王貴，李蕊蕊，吳茂宏，任菲宏，王麗麗，喬光

1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550025；2.貴州省銅仁市林業(yè)科學(xué)院，銅仁 554300；3.貴州省銅仁市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，銅仁 554300； 4.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，貴陽 550006

沙子空心李（Prunus salicinaLindl. ‘Shazikongx?inli’），為薔薇科李屬植物、青皮黃肉李品種，是貴州省沿河土家族自治縣栽培的地方特色水果，于2006年被批準(zhǔn)為國家地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品［1］。據(jù)沿河縣縣志記載，沙子空心李系1858年由外地引進(jìn)栽培，屬中國李的一類地方品種，由于沿河縣獨(dú)特的地理、氣候和富含硒等多種微量元素的土壤條件適宜其生長，逐漸育成了這一優(yōu)異地方李品種。目前沙子空心李主栽于沿河縣南莊村沙子、中界等鄉(xiāng)鎮(zhèn)，投產(chǎn)種植面積已達(dá)30 km2，還未發(fā)現(xiàn)過野生資源。經(jīng)過160多年的自然演變及人為選育栽培，沙子空心李逐漸形成品種群。近年來沿河縣大面積發(fā)展沙子空心李，種苗生產(chǎn)混亂、接穗來源異質(zhì)化，進(jìn)一步促成沙子空心李品種的多樣化［2］。通過筆者所在課題組走訪調(diào)查發(fā)現(xiàn)，目前生產(chǎn)的沙子空心李在成熟時(shí)間及果實(shí)品質(zhì)上存在差異。差異株系的存在為優(yōu)異種質(zhì)的挖掘提供了種質(zhì)資源基礎(chǔ)，但這些差異是僅由環(huán)境因素或栽培技術(shù)不同引起的，還是遺傳信息發(fā)生不同程度的變異尚未明確。只有了解種質(zhì)資源的遺傳變異水平及親緣關(guān)系，才能高效地選配親本，培育出優(yōu)異品系［3］。因此，有必要通過DNA分子標(biāo)記技術(shù)從基因水平上對(duì)沿河縣沙子空心李種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性評(píng)價(jià)。

DNA分子標(biāo)記技術(shù)，如RAPD、SSR及ISSR，已經(jīng)廣泛用于李研究的不同領(lǐng)域［4］，但I(xiàn)RAP（inter-ret?rotransposon amplified polymorphism，逆轉(zhuǎn)座子位點(diǎn)擴(kuò)增多態(tài)性）標(biāo)記的應(yīng)用研究還鮮有報(bào)道。IRAP是 Kalendar等［5］于1999年基于植物反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座特性而建立的一種分子標(biāo)記技術(shù)，具有高通量、基因組覆蓋范圍廣、多態(tài)性豐富及異質(zhì)性高等優(yōu)點(diǎn)［6-7］。現(xiàn)已應(yīng)用于櫻桃［8］、梨［9］、葡萄［10］、火龍果［11-12］、梅［13］等親緣關(guān)系鑒定及遺傳多樣性分析等研究。

本研究依據(jù)品種成熟期、果實(shí)品質(zhì)、高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)這幾個(gè)育種目標(biāo)選擇了92株具有優(yōu)良性狀的沙子空心李作為試驗(yàn)材料，采用IRAP標(biāo)記技術(shù)，系統(tǒng)評(píng)價(jià)供試材料遺傳多樣性水平及親緣關(guān)系，同時(shí)構(gòu)建沙子空心李指紋圖譜，旨在為沙子空心李優(yōu)異種質(zhì)的輔助育種、科學(xué)利用及保護(hù)等提供理論依據(jù)與應(yīng)用參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

于2020年7月對(duì)貴州省沿河縣南莊村等地進(jìn)行實(shí)地走訪調(diào)查，選取92株具有優(yōu)良性狀（高品質(zhì)、高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)等）、健康的沙子空心李作為試驗(yàn)材料（表1）。于2022年4月取92份供試種質(zhì)的幼嫩葉片，用于后續(xù)基因組DNA提取。

表1 92份沙子空心李種質(zhì)材料Table 1 Ninety-two germplasm resources of Shazikongxinli for IRAP analysis

續(xù)表 1 Continued Table 1

續(xù)表 1 Continued Table 1

1.2 基因組DNA提取

通過植物基因組DNA提取試劑盒DP320（北京，天根）提取92份供試材料幼嫩葉片DNA后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)質(zhì)量及濃度后，將DNA稀釋至約30 ng/μL，置于-20 ℃保存。

1.3 IRAP引物開發(fā)

通過Clustal W對(duì)李反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Ty1-copia和Ty3-gypsy的RT序 列（NCBI：K78998～K79023；K79024～K79041）進(jìn)行多序列比對(duì)，獲得保守區(qū)域，采用Primer 5.0程序以保守區(qū)域上游序列設(shè)計(jì)單向引物［14］，共獲得65條IRAP引物，由上海生工合成。

1.4 IRAP-PCR體系優(yōu)化

設(shè)計(jì)L16（ 43） 正交試驗(yàn)（表2）優(yōu)化10 μL沙子空心李I(lǐng)RAP-PCR反應(yīng)體系的主要影響因素Mix（賽默飛；0.4 mmol/LTaqDNA聚 合酶、0.4 mmol/L dNTP、4 mmol/L MgCl2）、IRAP引物和模板DNA的用量；PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，51～58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min；72 ℃再延伸10 min；4 ℃保存；在此基礎(chǔ)上對(duì)PCR循環(huán)次數(shù)設(shè)置3個(gè)梯度：30、35及40次。

表2 L16（ 43 ） 正交試驗(yàn)表Table 2 Table of L16（43） orthogonal experiments μL

1.5 IRAP引物篩選與PCR擴(kuò)增

根據(jù)已優(yōu)化的10 μL IRAP-PCR體系，隨機(jī)選取8個(gè)供試種質(zhì)DNA作為模板，利用篩選出來的IRAP引物對(duì)92份沙子空心李種質(zhì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)引物重復(fù)2～3次，PCR產(chǎn)物在1×TAE緩沖液中用1.5%瓊脂糖凝膠以6 V/cm電泳40 min后，于凝膠成像系統(tǒng)中觀察并保存圖像。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

僅統(tǒng)計(jì)每個(gè)引物清晰明亮且可重復(fù)的條帶，有和無條帶分別以“1”和“0”記錄，獲得每個(gè)引物的數(shù)據(jù)矩陣，通過POPGEN 1.32［15］分析每個(gè)IRAP引物的等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Nei’s基因多樣性指數(shù)及Shannon指數(shù)；利用NTSYS 2.10e軟件［16］計(jì)算遺傳相似性系數(shù)后，通過MEGA11采用鄰接法（neighbor-joining）進(jìn)行聚類，利用Evolview（http：//evolgenius.info）美化聚類圖。根據(jù)使用最少引物鑒定盡量多供試種質(zhì)的原則，確定核心引物，直接以統(tǒng)計(jì)獲得的0/1數(shù)據(jù)作為指紋代碼，通過條形碼和二維碼生成器（http：//qr-batch.com/）構(gòu)建供試種質(zhì)分子身份證。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR反應(yīng)體系優(yōu)化

PCR體系優(yōu)化試驗(yàn)見圖1，泳道1～16分別對(duì)應(yīng)正交試驗(yàn)表（表2）中體系1～16，PCR循環(huán)次數(shù)依次為30、35、40。PCR結(jié)果顯示，循環(huán)40次為最優(yōu)。根據(jù)40次循環(huán)中電泳條帶的數(shù)量、明暗及清晰度，16個(gè)PCR體系從優(yōu)到差的排序?yàn)椋?-12-11-16-3-4-8-2-6-14-15-10-5-9-1-13。通過對(duì)上述處理的各個(gè)因子比較可知，IRAP引物和Mix含量是影響條帶多少及明暗程度的主要因素。體系1、5、9、13中Mix含量（3.0 μL）最少，條帶均較少且不明亮；而體系2、6、10、14中Mix含量（4.0 μL）相同，體系10及14引物含量（0.7 μL及1.0 μL）相對(duì)較少，導(dǎo)致PCR結(jié)果相對(duì)較差；同理，體系8及15也是如此。綜上，考慮經(jīng)濟(jì)成本等因素，確定PCR體系（10 μL）最優(yōu)為體系7：10-5mol/L IRAP引 物1.3 μL，PCR Mix 5.0 μL、模板DNA（30 ng/μL）1.0 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，51～58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共40次循環(huán)；72 ℃再延伸10 min；4 ℃保存。

圖1 10 μL IRAP-PCR體系優(yōu)化結(jié)果Fig.1 Optimization results of 10 μL IRAP-PCR system

2.2 IRAP引物篩選

對(duì)設(shè)計(jì)的65條IRAP引物進(jìn)行篩選，最終篩選出18條多態(tài)性良好、條帶清晰且可重復(fù)性強(qiáng)的IRAP引物，且確定最佳退火溫度為51～58 ℃（表3），部分引物篩選結(jié)果見圖2。

圖2 6條IRAP引物篩選結(jié)果Fig.2 Screening results of 6 IRAP primers

表3 18條IRAP引物信息Table 3 Information of 18 IRAP primers

2.3 IRAP引物多態(tài)性分析

通過篩選出的18條IRAP引物對(duì)92份沙子空心李進(jìn)行PCR分析，結(jié)果（表4）顯示，18條IRAP引物共擴(kuò)增出189個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)180個(gè)，平均多態(tài)性位點(diǎn)比率為95.24%。18條引物的有效擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)4～17，平均每個(gè)引物擴(kuò)增10.5個(gè)位點(diǎn)，其中引物Ty3-2擴(kuò)增出的位點(diǎn)數(shù)目最多，共17個(gè)，而Ty3-14擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)則最少，僅4個(gè)；另外，種質(zhì)N39擴(kuò)增出的位點(diǎn)數(shù)最多，為118個(gè)，種質(zhì)N10擴(kuò)增出的位點(diǎn)數(shù)則最少，共47個(gè)。18條IRAP引物中多態(tài)性位點(diǎn)比例達(dá)到100%的共有12條，表明這些引物具有較高的多態(tài)性，能夠鑒別沙子空心李。引物Ty3-2及Ty3-6對(duì)92份沙子空心李種質(zhì)PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖3。

圖3 引物Ty3-2及Ty3-6 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 PCR amplification results of Ty3-2 and Ty3-6

2.4 IRAP遺傳多樣性指數(shù)

通過Popgene 1.32對(duì)統(tǒng)計(jì)的0、1數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果（表4）顯示，單個(gè)引物的等位基因數(shù)為1.667（Ty1-17）～2.000，平均等位基因數(shù)1.930；有效等位基因數(shù)為1.046（Ty1-2）～1.647（Ty1-18），均值1.426；Nei’s基因多樣性指數(shù)變幅為0.041（Ty1-2）～0.379（Ty3-3），平均值0.261；Shannon信息指數(shù)變幅為0.089（Ty1-2）～0.563（Ty3-3），平均值0.405；4個(gè)遺傳參數(shù)中，引物Ty1-7、Ty1-18及Ty3-3等各項(xiàng)值均相對(duì)較高，而引物Ty1-2及Ty1-3則相對(duì)偏低。

表4 IRAP引物擴(kuò)增結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 4 Statistics of IRAP primer amplification results

2.5 沙子空心李種質(zhì)聚類分析

利用NTSYS 2.10e軟件計(jì)算供試種質(zhì)的遺傳相似性系數(shù)（DICE系數(shù)）。92份沙子空心李種質(zhì)兩兩之間的DICE系數(shù)變幅為0.417～0.830，平均0.681。在遺傳相似系數(shù)為0.645時(shí)，92份沙子空心李被聚類為4組（圖4），聚類到第1組的沙子空心李數(shù)量最多，包含30份沙子空心李種質(zhì)，第2組最少，共14個(gè)種質(zhì)，第3組和第4組分別有22個(gè)及26個(gè)種質(zhì)。92份沙子空心李種質(zhì)采自4個(gè)種植區(qū)，然而聚類結(jié)果并不呈現(xiàn)出相應(yīng)的規(guī)律性，這可能是因?yàn)椴蓸訁^(qū)域地理間隔較小，栽培環(huán)境與技術(shù)差異較小，株系間基因交流頻繁，因而聚類結(jié)果不規(guī)律。但根據(jù)聚類結(jié)果，92份沙子空心李種質(zhì)在遺傳相似系數(shù)為0.645時(shí)可被聚類為4組，這表明供試的沙子空心李種質(zhì)可能來自4個(gè)不同品系。

圖4 92份沙子空心李聚類結(jié)果Fig.4 Dendrogram of 92 Shazikongxinli germplasms based on IRAP bands

2.6 分子指紋圖譜構(gòu)建

利用18條IRAP引物對(duì)92份沙子空心李進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得每個(gè)引物92個(gè)種質(zhì)的0/1數(shù)據(jù)矩陣，這些0/1數(shù)據(jù)可作為供試空心李種質(zhì)指紋圖譜或分子身份證構(gòu)建的直接依據(jù)。為達(dá)到利用最少的引物鑒定盡量多種質(zhì)的目的，通過對(duì)有效等位基因數(shù)達(dá)到2.000的12條IRAP引物的種質(zhì)鑒別情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（表5），最終確定核心引物為Ty3-2，其鑒別率最高（90.22%），共能鑒定出83個(gè)供試種質(zhì)，另有9個(gè)沙子空心李種質(zhì)（N10、N16、N35、N36、L26、L27、S2、S6、S7）無法鑒別出來，需與其他引物組合進(jìn)行鑒別。引物Ty3-6與Ty3-2組成1組核心引物，可鑒別出所有種質(zhì)，構(gòu)建高效的指紋圖譜。將表1中的4個(gè)采樣地（沿河縣南莊村、黎家寨、十二盤村及孫家寨）分別以數(shù)字1、2、3、4表示，同時(shí)12條IRAP引物依次以字母“A-L”表示（表5），直接以引物擴(kuò)增出的0/1數(shù)值串構(gòu)建指紋代碼。以種質(zhì)N1和L1為例，N1指紋代碼為：1A01000000000110001I000000000101，第1位數(shù)字1代表采樣地1（沿河縣南莊村），A代表IRAP引 物Ty3-2，I表 示 引 物Ty3-6；L1指 紋 代 碼 為：2A01010001010011001I011010000101，第1位數(shù)字2代表采樣地2（沿河縣黎家寨），最終利用每個(gè)種質(zhì)的指紋代碼，分別生成包含基本信息的條形碼和二維碼（圖5）。

表5 IRAP引物鑒別供試種質(zhì)情況Table 5 The number of germplasms that can be identi?fied by IRAP primers

圖5 沙子空心李種質(zhì)N1及L1分子身份證Fig.5 Prunus salicina Lindl. Shazikongxinli N1 and L1 molecular IDs

3 討論

3.1 IRAP體系優(yōu)化

本研究通過L16（ 43） 正交試驗(yàn)確定10 μL沙子空心李I(lǐng)RAP-PCR反應(yīng)的最優(yōu)體系，經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，認(rèn)為Mix及IRAP引物含量是影響PCR結(jié)果優(yōu)劣的主要影響因素。MIX和IRAP引物含量過低時(shí)，PCR擴(kuò)增結(jié)果中條帶均較少且較為暗淡，易造成試驗(yàn)誤差，影響試驗(yàn)結(jié)果。但Mix和IRAP引物含量也不可太高，IRAP引物含量過高時(shí)，容易導(dǎo)致引物二聚體的產(chǎn)生，同時(shí)也會(huì)增加導(dǎo)致非特異擴(kuò)增及錯(cuò)配的可能性［17］，而Mix含量太高則會(huì)造成不必要的浪費(fèi)，達(dá)不到經(jīng)濟(jì)高效的目的；另外，循環(huán)次數(shù)也是影響PCR擴(kuò)增結(jié)果的重要因素，循環(huán)次數(shù)與PCR產(chǎn)物濃度成正比，次數(shù)太少易導(dǎo)致產(chǎn)物含量太少，而循環(huán)次數(shù)太多也會(huì)導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物的產(chǎn)生，循環(huán)次數(shù)一般選擇30～40次［18］。本試驗(yàn)對(duì)10 μL IRAP-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化，經(jīng)濟(jì)高效地保證了試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.2 指紋圖譜構(gòu)建

目前構(gòu)建指紋圖譜的方法相對(duì)較多，有直接根據(jù)條帶統(tǒng)計(jì)獲得的“0/1”數(shù)據(jù)作為構(gòu)建指紋的代碼；還有從多個(gè)引物的擴(kuò)增結(jié)果中選取穩(wěn)定的特異條帶組成“0/1”數(shù)據(jù)構(gòu)建指紋代碼；另外，還可將二進(jìn)制的“0/1”數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)變?yōu)槭M(jìn)制的數(shù)字形成代碼［18］。指紋圖譜和分子身份證的構(gòu)建對(duì)于種質(zhì)鑒別具有重要意義。本研究確定引物Ty3-2及Ty3-6作為種質(zhì)鑒定及指紋圖譜構(gòu)建的高效標(biāo)記引物，并據(jù)此構(gòu)建了供試種質(zhì)的分子身份證。在構(gòu)建的分子身份證中加入了種質(zhì)的相關(guān)信息，包括栽培地、突出性狀等信息，可為后續(xù)沙子空心李育成品種的分子身份證構(gòu)建及種質(zhì)知識(shí)產(chǎn)權(quán)的保護(hù)提供參考。

3.3 沙子空心李遺傳多樣性及聚類分析

遺傳多樣性能夠反映出物種的遺傳背景及育種潛力，是作物種內(nèi)和種群之間育種過程的基礎(chǔ)條件［19］。對(duì)沙子空心李種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，是種質(zhì)資源鑒定、篩選的重要工作，也是培育優(yōu)異種質(zhì)的前提。李作為一種常見果樹，對(duì)于其遺傳多樣性的研究相對(duì)較多。王紅林等［20］通過SSR標(biāo)記對(duì)16份貴州中晚熟李種質(zhì)進(jìn)行分析，平均Shannon多樣性指數(shù)（I）為1.59，認(rèn)為這些李種質(zhì)具有豐富的遺傳信息，這和魏瀟等［21］利用22對(duì)SSR引物分析17份南方李品種的多樣性結(jié)果類似（I=1.709）。左力輝等［22］也通過SSR標(biāo)記檢測(cè)了24份中國李品種的遺傳多樣性（H=0.227 3，I=0.358 6）。陳紅等［23］則通過ISSR標(biāo)記分析了48份李種質(zhì)的多樣性水平，平均Nei’s遺傳多樣性指數(shù)（H）為0.345，平均Shannon多樣性指數(shù)（I）0.508。目前對(duì)單一李品種內(nèi)的遺傳多樣性研究相對(duì)較少。Basilio等［24］以29份日本李核心種質(zhì)為研究對(duì)象，通過11條ISSR引物評(píng)價(jià)其多樣性，結(jié)果顯示平均Nei’s遺傳多樣性指數(shù)（H）為0.15，平均Shannon多樣性指數(shù)（I）0.27。這低于本研究通過18條IRAP引物對(duì)92份沙子空心李的分析結(jié)果（H=0.261，I=0.405）。其可能與本試驗(yàn)采用的分子標(biāo)記檢測(cè)能力不同，所收集的種質(zhì)樣本數(shù)量多等因素有關(guān)。另外，Guan等［25］通過9個(gè)IRAP標(biāo)記檢測(cè)了268份柿種間和種內(nèi)的多樣性水平（H=0.240，I=0.389），認(rèn)為這些柿種質(zhì)具有較為豐富的遺傳信息。本研究驗(yàn)證了反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子標(biāo)記在李植物遺傳多樣性分析的適用性，顯示IRAP標(biāo)記即使在單一品種中也具有較高水平地檢測(cè)變異的能力，這可能與反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在李中分布廣泛、在種內(nèi)也具有豐富的序列和插入多態(tài)性等特性有關(guān)。在逆境條件下，反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子容易被激活產(chǎn)生新的插入突變，進(jìn)行橫向、縱向傳遞［26］，因而相較于SSR、ISSR等標(biāo)記用于種間系譜的研究，IRAP標(biāo)記由于其標(biāo)記性質(zhì)，可能更適合用于栽培種內(nèi)的變異檢測(cè)［5］，分析種內(nèi)個(gè)體水平上的遺傳變異情況及親緣關(guān)系。

遺傳相似性系數(shù)是判斷物種間親緣關(guān)系及遺傳基礎(chǔ)的標(biāo)準(zhǔn)之一［27］。本研究通過neighbor-joining法對(duì)92份供試沙子空心李進(jìn)行聚類分析，在遺傳相似系數(shù)為0.645時(shí)，供試種質(zhì)被聚類為4類。在聚類結(jié)果中這些供試種質(zhì)并不呈現(xiàn)出相應(yīng)的地理分布規(guī)律性，這可能是因?yàn)椴蓸拥?個(gè)區(qū)域地理間隔較小，種苗來源途徑基本相同，栽培環(huán)境及技術(shù)等相近，同時(shí)種質(zhì)間交流頻繁，滲入程度較大。本研究結(jié)果確定了供試種質(zhì)基因水平上的親緣關(guān)系，可為后續(xù)選育優(yōu)異種質(zhì)中高效選配親本提供參考依據(jù)。

沙子空心李在生產(chǎn)上出現(xiàn)果實(shí)品質(zhì)及成熟期不一致的現(xiàn)象，可能是在長期的栽培過程中，由地方品種的種性退化以及苗木繁育過程中產(chǎn)生的不同品系混雜引起的。本研究驗(yàn)證了沙子空心李種質(zhì)在DNA水平上產(chǎn)生了較為明顯的變異，排除了供試沙子空心李不同株系間在栽培表現(xiàn)上產(chǎn)生差異僅由環(huán)境因素或栽培技術(shù)不同而導(dǎo)致的情況，表明這些種質(zhì)可作為優(yōu)異品系培育的核心種質(zhì)。后續(xù)可通過結(jié)合各個(gè)株系的優(yōu)良性狀包括抗逆能力、果實(shí)品質(zhì)、產(chǎn)量等進(jìn)行雜交選配，培育出更為優(yōu)異的后代。如利用沙子空心李種質(zhì)N22具有果實(shí)最大的突出品質(zhì)，結(jié)合N27果實(shí)口感最好和N7等種質(zhì)高產(chǎn)、穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)進(jìn)行雜交后連續(xù)回交繁育后代，實(shí)現(xiàn)沙子空心李的增產(chǎn)提質(zhì)。