賈明璐 王瑞 陳雪平 李玉偉 田會東 王轍遠

(漯河市中心醫(yī)院，河南 漯河 462000)

惡性腫瘤是威脅人類健康的主要疾病，其發(fā)病率和死亡率近年來一直呈上升趨勢〔1,2〕，在腫瘤治療領域尋找安全、合理、有效的治療手段已成為迫切需要解決的問題〔3〕。設計有效的腫瘤疫苗主要通過主動免疫來擴大腫瘤特異性T細胞反應，長期以來一直被視為腫瘤免疫治療的有效工具〔4〕。黑色素瘤相關抗原(MAGEA)4是睪癌(CT)抗原，它在多種不同的惡性腫瘤中表達，但僅在正常成人組織的睪丸生殖細胞中表達〔5〕。CT抗原具有高度的免疫原性。通過在線數據庫分析我們發(fā)現高表達MAGEA4對乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、頭頸鱗狀細胞癌、子宮內膜癌患者的預后較差，所以MAGEA4是一個潛在的理想抗原〔6,7〕。長肽疫苗包含多個能被主要組織相容性復合體(MHC)-Ⅰ、Ⅱ分子提呈的表位天然肽段〔8〕。其優(yōu)點是長肽能被專職抗原提呈細胞樹突細胞(DC)有效加工和提呈，能夠有效激起體內的免疫反應，所以合成的長肽能夠成為很有潛力的多肽疫苗。本研究旨在設計針對腫瘤抗原MAGEA4的長肽，體外驗證長肽的免疫原性。

1 材料和方法

1.1材料 人結直腸癌細胞系SW620，在實驗室中使用37℃、體積分數5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)條件保存，常規(guī)培養(yǎng)于10%胎牛血清(FCS)的RPMI1640培養(yǎng)基。外周血單個核細胞由醫(yī)院血站健康供者血液分離所得。長肽由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2方法

1.2.1利用數據庫查詢MAGEA4的表達情況 分析癌癥基因組圖譜(TCGA)數據庫相關數據，借助于數據庫腫瘤免疫評估資源(TIMER)〔9〕(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)分析MAGEA4在不同腫瘤患者中的表達情況及比較腫瘤患者與正常健康病人MAGEA4的表達差異，利用The Human Protein Atlas〔10〕(https://www.proteinatlas.org)數據庫分析MAGEA4在腫瘤組織中表達情況。利用The Kaplan Meier plotter(http://kmplot.com/analysis/)分析MAGEA4在不同腫瘤中對腫瘤患者預后的影響〔11〕。

1.2.2設計包含已知細胞毒性T淋巴細胞(CTL)表位的長肽疫苗 利用免疫表位數據庫(IEDB)數據庫(http://www.iedb.org/)〔12〕查詢已經鑒定的MHC-Ⅰ類抗原表位，設計包含有效抗原表位的長肽。MAGEA4的氨基酸序列參照 GenBank: NP_001011549.1 所提供的序列。根據篩選出的CTL表位設計MAGEA4抗原來源的長肽，分別為: MAGEA4 P102-121、P156-177、P224-239、P280-294。

1.2.3分離外周血單個核細胞(PBMCs) 加肝素鈉至50 ml離心管，預防凝血。取外周血20 ml與生理鹽水1∶1混勻；加入室溫淋巴細胞分離液，離心2 000 r/min，30 min；吸取中間白膜層加入生理鹽水30 ml進行清洗，離心后用10%胎牛血清IMDM培養(yǎng)基重懸細胞，即可獲得單核細胞。

1.2.4體外誘導肽特異性的CTLs 將分離出的PBMCs進行重懸，于1×106個/ml培養(yǎng)于6孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h；輕輕洗脫尚未黏附的T細胞凍存于液氮中，加入IMDM培養(yǎng)基2 ml，并補加粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF，100 ng/ml)、白細胞介素(IL)-4(50 ng/ml)；每隔1天進行半量換液，并補充GM-CSF(100 ng/ml)和IL-4(50 ng/ml)；第5天加入脂多糖(100 ng/ml)以誘導DC成熟。 48 h后收集成熟的DC細胞〔13〕。 加入長肽 20 μg/ml，培養(yǎng)4 h；重懸后加入100 μg絲裂霉素C，添加20 μg/ml的長肽，孵育24 h；用10% FCS重懸IMDM培養(yǎng)基并計數2×105個/ml；取前期復蘇凍存的T細胞和誘導成熟的DC細胞重懸并計數2×106個/ml，共孵育加入24孔板中；在第2天添加人IL-2(50 U/ml)，并且每3天換液并補充人 IL-2。 1 w后將細胞與負載肽的DC共孵育，進行第2輪刺激。3輪刺激后3 d收集細胞，用于后續(xù)的活性實驗〔14〕。

1.2.5檢測細胞因子的干擾素(IFN)-γ分泌水平 取出酶聯免疫斑點實驗(ELISPOT)板條。最初，添加200 μl無血清IMDM培養(yǎng)基進行封閉；將前期實驗中誘導的CTLs用作效應細胞，并將細胞濃度調整為2×106個/ml。攝取多肽的成熟DC作為刺激細胞，孵育18 h；每孔加入200 μl無菌的去離子水，4℃裂解細胞10 min；加入200 μl 1×洗滌緩沖液洗滌6次；加入100 μl生物素標記的抗體，并在37℃下孵育1 h。 倒出孔中的液體，加入200 μl 1×洗滌緩沖液并洗滌。 孵育后，加入100 μl 3-氨基-9-乙-基咔唑(AEC)顯色溶液，在室溫下于25℃干燥30 min；使用圖像分析儀對96孔板中每孔的斑點數進行計數。

1.2.6細胞毒性實驗檢測 離心收集靶細胞SW620(MAGEA4+，HLA-0201+)，將細胞濃度調節(jié)至1×106個/ml。1 ml細胞懸浮液加入0.5 μl 5 mmol/L羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(CFSE)作為致敏靶細胞。1 ml細胞懸液中加入0.5 μl 100 μmol/L CFSE作為對照靶細胞。將細胞用5% FCS-磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌一次，離心去除上清。將效應細胞(前期誘導的CTLs)以5×106個/ml的濃度重懸，將不同效靶比的效應細胞與致敏靶細胞混合，靶細胞數為2×104個，4 h后，用含有1% FCS 0.1%疊氮化鈉的PBS處理上述兩種細胞，使用含有4%多聚甲醛的PBS溶液重懸細胞，流式細胞儀進行檢測。殺傷率=(對照樣品中致敏靶細胞的數量-測試樣品中致敏靶細胞的數量)/對照樣品中致敏靶細胞的數量×100%。

1.2.7胞內因子染色法檢測T細胞釋放IFN-γ水平 前期誘導的CTLs作為效應細胞，誘導的成熟DC作為刺激細胞；加入阻斷劑BFA 5 μg/ml到離心管中，孵育4 h，充分混勻。將細胞重懸于含有1%FBS溶液的PBS中。 加入細胞表面抗體，并在避光條件下于4℃孵育30 min。 以1 500 r/min離心5 min。 向每個孔中添加200 μl破膜劑，并在4℃下孵育30 min。 收集上述處理過的細胞，加入抗IFN-γ抗體，并在4℃下避光保存30 min。使用PBS重懸后進行流式細胞儀上機檢測表位肽誘導的特異性T細胞亞群產生IFN-γ的比例。

1.3統計學處理 采用GraphPad Prism軟件繪圖，采用SPSS22.0標準版統計軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1MAGEA4 在不同腫瘤之間的表達 MAGEA4在很多惡性腫瘤中均有表達，尤其是頭頸鱗狀細胞癌、肺鱗癌和胃癌中的表達，并且癌與癌旁中表達是有差異存在的。見圖1。

圖1 MAGEA4在各種癌癥病人中的表達情況

2.2MAGEA4 在不同腫瘤組織中的表達情況 利用The Human Protein Atlas(https://www.proteinatlas.org/)數據庫驗證MAGEA4在腫瘤病理組織中的表達情況，結果發(fā)現，MAGEA4高表達于結直腸癌、肺癌、皮膚癌、宮頸癌、乳腺癌中。見圖2。

圖2 MAGEA4在不同腫瘤組織中的表達(免疫組織化學染色，×50)

2.3ELISPOT結果顯示IFN-γ的分泌水平 與PBS組〔(8.78±1.88)個〕相比，P102-121組和P280-294組分泌IFN-γ的T細胞斑點數量較多，差異有統計學意義〔(112.66±3.51)個、(169.66±7.82)個，P<0.05〕。P156-177組、P224-239組分泌IFN-γ的T細胞斑點數量〔(37.00±14.36)個、(26.33±8.62)個〕與PBS組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。

圖3 ELISPOT檢測長肽在健康志愿者中誘導的CTLs中IFN-γ分泌(AEC顯色)

2.4MAGEA4在不同腫瘤中與預后的關系 利用 The Kaplan Meier plotter 數據庫，對腫瘤組織樣本的MAGEA4進行生存分析。結果表明，MAGEA4在乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、頭頸鱗狀細胞癌、子宮內膜癌患者生存率的差異較為明顯，高表達的MAGEA4患者預后較差。足以說明，MAGEA4是一個潛在的腫瘤靶點。見圖4。

圖4 MAGEA4基因表達高、低與腫瘤患者預后的關系

2.5胞內因子染色法檢測長肽體外免疫刺激后細胞因子的分泌 PBS組、P102-102組、P280-294組IFN-γ比例分別為(0.72±0.09)%、(2.79±0.19)%、(3.05±0.21)%。P102-121和P280-294長肽疫苗能夠很好地誘導CTL分泌IFN-γ。見圖5。

圖5 流式細胞儀檢測長肽特異性CTLs分泌IFN-γ的能力

2.6細胞毒性實驗檢測結果 P102-121和P280-294兩條候選肽誘導的CTLs在不同效靶比對靶細胞的殺傷情況見表1。結果顯示：P102-121、P280-294組誘導的CTLs在效靶比為12.5∶1、25∶1、50∶1時對靶細胞的殺傷率均顯著高于PBS組(P<0.05)，且以50∶1效靶比最高。

表1 長肽誘導的CTLs不同效靶比對SW620的殺傷率

3 討 論

腫瘤免疫治療提供了免疫系統對惡性腫瘤細胞的特異性和記憶性，不良反應較小，治療效果持久。從骨髓移植治療血液性癌癥的成功開始，各種腫瘤的單克隆抗體療法的發(fā)展，到針對免疫檢查點的抗體療法已經成為較成功的癌癥治療方法〔15〕。隨著對免疫調節(jié)機制的深入了解及對免疫細胞的工程化技術改進，越來越多的科學家去關注和開放新的腫瘤疫苗。隨著這些技術的不斷改進，免疫療法將在癌癥治療中發(fā)揮越來越重要的作用〔16〕。

多肽疫苗治療的目的是刺激和激活肽特異性T細胞來殺傷腫瘤細胞。T細胞識別的腫瘤相關抗原的發(fā)現促進了這一策略的實施〔17〕。多肽疫苗誘導部分癌癥患者產生免疫應答，但客觀的臨床應答率仍然較低。為了提高多肽疫苗治療的效果：①需要在腫瘤細胞中特異表達而在正常細胞中不表達的腫瘤抗原；②在多肽疫苗治療的早期階段進行治療；③應調節(jié)記憶T干細胞以維持對多肽疫苗的長期免疫應答〔18〕。已經有很多長肽有較好的效果，黑色素瘤抗原(MELOE-1)的長肽，包含了一個人類白細胞抗原(HLA)-A*0201 表位和多個 HLA classⅡ T 細胞表位，是很好的黑色素瘤疫苗候選肽〔19〕。Michael Pfreundschuh在癌睪抗原 SSX2 中找到一個核心優(yōu)勢表位，既能誘導CD8+T細胞反應和CD4+T細胞反應，也能產生抗體〔20〕。乙型肝炎病毒(HBV)來源的長肽能增強慢性乙型肝炎患者體內CD4+和CD8+T細胞應答。由此表明，長肽疫苗有望成為腫瘤免疫治療的新策略〔13,21〕。

本研究設計了一種基于MAGEA4抗原的長肽疫苗，該疫苗包含了已經鑒定過的CD8+T細胞表位。本研究證明P102-121和P280-294有很好的分泌IFN-γ及殺傷靶細胞的能力。當長肽被樹突細胞加工時，其誘導T細胞分泌IFN-γ的能力增強。由于其長度不能直接與抗原結合槽結合，因此必須被抗原呈遞細胞吞噬并加工。樹突細胞在抗原加工中更有效。長肽疫苗具有多個表位，能誘導多克隆CD8+T細胞反應。此外，與短肽不同，長肽疫苗可以包含多個HLA等位基因的表位。因此，長肽疫苗適應大多數人群。除CD8+表位外，長肽疫苗還可以覆蓋多種HLA等位基因的CD4+表位。同時誘導CD4+T細胞，有助于產生持久的CD8+T細胞反應。體外實驗可能有利于放大現有的記憶T細胞反應，這將使免疫反應更快，并勝過幼稚T細胞的反應。在未來的研究中，可以考慮長肽和佐劑聯合使用，以增強長肽觸發(fā)的免疫反應。在腫瘤免疫治療中，聯合治療經常會在臨床上起到不錯的效果，長肽疫苗的設計也可以包含來源于不同抗原的CD8+和CD4+T細胞表位，也可以針對不同的腫瘤設計獨特的長肽疫苗，這些都是值得思考和探索的。