武 霞,許藝蘭,文露婷,黃 姻,覃俊奇,周康奇,杜雪松,陳 忠,潘賢輝,賓石玉，3*

(1.廣西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣西 桂林 541006；2.廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)科學(xué)研究院 廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530021；3.珍稀瀕危動植物生態(tài)與環(huán)境保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 桂林 541006)

全州禾花鯉Cyprinuscarpio又名禾花魚、禾花烏鯉，隸屬鯉形目Cypriniformes鯉科Cyprinidae鯉屬Cyprinus(Linnaeus, 1758)，原產(chǎn)于廣西全州縣[1]，是我國稻魚共生系統(tǒng)農(nóng)作模式保存和維系而來的寶貴種質(zhì)資源。該群體經(jīng)過長期稻田環(huán)境馴化和人工選擇，形成了有別于其他養(yǎng)殖鯉魚群體的獨(dú)特表型。在體色上，表現(xiàn)為烏褐色，背部顏色稍深，鰓蓋、腹部肌肉具有半透明特點(diǎn)，魚鰓和內(nèi)臟隱約可見；在體型上，表現(xiàn)為體型較短，腹部較大，頭背間呈緩緩上升的弧形，背部稍隆起；在品質(zhì)方面，魚骨、肌間刺柔軟且硬度小，肉質(zhì)清甜、無土腥味[2]。廣西桂北地區(qū)利用全州禾花鯉發(fā)展稻漁綜合種養(yǎng)，顯著提高了稻田的單位產(chǎn)出和綜合效益[3]。目前該群體已被廣東、湖南、貴州等省引進(jìn)養(yǎng)殖，發(fā)展迅速。鯉是我國大宗淡水養(yǎng)殖魚類[4]之一，且具有豐富的體色遺傳變異類型。全州禾花鯉作為地方性養(yǎng)殖群體，其體色性狀特殊，尤其是半透明特征，與我國常見的甌江彩鯉Cyprinuscarpiovar.color、荷包紅鯉CyprinuscarpioRedvar.vuyuanensis、興國紅鯉Cyprinuscarpiovar.singuonensis、錦鯉Cyprinuscarpio等養(yǎng)殖品系之間差異顯著，從而體色性狀成為區(qū)分和鑒別全州禾花鯉的直接依據(jù)，具有重要的經(jīng)濟(jì)價值。

魚類體色性狀的形成和維持受一系列基因、細(xì)胞、生理因素和環(huán)境因素的復(fù)雜調(diào)控[5]，且體色構(gòu)成與色素合成、皮膚、鱗片所含色素細(xì)胞的種類、數(shù)量、分布及色素細(xì)胞之間的相互作用具有密切聯(lián)系[6]。鯉的體色性狀作為關(guān)鍵經(jīng)濟(jì)性狀之一受到廣泛的關(guān)注和研究，隨著鯉魚全基因組的發(fā)布[7]和不斷更新[8]，近幾年利用基因組學(xué)手段對不同體色類型的鯉魚開展了很多研究[9-10]，其體色基因表達(dá)模式、特異和差異表達(dá)的基因篩選等工作取得重要進(jìn)展，鯉的體色決定機(jī)制研究更加深入[11]。截止目前，尚未見國內(nèi)外其他養(yǎng)殖鯉魚群體具有與全州禾花鯉類似體色性狀的研究報道，該體色性狀可能是另一種獨(dú)特的鯉魚體色性狀，負(fù)載著有別于其他鯉魚品種的體色決定機(jī)制多樣性，深入研究可能發(fā)現(xiàn)和闡釋新的體色調(diào)控機(jī)制。本文以建鯉Cyprinuscarpiovar. Jian為對照，從外觀形態(tài)、色素細(xì)胞構(gòu)成、皮膚色素含量等方面探討全州禾花鯉體色性狀特征及其與其他鯉魚品系的差異，擬為進(jìn)一步研究全州禾花鯉體色性狀決定機(jī)制提供資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料、儀器及試劑

1.1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)魚采自廣西農(nóng)業(yè)良種海南南繁育種基地保存的全州禾花鯉和建鯉群體，具體規(guī)格信息見表1。全州禾花鯉群體為2017年從全州縣才灣鎮(zhèn)引進(jìn)的禾花鯉群體，建鯉為2019年從廣西安桂水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司引進(jìn)的商品系。

表1 全州禾花鯉和建鯉采樣規(guī)格信息Tab. 1 Sampling specification information of rice flower carp in Quanzhou and Cyprinus carpio var. Jian

1.1.2 主要儀器與試劑

LEICA DM1000 LED光學(xué)顯微鏡、PS40A超聲清洗儀(深華泰科學(xué)儀器有限公司)；TG-16G臺式高速離心機(jī)(湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司)；KZ-II高速組織研磨儀(武漢賽維爾生物科技有限公司)；Infinite M Nano+熒光多模式酶標(biāo)儀(瑞士帝肯)；Nikon Eclipse E100正置光學(xué)顯微鏡及NIKON DS-U3成像系統(tǒng)(日本尼康)。

三卡因甲磺酸鹽(MS-222)購自 Sigma 中國公司，無水乙醇、PBS緩沖液購自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外部形態(tài)觀察

選取體色體型優(yōu)良的全州禾花鯉和建鯉，直接觀察并記錄體表體色情況。

1.2.2 鱗片、鰭條及皮膚色素細(xì)胞觀察

試驗(yàn)魚采用MS-222 (100 mg/L)麻醉，酒精棉球擦洗魚體，用鑷子在魚體背部、腹部區(qū)域各取4～5片鱗片，用PBS緩沖液漂洗后置于載玻片上觀察并拍照，部分鱗片置于載玻片上，用蓋玻片輕壓，使虹彩細(xì)胞破碎，釋放出鳥嘌呤晶體，顯微鏡觀察并拍照；剪取背鰭鰭條置于載玻片上，用光學(xué)顯微鏡觀察并拍照；手術(shù)刀刀柄刮去魚體背部、腹部的鱗片，剝離皮膚，切取1 cm×1 cm制成玻片標(biāo)本進(jìn)行皮膚色素細(xì)胞觀察并拍照。

1.2.3 皮膚組織切片與細(xì)胞觀察

分別選取20、250日齡的禾花鯉和建鯉，在其背部取5 mm×5 mm的皮膚組織塊，使用通用性組織固定液固定24 h以上，經(jīng)乙醇梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后縱切，蘇木精-伊紅(HE)染色，中性樹膠封片，顯微鏡拍片后，用CaseViever軟件查看。

1.2.4 皮膚組織色素含量測定

采用魚黑色素(Melanin)酶聯(lián)免疫分析試劑盒測定魚體皮膚的黑色素含量；采用waters 2695 液相色譜儀+2998光電二級陣列檢測器檢測葉黃素、玉米黃素、α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素[12]含量。液相條件：色譜柱為Agilent LC-C18 (4.6 mm×250 mm, 5 μm)，二極管陣列檢測器，柱溫35 ℃，流動相(A：乙腈，B：異丙醇)，流速1.0 mL/min，檢測波長450 nm，進(jìn)樣體積10 μL。

類胡蘿卜素組分含量計算公式為

式中：X為試樣中類胡蘿卜素總量，單位mg/kg；c為樣品提取液中類胡蘿卜素的質(zhì)量濃度，單位μg/mL；V1為復(fù)溶體積、V2為提取總體積、V3為取出提取液氮吹的體積，單位mL；m為實(shí)際檢測試樣質(zhì)量，單位g。

2 結(jié)果與分析

2.1 外部形態(tài)觀察

比較2種鯉的外部形態(tài)發(fā)現(xiàn)：全州禾花鯉體型粗短，腹部肥大，背部烏褐色，腹部較白半透明，隱約可見內(nèi)臟；建鯉體型偏扁長，體色為青灰色，全身反射金屬光澤(圖1)。局部觀察發(fā)現(xiàn)：全州禾花鯉頭部皮膚整體為烏褐色、鰓蓋透明，可清晰看見鰓片；背部皮膚為烏褐色，腹部皮膚半透明，隱約可見內(nèi)臟；鰭條顏色較淺，色素沉積少。建鯉鰓蓋部分不透明，反射出金色的金屬光澤；背部皮膚為青灰色，有金屬光澤，腹部顏色較于背部稍淺；鰭條顏色較深，色素沉積較多(圖2)。

圖1 全州禾花鯉和建鯉的外部形態(tài)觀察Fig. 1 Observation on external morphology of rice flower carp in Quanzhou and Cyprinus carpio var. Jian

A～D分別為全州禾花鯉的頭部、背部皮膚、腹部皮膚和背鰭； E～H分別為建鯉的頭部、背部皮膚、腹部皮膚和背鰭圖2 全州禾花鯉和建鯉的局部形態(tài)觀察Fig. 2 Observation on local morphology of rice flower carp in Quanzhou and Cyprinus carpio var. Jian

2.2 鱗片色素細(xì)胞觀察

鱗片色素細(xì)胞比較表明：全州禾花鯉鱗片黑色素細(xì)胞數(shù)量多于建鯉，且越靠近鱗片頂區(qū)邊緣的黑色素細(xì)胞體積越大；建鯉鱗片含有大量虹彩細(xì)胞，位于黑色素細(xì)胞層和黃色素細(xì)胞層的下層或間隙之中，分布于整個鱗片頂區(qū)，越靠近頂區(qū)邊緣，虹彩細(xì)胞的密度越少(圖3)。全州禾花鯉鱗片中黑色素細(xì)胞主要有2種形態(tài)：一是體積小、樹突狀分支少且粗壯，靠近鱗焦區(qū)域；二是細(xì)胞體積大、樹突狀分支多且細(xì)，分布于鱗片頂區(qū)邊緣區(qū)域，黑色素顆粒集中于細(xì)胞中心，鱗片無虹彩細(xì)胞層。而建鯉鱗片中，黑色素細(xì)胞的形態(tài)多為放射狀，樹突狀分支較多且粗，黑色素顆粒均勻分布在細(xì)胞內(nèi)，有的黑色素細(xì)胞為團(tuán)塊狀，顏色分布均勻；鱗片頂區(qū)的虹彩細(xì)胞中含有大量鳥嘌呤結(jié)晶體，呈帶狀分布，觀察物理破碎后的玻片標(biāo)本，可見棒狀或桿狀的鳥嘌呤結(jié)晶體，晶體反射光線而呈現(xiàn)虹彩色和金屬光澤。

A： 全州禾花鯉背部鱗片； B： 全州禾花鯉背部鱗片頂區(qū)； C： 展示虹彩細(xì)胞； D： 建鯉背部鱗片； E： 建鯉背部鱗片頂區(qū)； F： 展示鳥嘌呤結(jié)晶體； Ir： 虹彩細(xì)胞； G： 鳥嘌呤結(jié)晶體圖3 全州禾花鯉和建鯉的鱗片色素細(xì)胞觀察Fig. 3 Observation of pigment cells in scales of rice flower carp in Quanzhou and Cyprinus carpio var. Jian

2.3 皮膚和鰭條色素細(xì)胞觀察

全州禾花鯉的背部皮膚、背鰭鰭條和建鯉的背部皮膚、背鰭鰭條及腹部皮膚中，均觀察到黑色素細(xì)胞、紅色素細(xì)胞和黃色素細(xì)胞，且建鯉的背部和腹部皮膚中均觀察到了虹彩細(xì)胞，而全州禾花鯉腹部半透明的皮膚處只觀察到少量的黃色素細(xì)胞和紅色素細(xì)胞，無黑色素細(xì)胞。詳見圖4。

A～D分別為全州禾花鯉的背部皮膚、背部皮膚放大圖、腹部皮膚以及背鰭鰭條； E～H分別為建鯉的背部皮膚、背部皮膚放大圖、腹部皮膚以及背鰭鰭條； M：黑色素細(xì)胞； X：黃色素細(xì)胞； R：紅色素細(xì)胞；Ir：虹彩細(xì)胞圖4 全州禾花鯉和建鯉的皮膚與鰭條中色素細(xì)胞的比對Fig. 4 Comparison of pigmented cells in skin and fin of rice flower carp in Quanzhou and Cyprinus carpio var. Jian

全州禾花鯉皮膚中黑色素細(xì)胞按樹突形態(tài)可分為3種類型：一是樹突明顯、分支少且粗壯；二是樹突分支較多；三是細(xì)胞呈團(tuán)塊狀，分支基本消失。黃色素細(xì)胞體積較小、形狀不規(guī)則、細(xì)胞邊緣不清，顏色為從中心橘黃色向四周過渡為檸檬黃。紅色素細(xì)胞體積小、呈顆粒狀、細(xì)胞邊緣不清，顏色為橘紅色。

建鯉皮膚黑色素細(xì)胞有4種形態(tài)，分別是：1)樹突分支多，黑色素顆粒都分布在細(xì)胞各處。2)樹突狀分支較細(xì)而多，黑色素顆粒集中在胞體中央。3)樹突狀分支較粗而少，黑色素顆粒也集中在胞體中央。4)細(xì)胞呈團(tuán)塊狀，分支基本消失。黃色素細(xì)胞和紅色素細(xì)胞的形態(tài)與全州禾花鯉皮膚中觀察到的一致。在黑、黃、紅3種色素細(xì)胞層的下層觀察到虹彩細(xì)胞，呈帶狀或梭狀，呈現(xiàn)藍(lán)色和紫色2種色彩。

2.4 皮膚色素細(xì)胞染色觀察

2種鯉皮膚顯微結(jié)構(gòu)見圖5，由圖可見20日齡禾花鯉和建鯉的背部皮膚具有明顯的顏色分層，包括表皮層、真皮疏松層和真皮致密層。染色的表皮層呈現(xiàn)藍(lán)紫色，除表皮細(xì)胞外，分布有大量球形或橢圓形的黏液細(xì)胞；真皮疏松層和真皮致密層染色下呈現(xiàn)粉紅色，致密層的顏色較疏松層深，其間的膠原纖維排列也更加緊密，呈現(xiàn)波浪形，而疏松層的纖維呈網(wǎng)狀交織分布，其結(jié)構(gòu)無明顯差異。

250日齡的全州禾花鯉和建鯉背部皮膚切片比較見表2和圖6。圖6顯示，相同部位不同個體的黑色素細(xì)胞密度不相同，全州禾花鯉背部的黑色素細(xì)胞密度大于建鯉。在全州禾花鯉的皮膚中幾乎沒有發(fā)現(xiàn)虹彩細(xì)胞帶。分別觀察全州禾花鯉背部和腹部的皮膚切片，可以發(fā)現(xiàn)不同部位的黑色素細(xì)胞密度不相同，背部皮膚的黑色素細(xì)胞密度較大，往往形成一條連續(xù)的黑色素細(xì)胞帶，而腹部皮膚的黑色素細(xì)胞數(shù)量較少。

EL: 表皮層；DL: 真皮疏松層；DD: 真皮致密層；Sc: 鱗片；Mu: 肌肉；MC: 黏液細(xì)胞；M: 黑色素細(xì)胞圖5 20日齡全州禾花鯉和建鯉背部皮膚組織切片顯微結(jié)構(gòu)Fig. 5 Microscopical observation on skin section of rice flower carp in Quanzhou and Cyprinus carpio var. Jian

表2 全州禾花鯉和建鯉皮膚組織染色觀察對比Tab. 2 Skin tissue staining of rice flower carp in Quanzhou and Cyprinus carpio var. Jian

A～C： 全州禾花鯉背部皮膚縱切；D～F： 建鯉背部皮膚縱切；EL: 表皮層；PL: 色素層；DL: 真皮疏松層；DD: 真皮致密層；MC: 黏液細(xì)胞；M: 黑色素細(xì)胞；Ir: 虹彩細(xì)胞圖6 全州禾花鯉和建鯉皮膚縱切及HE染色Fig. 6 HE staining and longitudinal section of skin from rice flower carp in Quanzhou and Cyprinus carpio var. Jian

2.5 皮膚色素含量測定

全州禾花鯉和建鯉皮膚組織中的黑色素、葉黃素、玉米黃素、α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素含量如表3所示。與建鯉比較，全州禾花鯉皮膚中的黑色素含量為10.10 ng/L，比建鯉高39.70%(P<0.01)；葉黃素含量為1.53 mg/kg，比建鯉低71.29%(P<0.05)。皮膚中玉米黃素、α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素含量的差異不顯著。

表3 全州禾花鯉和建鯉皮膚色素含量測定結(jié)果Tab. 3 Determination results of skin pigment content of rice flower carp in Quanzhou and Cyprinus carpio var. Jian

3 討論

全州禾花鯉在體色上區(qū)別于建鯉的顯著特征是背部顏色較深(烏褐色)，腹部半透明，隱約可見內(nèi)臟，該特征是全州禾花鯉在市場上取得價格優(yōu)勢的關(guān)鍵依據(jù)。本研究通過與建鯉的比較，發(fā)現(xiàn)全州禾花鯉和建鯉的體表均能觀察到黑色素細(xì)胞、黃色素細(xì)胞和紅色素細(xì)胞。這3種色素細(xì)胞種類組成并無差異，較為顯著的區(qū)別是全州禾花鯉鱗片的邊緣區(qū)域出現(xiàn)小部分色素顆粒聚集在細(xì)胞核附近、中心顏色較深、邊緣不清晰的黑色素細(xì)胞，可能為烏褐色特征做出了貢獻(xiàn)；從色素含量測定結(jié)果分析，全州禾花鯉皮膚的黑色素、葉黃素含量顯著高于建鯉，而玉米黃素、α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素含量并無顯著差異，與全州禾花鯉背部顏色較深(烏褐色)的特點(diǎn)吻合；同時，發(fā)現(xiàn)上述2種鯉最最顯著的區(qū)別在于全州禾花鯉體表缺乏可反光的鳥嘌呤結(jié)晶體，尤其在鱗片下層細(xì)胞和皮膚色素細(xì)胞層中表現(xiàn)突出，初步認(rèn)為這是導(dǎo)致全州禾花鯉體表半透明特征的直接原因。鳥嘌呤結(jié)晶是規(guī)律排列在虹彩細(xì)胞中的一類反光物質(zhì)，通常呈現(xiàn)金屬光澤，在體色決定中扮演重要角色[13-14]。魚類皮膚和鱗片上的銀白色及其他金屬光澤顏色是由鳥嘌呤結(jié)晶所致[15]。根據(jù)前期研究，鳥嘌呤結(jié)晶的缺失與魚體的透明現(xiàn)象相關(guān)，在斑馬魚Daniorerio[16]、虹鳉Poeciliareticulate[17]、草金魚Carassiusauratus[18]、細(xì)鋸脂鯉Pristellamaxillaris[19]等品種的透明突變體中得到相關(guān)驗(yàn)證。虹彩細(xì)胞缺失使光線能透過魚體，顯示內(nèi)部的器官。據(jù)此推斷，全州禾花鯉的烏褐色特征與其有別于其他品種的黑色素細(xì)胞分布特點(diǎn)和較高的黑色素、葉黃素含量有關(guān)，而半透明特征是由于鳥嘌呤結(jié)晶的缺失所致。

全州禾花鯉在漫長的養(yǎng)殖過程中[20]，經(jīng)歷了稻田環(huán)境和人工選擇的共同作用[21]，逐漸形成了穩(wěn)定遺傳的特有體色性狀，是自然選擇、人工選擇、基因突變以及環(huán)境因子共同作用的結(jié)果[22-24]，其烏褐色、半透明特點(diǎn)對其適應(yīng)稻田環(huán)境具有積極意義。首先，烏褐色更接近稻田中泥土的顏色，有利于在稻田淺水環(huán)境中躲避捕食者。其次，鳥嘌呤結(jié)晶的缺失使其在光線下不顯示金屬光澤，同樣有利于降低被鳥類等捕食者發(fā)現(xiàn)的幾率。另外，全州禾花鯉的體色和鳥嘌呤結(jié)晶缺失特性為研究鯉魚體色決定機(jī)制提供了新的材料和機(jī)遇。對上述科學(xué)問題的深入揭示，將有助于發(fā)現(xiàn)和闡釋新的魚類體色調(diào)控機(jī)制。從全州禾花鯉種質(zhì)資源的角度，針對上述性狀特點(diǎn)開展遺傳解析，挖掘相關(guān)功能基因[25]，篩選分子標(biāo)記[26]，不僅有助于全州禾花鯉種質(zhì)鑒定和保護(hù)利用，具有較大科學(xué)價值，更應(yīng)是全州禾花鯉體色后續(xù)相關(guān)研究的重點(diǎn)方向。