直腸癌新發(fā)病例約55.5 萬例，正以每年7.4%的速度快速攀升［1］。近年來，隨著腫瘤篩查項(xiàng)目不斷推廣，越來越多結(jié)直腸癌患者得以被早發(fā)現(xiàn)、早治療。因此，我國(guó)結(jié)直腸癌的死亡率已有所下降，但仍遠(yuǎn)高于歐美發(fā)達(dá)國(guó)家［2］。迄今為止，結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，故深入探索結(jié)直腸癌發(fā)病的分子機(jī)制，對(duì)早期篩查和研發(fā)靶向藥物具有重要意義。微小RNA（miRNA）是一種內(nèi)源性非編碼小RNA 分子，能夠在翻譯水平上調(diào)控多種基因的表達(dá)，不僅參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生命活動(dòng)，還參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［3］。miR-144-5p、miR-876-5p 是新近發(fā)現(xiàn)的miRNA 家族成員。有研究報(bào)道，miR-144-5p在胃癌、甲狀腺癌等惡性腫瘤中異常表達(dá)［4-5］，miR-876-5p 在膀胱癌、肝癌等惡性腫瘤中異常表達(dá)［6-7］。提示miR-144-5p、miR-876-5p 能夠參與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。近年研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌細(xì)胞中miR-144-5p、miR-876-5p異常表達(dá)，其異常表達(dá)能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移［8-9］。但鮮有二者表達(dá)與直腸癌患者臨床病理特征和預(yù)后關(guān)系的報(bào)道。本研究探討了直腸癌患者血清miR-144-5p、miR-876-5p 表達(dá)變化及其與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年1月—2019年8月宿遷市第一人民醫(yī)院收治的直腸癌患者85 例（觀察組）。直腸癌診斷依據(jù)《中國(guó)結(jié)直腸癌診療規(guī)范（2015 版）》［10］，并經(jīng)術(shù)后組織病理檢查明確診斷。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合直腸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)；②初診，入院前未接受任何抗腫瘤治療；③臨床病理資料和術(shù)后隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎等其他腸道疾病者；②合并其他部位惡性腫瘤者；③年齡＜18 歲者；④合并全身感染性疾病、自身免疫性疾病者；⑤院內(nèi)死亡者；⑥妊娠期或哺乳期婦女。其中，男48 例、女37 例，年齡44～82（60.18 ±6.15）歲；腫瘤最大徑：≥4 cm 42 例，＜4 cm 43 例；組織分化程度：低分化42 例，中高分化43 例；浸潤(rùn)深度：T1、T232 例，T3、T453 例；TNM 分期：Ⅰ、Ⅱ期37例，Ⅲ、Ⅳ期48 例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移43 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移42 例。同期另選在宿遷市第一人民醫(yī)院體檢健康的志愿者52 例（對(duì)照組），男29 例、女23 例，年齡27～78（60.52 ± 5.32）歲。兩組性別、年齡具有可比性。本研究經(jīng)宿遷市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（審批編號(hào)：2019-124），所有研究對(duì)象或其家屬知情同意并簽署書面知情同意書。

1.2 血清miR-144-5p、miR-876-5p表達(dá)檢測(cè) 觀察組入院次日、對(duì)照組體檢當(dāng)日，采集清晨空腹外周靜脈血3 mL，1 500×g 離心15 min，留取上層血清。采用TRIzol 法提取血清總RNA，經(jīng)超微量分光光度計(jì)鑒定，提取的總RNA 純度和濃度合格。按TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄條件：42 ℃ 1 h，95 ℃ 5 min。以cDNA 為模板，按SYBR?Premix Ex Taq?試劑盒說明進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。所有引物序列由南京金斯瑞生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成。miR-144-5p 上游引物5′-CTACGCTCCGT?GAGATGTGCT-3′、下游引物5′-TAGCACTCAGTAT?GATAACTA-3′，內(nèi)參U6 上游引物5′-CTCGCTTCG?GCACACA-3′、下游引物5′-AACGCTTCACGAATT?GCGT-3′；miR-876-5p 上游引物5′-TGAAGTGCTGT?GGATTTCTTTGTG-3′、下游引物5′-TGAATTACTTT?GTAAACCACCACCA-3′，內(nèi)參U6 上游引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACT-3′、下游引物5′-GT?GCAGGGTCCGAGGTATTC-3′。PCR 反應(yīng)體系共20.0 μL：SYBR?Premix Ex Taq 10.0 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA 模板2.0 μL、50×ROX Reference Dye 0.4 μL，RNase Free H2O 6.0 μL；反應(yīng)條件：95 ℃ 90 s，95 ℃ 30 s、63 ℃ 30 s、72 ℃ 15 s共40個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束，繪制熔解曲線，收集循環(huán)閾值（CT）數(shù)。以U6 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算血清miR-144-5p、miR-876-5p相對(duì)表達(dá)量。

1.3 隨訪 直腸癌患者術(shù)后通過門診復(fù)查或電話形式定期隨訪3年，隨訪截至2022年8月，統(tǒng)計(jì)患者死亡情況，計(jì)算3年生存率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS28.0 統(tǒng)計(jì)軟件。正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，結(jié)果比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。預(yù)測(cè)效能分析采用受試者工作特征（ROC）曲線，曲線下面積（AUC）比較采用Hanley & McNeil 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清miR-144-5p、miR-876-5p表達(dá)比較 觀察組血清miR-144-5p、miR-876-5p相對(duì)表達(dá)量分別為1.10 ± 0.22、1.45 ± 0.44，對(duì)照組分別為1.84 ±0.42、2.12 ± 0.31。觀察組血清miR-144-5p、miR-876-5p 相對(duì)表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組（t分別為11.786、10.504，P均＜0.05）。

2.2 血清miR-144-5p、miR-876-5p表達(dá)與直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系 見表1。

表1 血清miR-144-5p、miR-876-5p表達(dá)與直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3 血清miR-144-5p、miR-876-5p表達(dá)與直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系 85 例直腸癌患者共隨訪5～36 個(gè)月，至隨訪截至日期，死亡20 例，3年生存率為76.47%（65/85）。以血清miR-144-5p、miR-876-5p表達(dá)的平均值為界，將直腸癌患者分為miR-144-5p高表達(dá)者（miR-144-5p 相對(duì)表達(dá)量≥1.10）43 例與miR-144-5p 低表達(dá)者（miR-144-5p 相對(duì)表達(dá)量＜1.10）42 例、miR-876-5p 高表達(dá)者（miR-876-5p 相對(duì)表達(dá)量≥1.45）46 例與miR-876-5p 低表達(dá)者（miR-876-5p 相對(duì)表達(dá)量＜1.45）39 例。miR-144-5p 高表達(dá)者3年生存率為88.37%（38/43），miR-144-5p 低表達(dá)者為64.29%（27/42），miR-144-5p 高表達(dá)者3年生存率顯著高于miR-144-5p低表達(dá)者（χ2=4.368，P＜0.05）；miR-876-5p 高表達(dá)者3年生存率為86.96%（40/46），miR-876-5p 低表達(dá)者為64.10%（25/39），miR-876-5p 高表達(dá)者3年生存率顯著高于miR-876-5p低表達(dá)者（χ2=4.286，P＜0.05）。

2.4 血清miR-144-5p、miR-876-5p表達(dá)對(duì)直腸癌患者預(yù)后不良的預(yù)測(cè)價(jià)值 ROC 曲線分析顯示，血清miR-144-5p 表達(dá)預(yù)測(cè)直腸癌患者預(yù)后不良的AUC為0.781（95%CI：0.678～0.864），最佳截?cái)嘀禐?.19，此時(shí)其預(yù)測(cè)直腸癌患者預(yù)后不良的靈敏度為95.00%、特異度為46.15%；血清miR-876-5p表達(dá)預(yù)測(cè)直腸癌患者預(yù)后不良的AUC為0.795（95%CI：0.694～0.875），最佳截?cái)嘀禐?.51，此時(shí)其預(yù)測(cè)直腸癌患者預(yù)后不良的靈敏度為95.00%、特異度為56.92%；血清miR-144-5p、miR-876-5p 表達(dá)聯(lián)合預(yù)測(cè)直腸癌患者預(yù)后不良的AUC為0.888（95%CI：0.801～0.946），其預(yù)測(cè)直腸癌患者預(yù)后不良的靈敏度為90.00%、特異度為78.46%。血清miR-144-5p、miR-876-5p 表達(dá)聯(lián)合預(yù)測(cè)直腸癌患者預(yù)后不良的AUC顯著高于血清miR-144-5p、miR-876-5p 表達(dá)單獨(dú)（Z分別為2.320、2.247，P均＜0.05）。見圖1。

圖1 血清miR-144-5p、miR-876-5p表達(dá)預(yù)測(cè)直腸癌患者預(yù)后不良的ROC曲線

3 討論

直腸癌是一種起源于直腸黏膜上皮的惡性腫瘤。近年來，隨著人口老齡化加劇和飲食結(jié)構(gòu)改變，我國(guó)直腸癌的發(fā)病率和死亡率一直居高不下［1］。盡早發(fā)現(xiàn)并及時(shí)處理癌前病變和癌前狀態(tài)是降低直腸癌患者死亡率的關(guān)鍵。但由于直腸癌早期無特異性癥狀，大多數(shù)患者出現(xiàn)典型癥狀就診時(shí)已進(jìn)展至中晚期，盡管近年來放化療、免疫治療、靶向治療等取得了重大進(jìn)展，但中晚期直腸癌極易發(fā)生局部擴(kuò)散和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，即使經(jīng)積極治療，預(yù)后仍然較差［2］。迄今為止，直腸癌的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。因此，深入探索直腸癌發(fā)病的分子機(jī)制，對(duì)其早期篩查和研發(fā)靶向藥物具有重要意義。

目前，臨床主要通過血清甲胎蛋白、癌胚抗原、糖類抗原19-9 等腫瘤標(biāo)志物評(píng)估直腸癌患者預(yù)后，但其靈敏度和特異度較低。在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中涉及一系列表觀遺傳學(xué)改變，而非編碼RNA 在表觀遺傳學(xué)調(diào)控中發(fā)揮重要作用。miRNA 作為一種內(nèi)源性非編碼小RNA 分子，能夠通過與mRNA 的3′端非編碼區(qū)特定位點(diǎn)結(jié)合，與mRNA 完美配對(duì)或不完美配對(duì)引起mRNA 降解或轉(zhuǎn)錄后基因沉默，從而參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［3］。miR-144-5p 定位于人17號(hào)染色體長(zhǎng)臂11.2 處。最初發(fā)現(xiàn)miR-144-5p 可參與貧血過程，近年發(fā)現(xiàn)miR-144-5p 還參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。有研究報(bào)道，miR-144-5p在非小細(xì)胞肺癌中低表達(dá)，通過靶向細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1 抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期分布［11］；miR-144-5p 在卵巢癌中低表達(dá)，通過靶向La 相關(guān)蛋白1抑制卵巢癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化［12］。HAN 等［13］通過miRNA 微陣列分析發(fā)現(xiàn)，miR-144-5p 在奧沙利鉑化療抵抗的結(jié)直腸癌患者外周血中表達(dá)降低。但目前鮮有直腸癌患者外周血miR-144-5p 表達(dá)變化的報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，觀察組血清miR-144-5p 表達(dá)顯著低于對(duì)照組；血清miR-144-5p 表達(dá)與直腸癌浸潤(rùn)深度、TNM 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，而與性別、年齡、腫瘤最大徑、組織分化程度無關(guān)。結(jié)果表明，miR-144-5p能夠參與直腸癌的發(fā)生、發(fā)展，其機(jī)制可能與miR-144-5p表達(dá)下調(diào)能夠上調(diào)環(huán)指蛋白187表達(dá)有關(guān)。環(huán)指蛋白187 是含RING 域的E3 泛素連接酶，能夠通過與底物偶聯(lián)作用促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移［14］。

miR-876-5p 定位于人9 號(hào)染色體短臂21.1 處。近年研究發(fā)現(xiàn)，miR-876-5p 能夠參與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。有研究報(bào)道，miR-876-5p在髓母細(xì)胞瘤中低表達(dá)，并通過靶向叉頭盒蛋白M1 抑制髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖和侵襲［15］；miR-876-5p 在卵巢癌細(xì)胞中高表達(dá)，并通過靶向F-box 蛋白31 促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲［16］。這些研究表明miR-876-5p 在不同腫瘤中發(fā)揮的作用不同。本研究結(jié)果顯示，觀察組血清miR-876-5p 表達(dá)顯著低于對(duì)照組；血清miR-876-5p 表達(dá)與直腸癌浸潤(rùn)深度、TNM 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，而與性別、年齡、腫瘤最大徑、組織分化程度無關(guān)。結(jié)果表明，miR-876-5p 亦參與直腸癌的發(fā)生、發(fā)展，其機(jī)制可能與miR-876-5p 表達(dá)下調(diào)能夠?qū)е翿as 蛋白激活劑樣2 表達(dá)上調(diào)有關(guān)。Ras蛋白激活劑樣2 是一種GTP 結(jié)合蛋白，可通過抑制促進(jìn)Yes 相關(guān)蛋白去磷酸化激活的Yes 相關(guān)蛋白信號(hào)通路，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移［17］。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-144-5p、miR-876-5p 高表達(dá)者3年生存率均顯著高于其低表達(dá)者。表明血清miR-144-5p、miR-876-5p 表達(dá)與直腸癌患者預(yù)后密切相關(guān)，有望成為評(píng)估直腸癌患者預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。本研究ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，血清miR-144-5p、miR-876-5p 表達(dá)預(yù)測(cè)直腸癌患者預(yù)后不良的AUC分別為0.781、0.795，提示血清miR-144-5p、miR-876-5p表達(dá)對(duì)直腸癌患者預(yù)后不良均具有一定預(yù)測(cè)價(jià)值；血清miR-144-5p、miR-876-5p表達(dá)聯(lián)合預(yù)測(cè)直腸癌患者預(yù)后不良的AUC為0.888，高于血清miR-144-5p、miR-876-5p表達(dá)單獨(dú)，提示血清miR-144-5p、miR-876-5p表達(dá)聯(lián)合能夠提高對(duì)直腸癌患者預(yù)后不良的預(yù)測(cè)價(jià)值。

綜上所述，直腸癌患者血清miR-144-5p、miR-876-5p 低表達(dá)，二者表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及患者預(yù)后密切相關(guān)，并可作為預(yù)測(cè)直腸癌患者預(yù)后不良的生物標(biāo)志物。