馬若夢，鄧奕輝，彭珣，李鈺佳，陽晶晶，李定祥?

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合心腦疾病防治湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208）

全球范圍內(nèi)，卒中作為僅次于缺血性心臟病的第二大三級死亡原因［1］，其特征是急性腦部血液循環(huán)障礙，導(dǎo)致長期殘疾和死亡，該病嚴重影響幸存者的生活質(zhì)量［2］。其中缺血性卒中約占所有卒中的87%［3］。中醫(yī)稱該病為“中風(fēng)”病，病機不外乎風(fēng)、火、痰、瘀、虛五端。本課題組以傳統(tǒng)中醫(yī)基礎(chǔ)理論為指導(dǎo)，結(jié)合前期研究基礎(chǔ)和各類成果，提出了本病新的病機理論，可概括為“瘀血阻滯，毒損腦絡(luò)”［4?8］，確立以化瘀解毒為治療大法［9］，并創(chuàng)立化瘀解毒方。

凝血酶是一種凝血因子，通過介導(dǎo)纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，在止血中起核心作用。凝血酶生成水平和活性在急性缺血性腦卒中與腦梗死嚴重程度明顯相關(guān)［10］。自噬在細胞穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用，并參與了許多人類疾病的過程［11?12］。除了營養(yǎng)因子缺乏、生長因子撤離、高溫、缺氧及激素刺激可誘導(dǎo)自噬的發(fā)生之外［13］，凝血酶也可誘導(dǎo)腦內(nèi)自噬的發(fā)生，從而加重腦損傷［14?16］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，凝血酶與自噬指標LC3Ⅱ/Ⅰ呈高度相關(guān)，在7 個不同缺血時相的動態(tài)變化規(guī)律相似。因此，本文從凝血酶誘導(dǎo)自噬從而介導(dǎo)腦損傷的角度，探討化瘀解毒法對缺血性中風(fēng)（瘀毒互結(jié)證）的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康SPF 級雄性大鼠116 只，體質(zhì)量220～240 g，購買于湖南斯萊克景達動物有限公司，動物許可證號：SCXK（湘）2019－0004。于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物中心飼養(yǎng)，實驗動物環(huán)境設(shè)施合格證號：SYXK（湘）2015－0003，飼養(yǎng)及手術(shù)環(huán)境溫度控制在20～25 ℃，相對濕度50%～70%。

1.2 藥物及制備

化瘀解毒方組方：黃芪40 g，川芎15 g，僵蠶10 g，地龍10 g，黃連5 g，黃芩5 g，梔子5 g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診部提供。采用水浸泡中藥飲片40 min 左右，先武火煮沸，再文火熬制30 min，取藥渣按前法再煎煮1 次，兩次所得藥液混勻、過濾，濃縮為2 g/mL，于4 ℃保存。阿加曲班單水合物（阿拉丁公司，批號：A151030－100 mg）作為陽性對照組，用DMSO 將阿曲班單水合物溶解并按稀釋3 倍標準，加入β－CD生理鹽水稀釋。

1.3 試劑與儀器

Anti－Thrombin 抗體（美國Abcam 公司，批號：Ab92621）；LC3B 抗體（美國Proteintech 公司，批號：14600－1－AP）；環(huán)氧丙烷（上海邁瑞爾化學(xué)公司，貨號：M25514）；鋨酸（TED PELLA INC，貨號：18456）；戊二醛（雷根，貨號：DF0156）；透射電子顯微鏡（日本電子，批號：JEM1400）；搖床（其林貝爾，貨號：TS－92）。

1.4 分組和給藥

依據(jù)隨機數(shù)字表將116 只大鼠隨機分為假手術(shù)組（SHAM 組），模型組（瘀毒互結(jié)缺血性中風(fēng)病證結(jié)合組，簡稱IS－YD 組），化瘀解毒方組（HJF 組），阿加曲班組（ARG組）。按不同的缺血時相再分為IS－YD 12 h組、IS－YD 24 h組、HJF 12 h組、HJF 24 h組、ARG 12 h組、ARG 24 h 組，共7 組，其中假手術(shù)組8 只大鼠，其余每組各18只大鼠。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，于第4天開始給藥，HJF 組以11.33 g/（kg·d）劑量灌胃化瘀解毒方，ARG 組以11.16 mg/（kg·d）劑量灌胃阿加曲班單水合物，均為預(yù)防性給藥，每天1 次，連續(xù)7 d。假手術(shù)組和模型組分別灌服等量的生理鹽水。除假手術(shù)組外，其余各組使用角叉菜膠聯(lián)合干酵母混懸液注射的方法，制備瘀毒互結(jié)模型［17］。于第4 天灌胃中藥，腹腔注射角叉菜膠50 mg/kg，每天1 次，連續(xù)3 d，第4 天，皮下注射干酵母混懸液10 mL/kg。末次灌胃后24 h進行造模，造模前12 h大鼠禁食、不禁水。

1.5 缺血性中風(fēng)瘀毒互結(jié)證（IS－YD）模型制備

參考文獻［18］提出的可逆性大腦中動脈閉塞（MCAO）線栓法改良制作。選取體質(zhì)量220～240 g 的雄性SD大鼠，術(shù)前用10%水合氯醛按照0.35 mL/100 g劑量腹腔注射進行麻醉。于頸部正中稍右側(cè)作切口，鈍性分離皮下組織，在靠近氣管肌旁，用黑色縫合線分離出與迷走神經(jīng)并行的右頸總動脈（CCA），分離頸內(nèi)動脈（ICA）與頸外動脈（ECA），于頸總動脈近心端插入頭端用石蠟包被的單絲尼龍魚線，長度自CCA 分叉處約18～20 mm。假手術(shù)組除了不插入栓線，其余操作同模型組。術(shù)中需記錄插入栓線的時間，以此來確定缺血時相和取材時間。術(shù)后將大鼠置于飼養(yǎng)籠里，自由進食和飲水。

1.6 神經(jīng)功能缺失評分

待動物清醒后，參照ZEA LONGA 評分標準對動物進行神經(jīng)功能缺失評分（NIHSS評分）。0分：無神經(jīng)功能缺損；1 分：不能完全伸展左側(cè)前爪；2 分：向左側(cè)轉(zhuǎn)圈；3 分：向左側(cè)傾倒；4 分：不能自發(fā)行走且意識水平低下。1～3分為造模成功，否則棄之不用。

1.7 標本采集與處理

1.7.1 取出完整腦組織

按組別選取20 只大鼠麻醉后，冰盒上快速斷頭，取出完整的腦組織，于?20 ℃速凍30 min，備用進行TTC 染色。再選取38 只大鼠進行麻醉，斷頭去腦，取出完整腦組織，置于多聚甲醛溶液中固定，備用進行HE染色。

1.7.2 分離出皮質(zhì)、海馬

將術(shù)后蘇醒的38 只大鼠逐個進行神經(jīng)功能缺失評分并作記錄，分別于缺血后12、24 h用水合氯醛麻醉大鼠，快速斷頭取腦分離出大腦皮質(zhì)和海馬，存放在?80 ℃冰箱里。用藥組于最后一次灌胃24 h 后處死大鼠，斷頭去腦，同樣分離出大腦皮質(zhì)和海馬，備用進行Western blot 檢測。按組別選取20 只進行麻醉處死后斷頭取腦，分離出皮質(zhì)和海馬，置于電鏡固定液中避光保存，等待透射電鏡觀察處理。

1.8 指標檢測

1.8.1 大鼠神經(jīng)功能評分

待動物清醒后，參照ZEA LONGA 評分標準，于各組隨機抓取5只大鼠做神經(jīng)功能缺失評分。

1.8.2 TTC染色觀察大鼠腦梗死體積占比

于?20 ℃冰箱中取冰凍鼠腦，置于腦槽為2 mm的腦切片模具中，在額極與枕極處放置兩片刀片以固定大腦，從視交叉處額極到枕極處連續(xù)切5 片，厚度均為2 mm，將切片轉(zhuǎn)移至2% TTC 溶液中染色，染色后梗死區(qū)變?yōu)榘咨?，非梗死區(qū)呈現(xiàn)紅色，為使每片腦片染色均勻，37 ℃水浴鍋中孵育15 min，且每5 min翻面，后于多聚甲醛溶液中固定，24 h 后拍照，拍照注意采用統(tǒng)一角度和高度，盡量保證統(tǒng)一光線。最后使用Image Pro Plus6.0 軟件分析計算腦梗死體積占比。

梗死體積占比（%）=梗死體積/整腦體積 × 100%

1.8.3 蘇木素－伊紅（HE）染色法觀察缺血側(cè)大腦皮質(zhì)、海馬病理形態(tài)改變

將完整腦組織取出之后，放入4 %多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋，切成超薄片，脫蠟，染色，脫水，透明，封片，顯微鏡觀察并采集圖像。

1.8.4 Western blot 法檢測缺血側(cè)大腦皮質(zhì)、海馬凝血酶、LC3Ⅱ/Ⅰ的表達

分別剪取50 mg 的皮質(zhì)和海馬組織，加入500 μL裂解液（RIPA∶蛋白酶抑制劑=50∶1），于4 ℃預(yù)冷的生物樣品均質(zhì)量儀中反復(fù)研磨充分裂解，4 ℃，12 000 r/min離心10 min；得到上清液。取100 μL 蛋白原液，加入25 μL 5 × loading buffer 混勻，沸水煮15 min。點樣、電泳、轉(zhuǎn)膜封閉后進行孵育抗體，LC3B 兔抗（1∶2000）、Thrombin 兔抗（1∶1 000）、β－actin 鼠抗（1∶5 000），將膜與一抗一起孵育，4 ℃過夜，HRP 標記的二抗（1∶8 000）次日孵育。

1.8.5 透射電子顯微鏡觀察缺血側(cè)大腦皮質(zhì)、海馬自噬超微結(jié)構(gòu)

按照固定、脫水、浸透、包埋、切片、染色、拍照的順序進行操作。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 25.0 軟件統(tǒng)計數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均數(shù) ± 標準差（±s）表示。組間比較采用單因素方差分析，方差齊者，組間兩兩比較采用LSD 或SNK 法，方差不齊者，則選用Games－Howell 方法兩兩比較；若不符合正態(tài)性分布，則采用多樣本秩和檢驗，即Kruskal－Wallis單因素ANOVA 分析。P＜ 0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評分比較

在缺血后12、24 h，與SHAM 組比較，IS－YD 組大鼠出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺損癥狀，表現(xiàn)為左側(cè)前爪內(nèi)收、提尾時向左側(cè)轉(zhuǎn)圈，向左側(cè)傾倒等，神經(jīng)功能缺失評分升高（P＜ 0.01）；與IS－YD組相較，ARG組和HJF組大鼠神經(jīng)功能缺失評分顯著降低（P＜ 0.01）。說明化瘀解毒方、阿加曲班可以減輕IS－YD大鼠的神經(jīng)功能缺損癥狀。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠缺血后12、24 h神經(jīng)功能評分比較（±s）

表1 各組大鼠缺血后12、24 h神經(jīng)功能評分比較（±s）

注：與SHAM組比較，**P ＜ 0.01；與IS－YD 12 h組比較，#P ＜ 0.05；與IS－YD 24 h組比較，&P ＜ 0.05。

2.2 各組大鼠腦梗死體積比較

在缺血后12 h，與SHAM 組比較，IS－YD 組、HJF組、ARG 組的大鼠腦梗死體積占比均明顯增高（P＜ 0.01）；與IS－YD組相較，ARG組和HJF組大鼠腦梗死體積占比顯著降低（P＜ 0.05，P＜ 0.01）。在缺血后24 h，與SHAM 組比較，IS－YD 組、HJF組、ARG 組的大鼠腦梗死體積占比均明顯增高（P＜ 0.01）。給藥后，與模型組比較，ARG 組和HJF 組大鼠腦梗死體積占比顯著降低（P＜ 0.05）。說明化瘀解毒方、阿加曲班可以降低IS－YD大鼠腦梗死體積。結(jié)果見圖1、圖2。

圖1 兩個時間點各組大鼠腦梗死體積占比比較

圖2 各組大鼠TTC染色結(jié)果比較

2.3 各組大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)和海馬病理形態(tài)學(xué)比較

2.3.1 缺血側(cè)皮質(zhì)病理形態(tài)比較

SHAM 組大腦皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元細胞排列密集，胞漿豐富，染色均勻呈粉紅色，細胞核居中大且圓，核仁明顯，間質(zhì)正常；與SHAM 組比較，IS－YD 12 h、ISYD 24 h 組腦組織缺血側(cè)的大腦皮質(zhì)區(qū)形態(tài)被明顯破壞，可見大片神經(jīng)元壞死，排列稀疏、紊亂，細胞核皺縮或碎裂，胞漿濃縮染色加深，核仁不清，間質(zhì)水腫疏松，缺血區(qū)呈空泡樣變化。與模型組比較，HJF組和ARG 組以上部位病理形態(tài)損傷輕微，神經(jīng)元損傷程度降低，細胞染色較均勻，形態(tài)規(guī)整，排列較為整齊致密，空泡樣改變也較模型組均減輕。結(jié)果見圖3。

圖3 各組大鼠缺血側(cè)大腦皮質(zhì)區(qū)的HE染色圖（×200）

2.3.2 各組大鼠缺血側(cè)海馬區(qū)病理形態(tài)的比較

SHAM 組大腦海馬區(qū)神經(jīng)細胞排列整齊，胞體形態(tài)規(guī)則，神經(jīng)細胞呈圓形或錐形，胞漿豐富，胞質(zhì)染色均勻，細胞核著色均勻呈藍紫色，核仁清晰。與SHAM組比較，IS－YD 12 h、IS－YD 24 h 組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元細胞排列紊亂、部分細胞形態(tài)不規(guī)則、細胞核固縮且深染，神經(jīng)元損傷多集中在CA2區(qū)；相應(yīng)時間點的HJF和ARG 組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元損傷相對輕微，表現(xiàn)為細胞形態(tài)異常、細胞核固縮或溶解碎裂的數(shù)量有所減少。結(jié)果見圖4。

圖4 各組大鼠缺血側(cè)大腦海馬區(qū)的HE染色圖（× 200）

2.4 各組大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)和海馬凝血酶、LC3Ⅱ/Ⅰ表達比較

2.4.1 缺血側(cè)皮質(zhì)、海馬區(qū)凝血酶表達比較

在缺血后12 h，與SHAM 組比較，IS－YD 組的凝血酶蛋白表達均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.01）。與IS－YD 組比較，ARG 組兩個腦區(qū)的凝血酶蛋白表達顯著下降（P＜ 0.01），HJF 組皮質(zhì)區(qū)（P＜ 0.01）和海馬區(qū)（P＜ 0.05）凝血酶蛋白表達水平也同樣下降；在缺血后24 h，與SHAM 組比較，ISYD 組的凝血酶蛋白表達均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.01）。與IS－YD 組相較，ARG 組兩個腦區(qū)的凝血酶蛋白表達顯著下降（P＜ 0.01），而HJF組皮質(zhì)區(qū)（P＜ 0.05）和海馬區(qū)（P＜ 0.01）凝血酶蛋白表達水平也降低。說明化瘀解毒方、阿加曲班可以抑制皮質(zhì)區(qū)凝血酶、LC3 Ⅱ/Ⅰ的表達。結(jié)果見圖5～圖7。

圖5 兩個缺血時間點各組大腦皮質(zhì)區(qū)凝血酶蛋白表達水平比較

圖6 兩個缺血時間點各組大腦海馬區(qū)凝血酶蛋白表達水平比較

圖7 兩個缺血時間點、兩個腦區(qū)凝血酶的表達水平

2.4.2 缺血側(cè)皮質(zhì)、海馬區(qū)LC3Ⅱ/Ⅰ表達比較

在缺血后12 h，與SHAM 組比較，IS－YD 組的大鼠大腦皮質(zhì)、海馬區(qū)的LC3Ⅱ/Ⅰ比值表達均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.01）。與IS－YD 組比較，ARG 組兩個腦區(qū)的LC3Ⅱ/Ⅰ比值表達顯著下降（P＜ 0.01），HJF 組皮質(zhì)區(qū)（P＜ 0.05）和海馬區(qū)（P＜ 0.01）LC3Ⅱ/Ⅰ比值表達水平也同樣下降；在缺血后24 h，與SHAM 組比較的結(jié)果同上。與IS－YD 組相較，HJF 組和ARG 組兩個腦區(qū)的LC3Ⅱ/Ⅰ比值表達顯著下降（P ＜0.01）。說明化瘀解毒方、阿加曲班可以抑制海馬區(qū)凝血酶、LC3Ⅱ/Ⅰ的表達。結(jié)果見圖8～圖10。

圖8 兩個缺血時間點、兩個腦區(qū)LC3Ⅱ/Ⅰ比值的表達水平

圖9 兩個缺血時間點各組大腦皮質(zhì)區(qū)LC3Ⅱ/Ⅰ表達水平比較

圖10 兩個缺血時間點各組大腦海馬區(qū)LC3Ⅱ/Ⅰ表達水平比較

2.5 各組大鼠皮質(zhì)和海馬區(qū)自噬超微結(jié)構(gòu)比較

SHAM 組皮質(zhì)和海馬區(qū)可見少量的自噬小體，未見明顯的自噬溶酶體及吞噬泡；IS－YD 12 h 組、ISYD 24 h 組發(fā)生自噬較嚴重，可見明顯的自噬小體、自噬溶酶體。與模型組比較，HJF組和 ARG組可見自噬小體、自噬溶酶體顯著減少，并未見吞噬泡。說明化瘀解毒方、阿加曲班可以抑制模型大鼠大腦缺血側(cè)皮質(zhì)、海馬區(qū)自噬的發(fā)生。結(jié)果見圖11、圖12。

圖11 各組大鼠缺血側(cè)大腦皮質(zhì)區(qū)的自噬超微結(jié)構(gòu)（× 6 000）

圖12 各組大鼠缺血側(cè)大腦海馬區(qū)的自噬超微結(jié)構(gòu)（× 6 000）

3 討論

凝血酶在凝血級聯(lián)反應(yīng)被激活過程中，由不具備活性的前體凝血酶原裂解形成［19］，主要發(fā)揮止血功能［20］。研究發(fā)現(xiàn)，凝血酶原的表達存在于神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞中［21?22］。生理水平的凝血酶影響神經(jīng)的發(fā)育和保護［23］，促進腦組織活力，且對興奮性毒性有害因子有保護作用［24］。而高劑量的凝血酶則具有神經(jīng)毒性，能破壞血管，引發(fā)氧化應(yīng)激，可促進內(nèi)皮細胞、小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞的炎癥反應(yīng)［25］。高水平的凝血酶活性不僅是有害的，且缺血半球的凝血酶活性和梗塞體積之間具備顯著相關(guān)性［10］。

自噬是大多數(shù)真核生物在進化上高度保守的細胞行為，是自噬溶酶體系統(tǒng)對細胞質(zhì)內(nèi)異物、受損或老化細胞器的吞噬降解過程。通過及時清除受損細胞器，對維持細胞的自穩(wěn)狀態(tài)發(fā)揮重要作用。有證據(jù)表明［26?28］，自噬可參與腦卒中的發(fā)生和發(fā)展，在缺血性腦損傷期間被激活并且參與神經(jīng)元死亡的調(diào)節(jié)。然而自噬的作用復(fù)雜，其活性的增強在腦缺血過程中起有益作用還是有害作用尚未有定論且存在爭議，研究顯示，自噬在腦缺血發(fā)生和發(fā)展過程中，起到的是“雙刃劍”的作用［29］。適當?shù)淖允煽梢越到饧毎陨韮?nèi)容物供周圍細胞利用，挽救由于缺血瀕臨死亡的細胞，但另一方面，過度的自噬會導(dǎo)致細胞大量死亡。

營養(yǎng)因子缺乏、高溫、缺氧、激素刺激，可誘導(dǎo)自噬的發(fā)生［13］，凝血酶也可誘導(dǎo)細胞自噬的發(fā)生［13?14，30］。HU等［14］研究發(fā)現(xiàn)，人耳內(nèi)注射凝血酶能特異性地提高Beclin 1 和LC3 這兩種自噬標記物在星形膠質(zhì)細胞表達，并促進星形膠質(zhì)細胞內(nèi)而非神經(jīng)元內(nèi)自噬空泡的形成。在同側(cè)基底節(jié)中，耳內(nèi)注射凝血酶可增加LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的轉(zhuǎn)化、組織蛋白酶D 水平和自噬空泡的形成。MU 等［31］采用動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，腦出血患者血漿凝血酶－抗凝血酶（TAT）復(fù)合物濃度與腦出血嚴重程度呈正相關(guān)，且血腫周圍區(qū)域的神經(jīng)元存在自噬，凝血酶可能參與了這些神經(jīng)元自噬的激活。亦有研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細胞中的炎癥因子分泌、氧化應(yīng)激和自噬均可被凝血酶加重，而SPRED2 基因敲除可抑制凝血酶。證明凝血酶通過激活SPRED2 介導(dǎo)的自噬作用加重星形膠質(zhì)細胞的缺血再灌注損傷［32］。提示凝血酶可激活腦內(nèi)自噬，加重腦損傷。

本課題組前期探討了缺血性腦卒中進展過程中凝血酶、自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ在缺血2、4、8、12、24、48、72 h 7 個缺血時間點的動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)缺血性腦卒中后凝血酶與自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ的表達呈正相關(guān)，皮質(zhì)凝血酶與 LC3Ⅱ/Ⅰ的密切程度為56.7%，海馬二者的密切程度為 53.3%。且均在缺血12、24 h 達到高值，由此證明了凝血酶、自噬、缺氧缺血性腦損傷的變化三者之間均具有時間依賴性，同時為進一步研究治療腦梗死篩選了最佳藥物反應(yīng)時間點，可用于指導(dǎo)下一階段中藥復(fù)方的干預(yù)。且高水平的凝血酶活性、過度發(fā)生的自噬會促進大鼠神經(jīng)功能缺損，加重腦梗死體積占比。

本實驗采用阿加曲班作為陽性對照藥物，探討了化瘀解毒方對IS－YD大鼠的干預(yù)作用。結(jié)果表明，化瘀解毒方可顯著降低模型大鼠神經(jīng)功能評分和腦梗死體積占比，改善缺血側(cè)腦區(qū)病理形態(tài)學(xué)變化。此外，化瘀解毒方可抑制大鼠大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)的凝血酶活性，下調(diào)相應(yīng)腦區(qū)自噬指標LC3Ⅱ/Ⅰ的表達，并減少腦區(qū)自噬小體、自噬溶酶體、吞噬泡的數(shù)量。故認為化瘀解毒方可能是通過抑制凝血酶的活性，下調(diào)了自噬的發(fā)生，從而減輕神經(jīng)功能損傷，發(fā)揮抗腦缺血作用。