曹多軍，張志龍，蔡園園，趙志文，張小宇，張勁龍，李祥子*，程國友，孔亞瓊*

(1. 巢湖學(xué)院 化學(xué)與材料工程學(xué)院，安徽 巢湖 238024；2. 合肥職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程學(xué)院，安徽 巢湖 238000；3. 皖南醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，安徽 蕪湖 241002)

近幾十年來，環(huán)境污染和生理疾病嚴(yán)重威脅著人類的健康和發(fā)展.在大多數(shù)情況下，它們之間存在著密切的因果關(guān)系.在各種環(huán)境污染物中，重金屬占有很大的比例.鐵作為最重要的過渡金屬，被廣泛應(yīng)用于不同的工業(yè)領(lǐng)域，極大地促進(jìn)了人類文明的進(jìn)步.然而，水或土壤中過量的鐵會帶來嚴(yán)重的環(huán)境問題.此外，鐵作為人體不可或缺的微量元素之一，在生命體內(nèi)催化各類生物化學(xué)反應(yīng)起著至關(guān)重要的作用，而生物化學(xué)反應(yīng)過程是生命賴以生存的基礎(chǔ)[1].例如，F(xiàn)e3+可以與血紅蛋白形成配位化合物，進(jìn)而將氧氣運(yùn)輸?shù)饺砀鞑课籟2].但鐵離子的缺乏和過量可能導(dǎo)致貧血、細(xì)胞損傷和血色素沉著癥等多種疾病[3].因此，探索一種能夠有效且選擇性地檢測自然環(huán)境和生物系統(tǒng)中微量Fe3+的方法是非常有必要的.

與傳統(tǒng)的陽離子檢測方法相比，熒光探針技術(shù)具有簡單、靈敏度高、瞬間響應(yīng)、實(shí)時監(jiān)測等特點(diǎn)，近年來在疾病診斷和環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注.到目前為止，科學(xué)家們已經(jīng)設(shè)計了各種Fe3+熒光探針，如基于Schiff堿[4]、噁二唑衍生物[5]、羅丹明和香豆素衍生物[6]等.與此同時，具有大斯托克斯位移和高量子產(chǎn)率的苯并噻唑共軛結(jié)構(gòu)已廣泛應(yīng)用于光電材料的制備[7].然而，基于苯并噻唑類Fe3+熒光探針由于pH穩(wěn)定性差和響應(yīng)時間長，報道較少.因此，開發(fā)高性能的苯并噻唑類探針是一項富有挑戰(zhàn)性的任務(wù).基于Fe3+的順磁性[8]，我們設(shè)計并合成了一種簡單的苯并噻唑基Fe3+熒光探針(BZ)，用NMR和HR-MS對BZ的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征.該探針能快速與Fe3+結(jié)合并且猝滅探針BZ的熒光.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BZ不僅對Fe3+具有良好的選擇性和高靈敏度，而且在較寬的pH條件下具有良好的穩(wěn)定性.Job’s曲線和ESI-HRMS表明，BZ的熒光猝滅是由BZ與Fe3+形成2∶1絡(luò)合物引起的.同時，探針BZ具有較低的細(xì)胞毒性，可以監(jiān)測真實(shí)水樣和活細(xì)胞中Fe3+.最后，由靜電紡絲得到的BZ復(fù)合納米纖維膜表現(xiàn)出優(yōu)異的Fe3+響應(yīng)，有望用于Fe3+的實(shí)時和實(shí)地檢測.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料與儀器

所有化學(xué)試劑都是分析純(AR)，使用時沒有進(jìn)一步純化.探針BZ用DMSO配成10 mM 母液，并在-18 ℃保存?zhèn)溆?各種金屬離子溶液均用二次蒸餾水配制，濃度為100 mM，工作溶液用含25% DMSO的水溶液(pH=7.4)稀釋.用適量的鹽酸(1 M)或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值.

T9CS紫外-可見分光光度計，F(xiàn)97XP熒光分光光度計，狹縫寬度為10 nm.布魯克Avance核磁共振光譜儀(600 MHz)，Thermo UPLC-Q Exactive Orbitrap HR-MS光譜儀，pH-3ct pH計，徠卡TCS SP8熒光成像顯微鏡，ThermoFisher Multiskan GO微板閱讀器測定細(xì)胞活力.

圖1 熒光探針BZ的合成

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

(1) 熒光探針BZ的合成[9]在100 mL圓底燒瓶中，加入聚磷酸(1 mL)并加熱到70 ℃.再加入2-氨基苯硫酚(62.5 mg， 0.5 mmol)，得到黏性溶液并攪拌10 min，然后加入3，4-二氨基苯甲酸(46 mg， 0.3 mmol).將上述混合物加熱到100 ℃，攪拌一夜.冷卻后，將溶液倒入冰浴中，用飽和的Na2CO3溶液中和.過濾得到棕色沉淀并在60 ℃真空干燥.粗產(chǎn)物用PE/EA經(jīng)快速色譜洗脫得到棕色固體(50 mg， 產(chǎn)率68.8%).1H NMR(600 MHz， CDCl3， δ ppm): 7.97(d， J=6.0 Hz，1H)， 7.83(d， J=6.0 Hz，1H)， 7.51(s，1H)， 7.43(m， 2H)， 7.31(d， J=12.0 Hz，1H)， 6.74(d， J=12.0 Hz，1H)， 3.72(s， 2H)， 3.45(s， 2H). ESI-HRMS(ESI) m/z calcd for[BZ+H]+， 242.0752， found 242.0767.

(2) 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞毒性測試 HepG2細(xì)胞(購自ATCC， Rockville， MD， USA)在含10%胎牛血清(胎牛血清，Gibco BRL)、100 U/mL青霉素(Gibco BRL)和100 μg/mL鏈霉素的DMEM(Dulbecco’s改良Eagle’s培養(yǎng)基，Gibco BRL)培養(yǎng)基中培養(yǎng).然后，細(xì)胞在加濕的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(5% CO2和95%空氣，溫度為37 ℃).采用細(xì)胞計數(shù)試劑盒8(CCK-8)法測定BZ對細(xì)胞活力的影響.取對數(shù)期的HepG2細(xì)胞，鋪于96孔板(5000個/孔).12 h后，用不同濃度(0、20、50、80、100 μM)的BZ處理細(xì)胞并孵化24 h.然后，在每孔中加入CCK-8溶液，繼續(xù)孵育，每隔一個小時取出96孔板震蕩10 s，4 h后用酶標(biāo)儀(ThermoFisher Multiskan GO)讀取450 nm的吸光度.用A/A0× 100%(A0和A分別為對照組和實(shí)驗(yàn)組的吸光度)計算細(xì)胞存活率.

(3) 活體HepG2細(xì)胞成像 成像實(shí)驗(yàn)前，將HepG2細(xì)胞接種于35 mm玻璃底培養(yǎng)皿中，24 h后，小心去除培養(yǎng)液，在新鮮培養(yǎng)液中與BZ(5 μM)共孵育30 min，溫度37 ℃.隨后用冷的PBS洗滌細(xì)胞三次以除去游離的探針，在37 ℃下用不同濃度的Fe3+(10、30和60 μM)繼續(xù)孵育30 min.對照組細(xì)胞在相同條件下僅與BZ孵育.使用冷的PBS再次洗滌細(xì)胞三次，利用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光發(fā)射通道的發(fā)光情況(λex=365 nm).

(4) 探針BZ復(fù)合熒光納米纖維膜的制備及Fe3+檢測 將聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA， 3.0 g)和探針BZ(1.0 mg)的混合物溶解在7.0 g DMF中.然后在60 ℃攪拌過夜.隨后，將清澈的混合溶液裝入10 mL的注射器中，由可編程注射泵在高壓電源(20 kV)下以恒定的1.0 mL/h的速率泵送.靜電紡成的納米纖維通過真空干燥到恒定重量收集.最后，用Fe3+和其他離子對用BZ復(fù)合的納米纖維膜進(jìn)行處理.通過共聚焦顯微鏡記錄納米纖維膜在綠色通道下的熒光成像(λex=365 nm).

2 結(jié)果與討論

2.1 探針BZ對Fe3+的光譜響應(yīng)

在DMSO/H2O(4∶1，v/v， pH=7.4)中評價了探針BZ對Fe3+的響應(yīng)情況.如圖2所示，純探針BZ溶液在300～400 nm之間出現(xiàn)吸收帶，對應(yīng)S0→S1躍遷，其中，357 nm處的主吸收峰可歸屬于π-π*躍遷.在BZ溶液中加入Fe3+后，溶液顏色發(fā)生明顯變化，吸收強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，且伴隨著藍(lán)移現(xiàn)象，歸因于金屬與BZ基態(tài)絡(luò)合物的形成，而不是由Fe3+本身的光譜特性引起的[10].我們還測定了BZ對Fe3+的熒光光譜，在365 nm激發(fā)下，純探針在498 nm處(ΦF=37.8%，熒光素為標(biāo)準(zhǔn)樣)具有較強(qiáng)的熒光發(fā)射，而加入Fe3+后，熒光快速猝滅，顏色由藍(lán)綠色變?yōu)闊o色，說明探針BZ對Fe3+較高的靈敏性.

圖2 探針BZ(10 μM)加入Fe3+(1 mM)前后的吸收和發(fā)射光譜(DMSO/H2O(4∶1，v/v， pH=7.4))

為了進(jìn)一步驗(yàn)證探針BZ對Fe3+的響應(yīng)效果，在室溫下，進(jìn)行了熒光滴定實(shí)驗(yàn).如圖3a所示，隨著Fe3+的逐漸加入，BZ(10 μM)在498 nm處的熒光強(qiáng)度逐漸降低，當(dāng)加入50.0當(dāng)量及以上的Fe3+時，熒光信號幾乎消失(圖3a內(nèi)嵌圖)，達(dá)到平臺期.同時，通過圖3b所示的BZ熒光發(fā)射強(qiáng)度隨Fe3+離子濃度的變化曲線可得到猝滅效率為99.6%.值得注意的是，F(xiàn)e3+離子濃度在8.3～83 μM范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系(R2=0.9989)(圖3b內(nèi)嵌圖)，根據(jù)IUPAC標(biāo)準(zhǔn)(LOD=3 σ /k)計算出的檢測限(LOD)為1.06 × 10-8M，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于美國環(huán)境保護(hù)署(EPA)制定的飲用水推薦水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)[10].

圖3 探針BZ(10 μM)加入不同F(xiàn)e3+濃度(0～0.5 mM)的熒光滴定光譜(a)(內(nèi)嵌圖為365 nm激發(fā)下溶液照片)和熒光強(qiáng)度隨著Fe3+濃度變化曲線(b)(內(nèi)嵌圖為8.3～83 μM線性圖)

2.2 探針BZ對Fe3+的選擇性和抗干擾性

其中所有數(shù)據(jù)在DMSO/H2O(4∶1，v/v， pH=7.4)中收集.圖4 探針BZ(10 μM)對Fe3+(0.5 mM)和其他金屬離子或陰離子(1.0 mM)在498 nm處的熒光響應(yīng)相應(yīng)365 nm激發(fā)抗干擾性實(shí)驗(yàn)

2.3 探針BZ與Fe3+的結(jié)合模型

圖5 Job’s plot曲線(a);探針BZ與Fe3+結(jié)合后的ESI-HRMS質(zhì)譜(b);探針BZ與Fe3+結(jié)合模型圖(c)

圖6 BZ和Fe3+之間化學(xué)計量比為2∶1的Benesi-Hildebrand圖(a);探針BZ對Fe3+的Stern-Volmer圖(b)

2.4 探針BZ對Fe3+的檢測pH值相關(guān)性

在實(shí)際應(yīng)用中，pH值對熒光探針檢測效果可能會產(chǎn)生不可忽視的影響.因此，在不同pH值的DMSO/H2O(4∶1， v/v)體系中，我們測試了探針BZ對Fe3+響應(yīng)的熒光變化趨勢，結(jié)果如圖7所示.當(dāng)pH值在3～10時，探針自身是相對穩(wěn)定的，當(dāng)加入Fe3+時，BZ發(fā)生了顯著的熒光猝滅現(xiàn)象，這說明了探針BZ在近似生理條件和生態(tài)環(huán)境下可以較好的完成Fe3+離子檢測.

圖7 不同pH值下，BZ(10 μM)在498 nm處的熒光強(qiáng)度變化

2.5 實(shí)體水樣中探針BZ對Fe3+的檢測

為了進(jìn)一步驗(yàn)證BZ的實(shí)際應(yīng)用，我們選擇自來水和巢湖水作為真實(shí)水樣，分別加入固定濃度的Fe3+(0、0.1、0.2和0.5 mM).參考不同濃度Fe3+處理的校準(zhǔn)曲線，獲得記錄的熒光強(qiáng)度，以確定實(shí)際水樣中當(dāng)前的鐵離子數(shù)量.如表1所示，自來水和巢湖中Fe3+的回收率分別為100.5～104.4和95.6～103.8，且相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(Relative Standard Deviation)均小于5%.由此可知，上述合理的數(shù)據(jù)使BZ具備了對周圍環(huán)境中Fe3+的定量檢測能力.

表1 實(shí)體水樣中探針BZ對Fe3+的檢測分析

2.6 活體細(xì)胞中探針BZ對Fe3+的檢測

為了驗(yàn)證BZ是否能夠檢測生物系統(tǒng)中的Fe3+，首先通過建立了不同濃度(0、20、50、80和100 μM)的CCK-8法評估BZ對HepG2細(xì)胞活力的影響.如圖8所示，濃度為100 μM的BZ處理24 h后，超過80%的HepG2細(xì)胞存活.實(shí)驗(yàn)結(jié)果激勵我們進(jìn)一步評估BZ在共聚焦激光掃描顯微鏡下檢測活細(xì)胞中Fe3+的能力(圖9).與預(yù)期的一樣，在37 ℃下，BZ(5 μM)孵育的HepG2細(xì)胞在綠色通道中呈現(xiàn)強(qiáng)烈的胞內(nèi)熒光，并保持良好的細(xì)胞形態(tài)，這表明探針BZ具有良好的細(xì)胞膜通透性.不同濃度Fe3+(10、30、60 μM)孵育30 min后，在相同條件下再用BZ(5 μM)染色30 min，熒光強(qiáng)度有不同程度減弱，甚至接近猝滅.上述結(jié)果表明，BZ具有應(yīng)用于生物體系中檢測Fe3+的潛力.

圖8 用不同濃度的BZ(0、20、50、80和100 μM)處理24 h后HepG2活細(xì)胞百分比

圖9 探針BZ(5 μM)及不同濃度(0、10、30和60 μM) Fe3+處理HepG2細(xì)胞的共聚焦顯微鏡圖像

2.7 探針BZ復(fù)合納米纖維膜的制備及其對Fe3+的檢測

近年來，納米復(fù)合材料、納米金屬-有機(jī)骨架、發(fā)光納米顆粒、量子點(diǎn)或金屬團(tuán)簇等熒光納米探針在探測金屬離子方面的應(yīng)用引起了人們的極大興趣.然而，這些納米探針大多需要在其溶液相中進(jìn)行檢測使用成本昂貴和加工過程復(fù)雜.相比之下，像薄膜材料這樣的固態(tài)探針由于其易于操作、穩(wěn)定性高，在實(shí)際應(yīng)用中受到青睞.靜電紡絲(ES)納米纖維薄膜具有三維多孔結(jié)構(gòu)和較大的表面積，有望應(yīng)用于智能化、超靈敏的傳感系統(tǒng)[11，12].因此，我們探索了用低含量BZ復(fù)合的靜電紡聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)納米纖維膜檢測Fe3+.如圖10a所示，復(fù)合納米纖維膜浸泡在0.5 mM的Fe3+溶液中，在365 nm燈下肉眼觀察到明顯的熒光猝滅.同時，當(dāng)薄膜浸漬在另外15個金屬離子和10個陰離子溶液中時，熒光幾乎沒有變化.結(jié)果表明，BZ復(fù)合納米纖維膜具有良好的檢測性能.熒光共聚焦顯微鏡在綠色通道中記錄了復(fù)合納米纖維薄膜的微觀結(jié)構(gòu).通過圖10b可以看出，探針BZ和PMMA納米纖維具有良好的相容性，并具有明亮的發(fā)射光.經(jīng)Fe3+處理后，熒光發(fā)生猝滅但膜的形貌保持不變，沒有出現(xiàn)嚴(yán)重的裂紋和降解現(xiàn)象，表明該熒光納米纖維膜可作為一種潛在的便攜式的Fe3+的可視化檢測工具.

3 結(jié)論

綜上所述，通過2-氨基苯硫酚與3，4-二氨基苯甲酸的簡單縮合反應(yīng)，制備了基于苯并噻唑的Fe3+熒光探針BZ.正如設(shè)想的那樣，由于Fe3+的順磁性，探針BZ以熒光猝滅模式下對Fe3+表現(xiàn)出良好的選擇性和靈敏度.通過Job’s plot實(shí)驗(yàn)和HR-MS確定BZ的熒光猝滅是由于BZ與Fe3+形成2∶1化合物所致.重要的是，BZ不僅可以監(jiān)測真實(shí)水樣中的Fe3+，還實(shí)現(xiàn)了在HepG2活細(xì)胞中Fe3+的熒光成像.此外，通過靜電紡絲將探針BZ加工成復(fù)合納米纖維膜，熒光變化顯著，可望作為測定Fe3+的有效工具.