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比利時杜鵑花花青素合成酶基因(RhANS)克隆及其功能分析

2023-01-18 14:39:14蔣寶鑫楊國霞呂思佳賈永紅謝曉鴻吳月燕
核農(nóng)學(xué)報 2023年3期
關(guān)鍵詞:杜鵑花比利時花青素

蔣寶鑫 楊國霞 呂思佳 賈永紅 謝曉鴻 吳月燕,

(1浙江萬里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院,浙江 寧波 315100; 2浙江萬里學(xué)院設(shè)計藝術(shù)與建筑學(xué)院,浙江 寧波 315100)

杜鵑花(Rhododendron simsiiPlanch.)是雙子葉植物綱杜鵑花科杜鵑屬常綠落葉灌木,也是木本觀賞性植物[1]?;ㄉ鳛橛^賞植物的重要觀賞性狀之一,具有很高的園藝學(xué)研究價值,因此植物花色的研究對杜鵑花育種具有重要意義[2]。

在植物體內(nèi)花色素多且復(fù)雜,主要分為三大類:類黃酮(flavonoid)、類胡蘿卜素(carotenoid)以及生物堿(alkaloid),其中類黃酮是主要色素[3]?;ㄉ饕蕾囉诨ㄇ嗨睾皖惡}卜素[4],花青素作為類黃酮衍生物在植物生物學(xué)和人類健康中起著至關(guān)重要的作用[5],主要存在于花朵、葉子、果實(shí)、種子等組織的細(xì)胞液泡內(nèi)[6]。一些研究發(fā)現(xiàn),杜鵑花花瓣的色素主要包括花青素和黃酮醇,其中花青素主要成分為矢車菊素、矮牽牛素、天竺葵素、飛燕草素、芍藥花素和錦葵素花青素糖苷化合物。大部分花青素成分是花青素-3-O-糖苷(葡萄糖苷、蘆丁苷、半乳糖苷和二糖苷)化合物[2]。

目前杜鵑花雜交育種改良花色尚不清晰,因此通過研究其花青素形成機(jī)制,對于利用基因工程技術(shù)進(jìn)行花色改良尤為重要。在花青素的合成途徑中,花青素合成酶(anthocyanidin synthase,ANS)是合成途徑中最后一個關(guān)鍵酶,在植物體內(nèi)ANS基因表達(dá)量會影響花青素的積累[7]。植物體內(nèi)的ANS基因可以將無色的原花色素轉(zhuǎn)化為有色的花色苷元,其酶活性影響花色苷的合成[8]。ANS作為一種2-氧戊二酸和Fe(Ⅱ)依賴性加氧酶,與黃烷酮3-羥化酶(F3H)是同一加氧酶家族,能催化相同的底物[9]。首次報道由Saito[10]從紅色和綠色紫蘇(Perilla frutescens)中分離編碼ANS的CDNA序列。近年來,已經(jīng)對一些植物中花色化合物及合成機(jī)制進(jìn)行探究,已從紫娟茶(Camellia sinensisvar.assamica)[7]、華麗龍膽(Gentiana sino-ornata)[11]、郁金香(Tulipa gesnerianaL.)[12]、紫薇(Lagerstroemia indica)[13]、花生(Arachis hypogaeaLinn.)[14]、黃芩(Scutellaria baicalensisGeorgi)[15]、鳶尾花(Iris halophilaPall.)[16]及其他植物[17-18]中克隆出花青素合成酶(ANS)基因,發(fā)現(xiàn)ANS基因可以將無色花青素轉(zhuǎn)化為有色花青素,是花青素合成途徑的關(guān)鍵基因。但目前關(guān)于杜鵑花花色的分子機(jī)制的研究報道較少,杜鵑花花瓣色素沉著的調(diào)節(jié)因素仍有待研究[19]。前人研究表明,洋蔥(Allium cepa)鱗片中ANS基因發(fā)生點(diǎn)突變,使巴西黃洋蔥和美國紅洋蔥鱗片顏色發(fā)生改變[20]。Yan等[21]研究表明,ANS的功能缺陷或缺失會影響植物顏色的形成,導(dǎo)致無色或白色器官,表明了其在植物顏色形成中的重要性。Nakatsuka等[22]在夏堇(Torenia hybrida)中利用RNAi技術(shù)抑制體內(nèi)ANS基因的表達(dá),抑制后夏堇產(chǎn)生穩(wěn)定的白花。此外,ANS基因的表達(dá)水平以及基因突變對于花色苷的積累有著重要的影響,但杜鵑花ANS基因的相關(guān)研究仍鮮有報道,對其功能的驗(yàn)證、酶學(xué)性質(zhì)等尚不清晰。Ye等[23]研究表明,桃[Prunus persica(L.) Batsch]中重組PpANS蛋白可以催化無色花青素形成花青素。Pang等[24]在蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)中重組MtANS蛋白可以將無色花青素轉(zhuǎn)化為花青素?;谝陨涎芯?,推測ANS基因可能是比利時杜鵑花合成花青素含量的關(guān)鍵酶基因。

為了驗(yàn)證上述推測,本研究以紅色比利時杜鵑花(Rhododendron hybridumHort.)4個時期(花苞期、初開期、盛開期和衰亡期)花瓣和盛開期根、莖、葉為試驗(yàn)材料,測定4個時期花瓣花青素的含量,克隆杜鵑花ANS基因的開放閱讀框(open reading frame,ORF)全長,并進(jìn)行生物信息學(xué)分析;對杜鵑花4個時期花瓣和盛開期不同器官ANS基因表達(dá)量進(jìn)行測定,并探究比利時杜鵑花不同發(fā)育時期花瓣ANS基因表達(dá)量與花青素含量的關(guān)系;構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-28-RhANS,制備重組蛋白,利用高效液相色譜儀(high performance liquid chromatography,HPLC)檢測RhANS體外酶活性,對RhANS進(jìn)行功能分析,鑒定重組蛋白的功能,旨在為了解植物觀賞價值和杜鵑花花色素形成的分子機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料于2022年3月在中國寧波北侖柴橋萬景杜鵑良種園(121°27′40″~122°10′22″E,29°41′44″~29°58′48″N)中采集,選擇生長良好的紅色比利時杜鵑花花苞期(S1)、初開期(S2)、盛開期(S3)、衰亡期(S4)和盛開期根、莖和葉為試驗(yàn)材料(圖1-A、B)。采后立即置于液氮中,然后放入-80 ℃條件下儲存?zhèn)溆谩C總€樣品均設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。

圖1 比利時杜鵑花不同花期花瓣形態(tài)(A)和盛開期器官(B)Fig.1 Petal at different flowering stages (A) and tissues and organs at full opening stages (B) of Rhododendron hybridum Hort.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花青素含量測定分析 參考黃玲等[12]和趙偉等[25]的方法進(jìn)行花青素測定:將4個發(fā)育時期的花瓣樣品經(jīng)液氮研磨成粉末,稱取100 mg花瓣粉末加入1.0 mL 1%鹽酸-甲醇中,4 ℃黑暗條件下靜置12 h,期間渦旋3次。12 000 r·min-1離心10 min,吸取上清,使用0.22 μm微孔濾膜過濾樣品,保存于進(jìn)樣瓶中備用。利用UPLC-Qtof超高效液相色譜儀(Waters,美國)對4個發(fā)育時期的花瓣樣品色素提取液進(jìn)行分析。標(biāo)準(zhǔn)品為矢車菊素-3-O-葡萄糖(Cy3G)(上海源葉生物科技有限公司)。

1.2.2 總RNA的提取及cDNA合成 取-80 ℃條件下保存的比利時杜鵑花樣品,用液氮研磨,使用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取花瓣總RNA。通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳儀(北京六一生物科技有限公司)和SpectraMax 190全波長酶標(biāo)儀(北京龍躍生物科技發(fā)展有限公司)測定總RNA的質(zhì)量和濃度。按照NovoScript?Plus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix (gDNA Purge)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海近岸科技有限公司)說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用SMARTer?RACE 5′∕3′ Kit RACE試劑盒[寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司]說明書逆轉(zhuǎn)錄合成3′∕5′cDNA[26]。

1.2.3RhANS基因的克隆 從美國國家生物技術(shù)信息 中 心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)數(shù)據(jù)庫中下載與杜鵑花屬植物親緣關(guān)系較近植物的ANS基因序列。使用Primer 6.0軟件進(jìn)行簡并引物ANS-R1和ANS-F1設(shè)計(表1)。以杜鵑花cDNA為模板,按照2×EasyTaq?PCR Super Mix酶(北京全式金生物技術(shù)股份有限公司)說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增。保守區(qū)域擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測,回收目的片段產(chǎn)物,將回收產(chǎn)物與pEASY?-BluntCloningKit(北京全式金生物技術(shù)股份有限公司)載體連接并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中。將感受態(tài)細(xì)胞均勻涂布于具有卡那霉素(kanamycin,Kan, 100 mg·mL-1)抗性的LB固體培養(yǎng)基上,將平板倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。挑取培養(yǎng)后的單一菌落,利用M13F和M13R通用引物進(jìn)行菌液PCR,篩選陽性克隆菌,進(jìn)行序列測定(北京擎科生物科技有限公司),從而獲得目的基因的保守序列。使用Primer 6.0軟件設(shè)計RACEANS-5′∕3′引物(表1)。按照2×FastPfuMasterMix酶(上海近岸科技有限公司)說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增。后續(xù)試驗(yàn)過程與保守區(qū)域克隆相同,從而獲得ANS-5′和ANS-3′基因的核苷酸序列。使用DNAMAN 8軟件進(jìn)行序列拼接,根據(jù)拼接結(jié)果使用Primer 6.0軟件設(shè)計全長引物ANS-R2和ANS-F2(表1),在起始密碼子前和終止密碼子后設(shè)計引物,按照2×FastPfuMasterMix酶說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增。后續(xù)試驗(yàn)過程與保守區(qū)域克隆相同。

表1 本研究所用的引物序列Table 1 Primers sequence used in this study

1.2.4 生物學(xué)信息分析 采用DNAMAN 8.0軟件進(jìn)行同源蛋白質(zhì)序列比對;采用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn) 化 樹;采 用ProtParam網(wǎng) 站(http:∕∕web.expasy.org∕protparam)對RhANS蛋白進(jìn)行理化特性分析;采用ProtScale網(wǎng)站(http:∕∕web.expasy.org∕protscale)對RhANS蛋白進(jìn)行疏水性分析;采用SOPMA 網(wǎng)站(https:∕∕npsaprabi.ibcp.fr∕)對RhANS蛋白進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測;采用Swiss Model網(wǎng)站(https:∕∕www.swissmodel.expasy.org∕)對RhANS蛋白質(zhì)進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測;采用CDD網(wǎng)站(https:∕∕www.ncbi.nlm.nih.gov∕cdd∕)對RhANS蛋白進(jìn)行功能結(jié)構(gòu)域分析;采用NetPhos 網(wǎng)站(http:∕∕www.cbs.dtu.dk∕services∕NetPhos∕)對RhANS蛋白進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)分析。

1.2.5RhANS實(shí)時熒光定量PCR(quantitative realtime PCR,qRT-PCR)分析 參考劉小飛等[27]的方法進(jìn)行qRT-PCR內(nèi)參基因篩選及驗(yàn)證,選擇Actin-R和Actin-F作為內(nèi)參基因。利用Primer 6.0軟件設(shè)計qRT-PCR引物ANS-R3和ANS-F3(表1)。選擇4個發(fā)育階段比利時杜鵑花品種花瓣和不同組織作為試驗(yàn)材料,使用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司,北京)提取總RNA。根據(jù)

NovoScript?Plus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix (gDNA Purge)試劑盒(上海近岸科技有限公司)合成熒光cDNA。使用2×NovoStart?SYBR qPCR SuperMix Plus試劑盒(上海近岸科技有限公司)進(jìn)行qRT-PCR分析。反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性1 min;95℃退火20 s,60℃延伸1 min,30個循環(huán)。采用2-ΔΔCT法[28]計算基因相對表達(dá)量。

1.2.6RhANS基因的原核表達(dá) 使用Primer 6.0軟件設(shè)計帶有酶切位點(diǎn)的上下游引物ANS-R5和ANS-F5(表1)。以杜鵑花cDNA為模版,利用2×EasyTaq?PCR Super Mix酶(北京全式金生物技術(shù)股份有限公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,后續(xù)試驗(yàn)過程與保守區(qū)域克隆相同,獲得帶有酶切位點(diǎn)的ANS基因全部核苷酸序列。

用EcoRI-HF酶[紐英倫生物技術(shù)(北京)有限公司]將pET-28a質(zhì)粒(武漢淼靈生物科技有限公司)進(jìn)行單酶切,酶切產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測,并進(jìn)行割膠回收純化。使用NovoRec?plus One step PCR Cloning Kit連接酶試劑盒(上海近岸科技有限公司),將純化產(chǎn)物按載體片段和插入片段摩爾比1∶2連接,再將連接后的pET-28a-RhANS載體輕輕混勻加入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。將菌液均勻涂布在含Kan的抗生素平板上,37 ℃倒置過夜培養(yǎng)。挑取重組的單一菌落進(jìn)行菌液PCR鑒定,將質(zhì)粒送至杭州擎科生物有限公司測序。

1.2.7 RhANS重組蛋白制備與純化 將重組質(zhì)粒pET-28a-RhANS和空載質(zhì)粒pET-28a,加入大腸桿菌BL21(DE3,pLysS chemically competent cell)感受態(tài)細(xì)胞中輕輕混勻。將轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細(xì)胞加到含Kan抗性的固體培養(yǎng)基中,37 ℃倒置過夜培養(yǎng)。挑取重組的單一菌落進(jìn)行菌液PCR鑒定。將重組質(zhì)粒pET-28a-RhANS和空載質(zhì)粒pET-28a陽性菌落預(yù)培養(yǎng)于10 mL含有Kan抗性的LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃、200 r·min-1過夜。當(dāng)菌液吸光度A600nm達(dá)到0.5~0.8時,加入238 μL 0.5 mmol·L-1IPTG溶液,在37 ℃條件下誘導(dǎo)重組蛋白8 h[29]。誘導(dǎo)結(jié)束后于4 ℃、8 000 r·min-1條件離心10 min收菌,用2 mL 0.1%磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)懸浮沉淀,對沉淀進(jìn)行超聲處理,4 ℃、13 000 r·min-1離 心10 min后 吸 取 上 清 液,用2 mL 0.1% PBS懸浮沉淀。分別收集上清和沉淀,然后取20 μL蛋白樣品加入20 μL二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT)混勻,100 ℃水浴加熱5~10 min,使蛋白變性,冷卻至室溫后,進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(10% SDS polyacrylamide gel electrophoresis,10% SDS-PAGE)可溶性重組蛋白驗(yàn)證。使用His60鎳超流樹脂和重力柱[寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司]對可溶性重組蛋白進(jìn)行純化,收集洗脫液,將洗脫液中進(jìn)行10% SDS-PAGE分析。

1.2.8 RhANS蛋白體外酶活檢測 將純化的重組蛋白pET-28a-RhANS(100 μL)和pET-28a空載體蛋白(100 μL)溶解于8 mmol·L-1抗壞血酸鈉(C6H7O6Na)、400 mmol·L-1氯化鈉(NaCl)、2 mmol·L-12-氧化戊二酸(C5H6O5)、20 mmol·L-1麥芽糖(C12H22O11·H2O)、10 mmol·L-1二 硫 蘇 糖 醇(DTT)、1 mmol·L-1FeSO4、1 μmol·L-13,4-順式花青素和40 mmol·L-1KPi緩沖液(pH值7.5)體系中,反應(yīng)總體積為500 μL。在30 ℃,孵育1 h后,加入8 μL 18% 鹽酸(HCl)和40 μL甲醇終止反應(yīng)。樣品于12 000 r·min-1離心5 min,將樣品中上清液通過0.22 μm孔徑濾膜過濾。采用Waters超高效液相色譜儀(美國沃特世公司),Acquuity uplc beh C18色譜柱(1.7 μm,2.1×100 μm,美國沃特世公司)對樣品上清液進(jìn)行分析。在530 nm處檢測蛋白樣品,采用二元流動相方法檢測,流動相A為1% 磷酸,流動相B為含50% 甲酸的乙腈,流速為1 mL·min-1。以空載pET-28a的BL21為對照[9,23]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利 用Origin 2018、DNAMAN 8.0、Primer 5.0、MEGA 6.0、SPSS 17.0和Excel 2007軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析;所有數(shù)據(jù)均設(shè)3組生物學(xué)重復(fù),采用單因素方差分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 比利時杜鵑花發(fā)育過程中色素含量分析

利用Waters UPLC-Qtof超高效液相色譜儀對1% 鹽酸-甲醇稀釋的Cy3G標(biāo)準(zhǔn)品和不同發(fā)育階段花瓣進(jìn)行峰面積測定,獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程(y=36.52x-59.18)和相關(guān)系數(shù)(R2=0.998)。將不同發(fā)育階段花瓣的峰面積帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果如圖2所示。在比利時杜鵑花不同發(fā)育階段的花瓣中,花青素含量呈逐漸上升的變化趨勢且存在顯著差異,在S4時期含量最高,是S1時期的3.18倍;花青素含量在S1和S2時期積累量較少,在S3和S4時期積累量較多。

圖2 比利時杜鵑花花瓣不同發(fā)育階段花青素苷含量Fig.2 Anthocyanin content of Rhododendron hybridum Hort. petals at different developmental stages

2.2 RhANS基因的克隆及生物學(xué)信息分析

以比利時杜鵑花cDNA為模板,利用簡并引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得687 bp保守區(qū)序列(圖3-A);根據(jù)保守區(qū)序列進(jìn)行RACE擴(kuò)增,分別獲得897 bp的5′序列(圖3-B)和693 bp的3′序列(圖3-C)。利用DNAMAN 8.0軟件將保守區(qū)、5′區(qū)和3′區(qū)序列進(jìn)行比對拼接,得到ANS基因全長為1 350 bp,其中包含1 074 bp的完整ORF序列(圖3-D),編碼357個氨基酸。

圖3 比利時杜鵑花ANS基因PCR擴(kuò)增Fig.3 PCR amplification of Rhododendron hybridum Hort. ANS gene

使用DNAMAN 8.0軟件將RhANS氨基酸序列與其他物種的氨基酸序列進(jìn)行比對(圖4)。結(jié)果顯示,杜鵑花ANS與其他植物ANS氨基酸序列相比較具有較高的同源性,RhANS蛋白是一個典型的2OG-Fe(Ⅱ)加氧酶結(jié)構(gòu)域,該保守域?yàn)锳NS的特征結(jié)構(gòu)域。RhANS蛋白包含由His236、Asp238和His292組成的鐵離子結(jié)合位點(diǎn)(HxDxnH),以及由Arg302和Ser304構(gòu)成的2-酮戊二酸的結(jié)合位點(diǎn)(RxS)。

圖4 比利時杜鵑花與其他植物ANS氨基酸序列的多重比較Fig.4 Multiple comparison of amino acid sequences of Rhododendron hybridum Hort. with ANS of other plants

使用MEGA 6.0軟件對杜鵑花與21種植物ANS氨基酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹(圖5)。結(jié)果顯示,杜鵑花ANS氨基酸序列與其他物種ANS蛋白有較高的保守性,其中比利時杜鵑花ANS蛋白與越橘(AFA53722.1)親緣關(guān)系最近。

圖5 比利時杜鵑花ANS與其他物種ANS蛋白質(zhì)的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of ANS of Rhododendron hybridum Hort. with ANS proteins of other species

2.3 RhANS蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析

2.3.1 RhANS蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域分析 采用CDD對RhANS蛋白進(jìn)行功能結(jié)構(gòu)域分析(圖6)。結(jié)果表明,比利時杜鵑花ANS蛋白屬于2-氧戊二酸(2OG)和 Fe(Ⅱ)依賴性加氧酶超家族。

圖6 比利時杜鵑花ANS基因編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域Fig.6 Conservative domains of ANS encoding protein in Rhododendron hybridum Hort

2.3.2 RhANS蛋白質(zhì)理化特性分析 利用ProtParam分析,得到RhANS蛋白的分子式為C1809H2843N483O537S13,相對分子質(zhì)量為40 367.17 Da、理論等電點(diǎn)為5.83,總負(fù)電荷殘基(Asp+Glu)為53,總正電荷殘基(Arg + Lys)為43,不穩(wěn)定指數(shù)(Ⅱ)為48.58,脂肪系數(shù)為84.93。比利時杜鵑ANS蛋白為不穩(wěn)定帶負(fù)電荷的酸性蛋白質(zhì)。

2.3.3 RhANS蛋白疏水性分析 采用ProtScale對RhANS蛋白進(jìn)行疏水性分析(圖7)。結(jié)果顯示,ANS蛋白質(zhì)存在明顯的疏水區(qū)和親水區(qū),其中第191位疏水區(qū)最高為2.456;第45和第46位親水區(qū)最低,為-3.000。綜上可知,RhANS蛋白質(zhì)為親水性蛋白質(zhì)。

圖7 比利時杜鵑花ANS蛋白質(zhì)疏水性/親水性預(yù)測Fig.7 Prediction of the hydrophobic/hydrophilic of ANS in Rhododendron hybridum Hort.

2.3.4 RhANS蛋白磷酸化位點(diǎn)分析 利用NetPhos 進(jìn)行推測,結(jié)果顯示比利時杜鵑花ANS蛋白質(zhì)存在30個磷酸化位點(diǎn),其中包含12個絲氨酸(Ser),12個蘇氨酸(Thr),6個酪氨酸(Tyr)(圖8)。

圖8 比利時杜鵑花ANS蛋白質(zhì)氨基酸翻譯后磷酸化修飾預(yù)測Fig.8 Prediction of phosphorylation site after amino acid translation of ANS protein in Rhododendron hybridum Hort.

2.3.5 RhANS蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測 利用SOPMA 對RhANS蛋白質(zhì)進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測,結(jié)果如圖9所示。有121個氨基酸參與形成α-螺旋,占總氨基酸的33.89%;有58個氨基酸參與形成延伸鏈,占總氨基酸的16.25%;有19個氨基酸參與β-轉(zhuǎn)角,占總氨基酸的5.32%;有159個氨基酸參與形成無規(guī)則卷曲,占總氨基酸的44.54%。結(jié)果表明,比利時杜鵑花ANS蛋白主要由不規(guī)則卷曲、α-螺旋和延伸鏈結(jié)構(gòu)組成。

圖9 比利時杜鵑花ANS蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.9 Predicted secondary structure of ANS protein in Rhododendron hybridum Hort.

采用Swiss Model對RhANS蛋白質(zhì)進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測(圖10),在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中選擇與ANS蛋白質(zhì)序列一致性最高的蛋白質(zhì)為模板進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測,得到杜鵑ANS蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)模型。結(jié)果表明,比利時杜鵑花ANS蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果相符,主要是由α-螺旋和不規(guī)則卷曲構(gòu)成。

圖10 比利時杜鵑花ANS蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.10 Prediction of the three level structure of ANS protein in Rhododendron hybridum Hort.

2.4 比利時杜鵑花不同時期花瓣以及根、莖和葉中ANS基因的表達(dá)量分析

為探究RhANS對花青素合成的影響,通過qRTPCR分析RhANS在比利時杜鵑花花瓣不同發(fā)育階段以及根、莖和葉中的表達(dá)量。如圖11所示,RhANS在比利時杜鵑花花瓣發(fā)育不同時期以及根、莖、葉中均有表達(dá)。在4個花期的花瓣中,隨花瓣的發(fā)育ANS基因的表達(dá)水平呈上升趨勢,在S4時期表達(dá)量達(dá)到最高,是S1時期的6.39倍。RhANS基因在比利時杜鵑花花瓣中的表達(dá)量均比根、莖和葉組織中表達(dá)量高。在不同組織器官中,ANS在葉中表達(dá)量最高,莖和根中表達(dá)量無顯著差異。隨花瓣的發(fā)育RhANS表達(dá)量與花青素含量均呈上升趨勢,推測RhANS基因表達(dá)量影響花青素的合成。

圖11 比利時杜鵑花不同發(fā)育階段花瓣及不同組織的ANS基因表達(dá)量Fig.11 Expression of ANS genes in petals and tissues at different developmental stages of Rhododendron hybridum Hort.

2.5 RhANS蛋白制備、純化及體外酶活性分析

將測序正確的重組質(zhì)粒pET-28-RhANS和空載質(zhì)粒pET-28轉(zhuǎn)入大腸桿菌(BL21)中,以不含質(zhì)粒的大腸桿菌和空載質(zhì)粒pET-28轉(zhuǎn)入大腸桿菌作為蛋白陰性對照。如圖12所示,通過10% SDS-PAGE的可溶性蛋白大小約為40 kDa,與預(yù)期大小相近,說明RhANS蛋白在大腸桿菌中成功表達(dá)。

圖12 重組RhANS蛋白的10% SDS-PAGE分析Fig.12 10% SDS-PAGE analysis of recombinant RhANS protein

使用His60鎳超流樹脂和重力柱對6加入IPTG誘導(dǎo)劑的pET-28-RhANS重組質(zhì)粒中進(jìn)行蛋白純化,用10% SDS-PAGE電泳分析,結(jié)果如圖13所示。純化后的RhANS蛋白大小約為40 kDa,與理論值相近。

圖13 重組RhANS蛋白純化后的10% SDS-PAGE分析Fig.13 10% SDS-PAGE analysis of recombinant RhANS protein after purification

在2-氧戊二酸(2OG)和Fe(Ⅱ)的作用下,純化的重組pET-28a-RhANS蛋白催化底物3,4-順式花青素,使用HPLC在530 nm處檢測純化的RhANS蛋白的活性。純化的重組pET-28a-RhANS蛋白催化底物3,4-順式花青素形成花青素,通過與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間和UV∕Vis光譜進(jìn)行比較,確認(rèn)其為花青素(圖14-A、C);與空載體對照顯示,3,4-順式花青素未被催化為花青素(cyanidin)(圖14-B)。結(jié)果表明,純化后重組蛋白pET-28a-RhANS蛋白具有酶活性。

圖14 3,4-順式花青素為底物催化重組RhANS蛋白產(chǎn)物分析Fig.14 Analysis of 3,4-cis-anthocyanidin as substrate catalyzed recombinant RhANS protein product

3 討論

杜鵑花作為重要的觀賞性植物,花色是觀賞性植物最重要的定性特征之一。花青素在花色形成中起著主導(dǎo)作用,但花青素的合成通路相關(guān)基因在杜鵑花花色形成過程中報道較少。為進(jìn)一步探究杜鵑花花色形成的生物學(xué)特性,本研究首次從比利時杜鵑花中克隆花青素合成酶(ANS)基因,其ORF長度為1 074 bp,編碼357個氨基酸。RhANS基因保守結(jié)構(gòu)域分析表明,比利時杜鵑花ANS編碼蛋白屬于2-氧戊二酸(2OG)和Fe(Ⅱ)依賴性加氧酶超家族。李小蘭等[30]預(yù)測花青素合成酶ANS基因具有Fe2+的2-酮戊二酸[2OG-Fe(Ⅱ)]雙加氧酶家族,與本研究結(jié)果相符。本研究發(fā)現(xiàn),比利時杜鵑花ANS蛋白包含由His236、Asp238和His292組成的鐵離子結(jié)合位點(diǎn)(HxDxnH),以及由Arg302和Ser304構(gòu)成的2-酮戊二酸的結(jié)合位點(diǎn)(RxS)。趙榮等[31]預(yù)測墨法師(Aeonium arboreum)AaANS1蛋白包含由His236、Asp238和His292組成的鐵離子結(jié)合位點(diǎn)(HxDxnH)以及由Arg302和Ser304構(gòu)成2-酮戊二酸的結(jié)合位點(diǎn)(RxS),與本研究預(yù)測結(jié)果相符。本研究發(fā)現(xiàn)比利時杜鵑花ANS蛋白為不穩(wěn)定帶負(fù)電荷的酸性親水性蛋白質(zhì),與陳可欣等[13]預(yù)測紫薇LiANS蛋白質(zhì)理化特性和蛋白疏水性結(jié)果相符。RhANS蛋白磷酸化位點(diǎn)分析表明,比利時杜鵑花ANS蛋白存在30個磷酸化位點(diǎn),其中含有12個絲氨酸(Ser),12個蘇氨酸(Thr),6個酪氨酸(Tyr),與趙榮等[31]預(yù)測墨法師AaANS1蛋白磷酸化位點(diǎn)存在酪氨酸(Tyr)、蘇氨酸(Thr)和絲氨酸(Ser)殘基的結(jié)果相似。通過對RhANS蛋白質(zhì)二三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析可知,比利時杜鵑花ANS蛋白主要由無規(guī)則卷曲、α-螺旋和延伸鏈組成,與陳可欣等[13]紫薇LiANS蛋白質(zhì)二三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果相似。通過構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn),杜鵑花ANS蛋白與越橘ANS蛋白(AFA53722.1)親緣關(guān)系較最近。本研究表明,RhANS基因在花色形成過程中起重要的作用。RhANS表達(dá)量在比利時杜鵑花花瓣的不同發(fā)育時期以及根、莖、葉中均表達(dá),在衰亡期(S4)時期表達(dá)量最高,在花苞期(S1)時期表達(dá)量最低。隨著花瓣的發(fā)育,RhANS基因相對表達(dá)量與花青素含量均呈上升趨勢,這與黃玲等[12]關(guān)于郁金香ANS基因表達(dá)水平和花青素苷的研究結(jié)果一致。在比利時杜鵑花不同組織器官中,葉中表達(dá)量最高,莖和根中表達(dá)量較低。衡蒙等[11]發(fā)現(xiàn),在華麗龍膽中,GsANS基因在根、莖、葉中的表達(dá)量均比花冠低,其中在葉中表達(dá)量最高,莖中最低,推測比利時杜鵑花花瓣中花青素的含量與ANS基因表達(dá)量呈高度相關(guān),ANS基因在比利時杜鵑花花青素合成中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究發(fā)現(xiàn),比利時杜鵑花RhANS蛋白純化前可溶性重組蛋白大小約為40 kDa。His60鎳超流樹脂和重力柱純化后的RhANS蛋白大小約為40 kDa,與生物信息學(xué)預(yù)測的RhANS蛋白大小相近。體外酶活測定發(fā)現(xiàn),目的蛋白具有ANS酶活性,這與Ye等[23]、Pang等[24]和姜翠翠等[29]關(guān)于ANS蛋白大小及體外酶活的研究結(jié)果基本一致。由此推測比利時杜鵑花RhANS蛋白具有酶活性,為進(jìn)一步驗(yàn)證RhANS基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

本研究深入研究了比利時杜鵑花克隆的ANS基因,后續(xù)可以通過關(guān)鍵基因的過表達(dá)[32]、基因沉默[33]、RNAi介導(dǎo)[34]等技術(shù)實(shí)現(xiàn)觀賞性植物花色新種質(zhì)創(chuàng)新,進(jìn)一步提高植物觀賞價值和品質(zhì)。此外,前人研究發(fā)現(xiàn)在東方百合[35]、煙草[9]中存在ANS基因家族,但在比利時杜鵑花中是否存在ANS基因家族,還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究首次從比利時杜鵑花中克隆出花青素合成酶(ANS)基因,全長1 074 bp,編碼357個氨基酸。比利時杜鵑花ANS蛋白屬于 2-氧戊二酸(2OG)和Fe(Ⅱ)依賴性加氧酶超家族,包含由His236、Asp238和His292組成的鐵離子結(jié)合位點(diǎn)(HxDxnH)以及由Arg302和Ser304構(gòu)成2-酮戊二酸的結(jié)合位點(diǎn)(RxS)。比利時杜鵑花ANS蛋白與越橘ANS蛋白(AFA53722.1)親緣關(guān)系較近。比利時杜鵑花ANS蛋白為不穩(wěn)定帶負(fù)電荷的酸性親水性蛋白。在比利時杜鵑花中,花青素含量和RhANS表達(dá)量都隨著花瓣的發(fā)育呈上升趨勢。在比利時不同組織器官中,葉中RhANS表達(dá)量最高,莖和根中表達(dá)量無顯著差異。通過構(gòu)建pET-28a-RhANS原核表達(dá)載體誘導(dǎo)的蛋白大小約為40 kDa。HPLC檢測表明,RhANS蛋白具有ANS酶活性。

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