肖要要，王逸群，張林林 ，潘 韜，靳亞平,2，陳華濤,2

(1.西北農(nóng)林科技大學 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物生物技術重點實驗室，楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學 動物醫(yī)學院，楊凌 712100)

生物體在生理、行為等方面呈現(xiàn)出周期性變化的規(guī)律稱為生物節(jié)律；產(chǎn)生和調(diào)節(jié)生物節(jié)律的內(nèi)在機制稱為生物鐘。生物節(jié)律是35億年前在海洋中誕生的原始生命為適應地球自轉造成的太陽光照周期性變化而逐漸獲得的能力[1]。最典型的例子是睡眠和覺醒的周期性交替，它以機體活動變化模式24 h為一個周期。隨著時間生物學的發(fā)展，越來越多的研究表明，生物鐘調(diào)控哺乳動物的大量生理學功能，包括睡眠、記憶、代謝、免疫和生殖等。哺乳動物生物鐘系統(tǒng)按其位置和作用的不同主要分為兩部分[2]：一部分位于視交叉上核(SCN)，接受光照信號刺激，是生物鐘系統(tǒng)的起搏器，被稱為中樞生物鐘；另一部分位于機體的各個器官和組織中，它們不僅具有各自節(jié)律性，且受到中樞生物鐘SCN的調(diào)控，被稱為外周生物鐘[3-4]。與生物鐘相關的基因(包括Period、Timeless及Clock等)陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)和克隆，這些基因及其編碼的蛋白產(chǎn)物組成了生物體自我調(diào)節(jié)轉錄和翻譯反饋的分子環(huán)路。破壞正常的晝夜節(jié)律以及相關生物鐘基因突變或敲除均會導致一系列的臨床性疾病，如腫瘤、糖尿病及心血管疾病等[1,5]。

已有證據(jù)表明，不同光照時間可顯著影響雄性睪丸重量、睪酮水平和精子發(fā)生[6-7]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在睪丸組織中存在生物鐘基因的表達。近年來，睪丸生物鐘的研究主要聚焦于生物鐘對睪酮合成、精子發(fā)生等方面的影響。雖然生物鐘分子機制極其復雜，但其基本的調(diào)控通路已較為明確，這為我們從生物鐘角度出發(fā)研究雄性生殖生理功能的調(diào)控機制以及相關致病因子提供了全新的思路。

1 哺乳動物生物鐘分子調(diào)控機制

生物節(jié)律按照周期的長短可分為：超日節(jié)律(節(jié)律周期小于20 h)、近日節(jié)律(節(jié)律周期接近24 h)及亞日節(jié)律(節(jié)律周期顯著大于24 h)等。我們通常所說的生物鐘是指狹義的生物鐘，也就是近日節(jié)律生物鐘。近日節(jié)律生物鐘由3部分組成：(1)輸入系統(tǒng)。接受外界信號傳入到生物鐘振蕩器，調(diào)節(jié)生物鐘基因的表達。光暗與溫度變化是重要的授時因子，矯正生物鐘基因的節(jié)律位相[8]。(2)生物鐘振蕩器。由一組呈節(jié)律性表達的生物鐘基因及其編碼的蛋白質組成。核心生物鐘基因激活順式作用元件啟動靶基因轉錄并翻譯成靶蛋白，靶蛋白在細胞質累積并轉移到細胞核，反饋抑制自身基因的轉錄活性，使其進行節(jié)律性振蕩。(3)輸出系統(tǒng)。包括相關的生物鐘基因與生物鐘控制基因，將核心生物鐘基因節(jié)律變化信號，經(jīng)神經(jīng)、內(nèi)分泌等相關途徑送達感受器, 調(diào)節(jié)其生理行為的24 h周期性節(jié)律性變化[9]。

在分子機制層面，生物鐘節(jié)律性振蕩是由生物鐘核心基因及其編碼蛋白組成的正負反饋轉錄、翻譯環(huán)路相互作用而形成的[10]。目前已發(fā)現(xiàn)的核心生物鐘基因有10余種，主要包括Bmal1、Clock、Pers(Per1/Per2/Per3)、Crys(Cry1/Cry2)、Rev-erbα、Rorα、Hnf4a。生物鐘基因在哺乳動物細胞中形成的反饋循環(huán)通路如圖1所示。在細胞核中，bHLH型轉錄因子BMAL1與CLOCK形成異源二聚體結構，通過結合到包括負性成分Per、Cry在內(nèi)的諸多下游基因的啟動子區(qū)域的順式作用元件E-box(5′-CACGTG-3′)或E′-box(5′-CACGTT-3′)上，達到對Per、Cry等基因的轉錄增強作用[11]。細胞質中累積的PER和CRY進入細胞核直接抑制BMAL1/CLOCK的轉錄活性，從而抑制下游生物鐘基因的轉錄激活，形成核心負反饋調(diào)控環(huán)。在核心反饋環(huán)外圍，還存在其他次級調(diào)控通路，其中核受體REV-ERB、ROR等可通過結合下游靶基因啟動子區(qū)域的REV-ERB/ROR應答元件(REV-ERB/ROR responsive elements，RORE)分別抑制或促進生物鐘基因的轉錄參與生物鐘24 h節(jié)律性振蕩的產(chǎn)生[12]。BMAL1/CLOCK通過E-box激活Dbp的轉錄，E4bp4與Dbp進而通過結合Per上游的順式作用元件D-box，分別促進生物鐘相位的后移與前移[13]。BMAL1/CLOCK也能通過E-box促進Dec基因的轉錄，其表達的DEC蛋白通過與BMAL1蛋白相互作用以及對E-box的競爭性結合，又可以反向抑制BMAL1/CLOCK誘導的Per啟動子的反式激活[14]。次級調(diào)控通路相關的基因即使缺失，生物節(jié)律也不會隨之消失，它們的存在是使生物節(jié)律更加穩(wěn)定。在參與生物鐘反饋環(huán)的基因下游，控制各種生理機能的生物鐘控制基因也隨著生物鐘基因的表達而被激活。生物鐘系統(tǒng)通過此種方式實現(xiàn)了調(diào)控哺乳動物全身生理功能的節(jié)律性變化[1]。

2 睪丸生物鐘的發(fā)現(xiàn)

多種雄性動物的生殖功能具有強烈的季節(jié)性節(jié)律。其中，公羊能夠解碼全年的日照變化，并將其轉換為減少或增強性腺功能和性欲的激素信號。此外，Hoffman等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在LD 16∶8(每天16 h光照和8 h黑暗)或LD 14∶10光照條件下的金倉鼠可保持睪丸大小和功能，而LD 2∶22或LD 1∶23可誘導睪丸退化。Gaston等[16]發(fā)現(xiàn)倉鼠每天至少需要12.5 h的光照來維持正常精子生成和防止睪丸退化。然而，Stetson等[6]和Elliott等[7]研究表明，雄性倉鼠睪丸功能的正常維持不是由光或暗的絕對量(每天)或光暗比決定的。相反，光敏性的晝夜節(jié)律決定了光是否會刺激下丘腦-睪丸軸，揭示了晝夜節(jié)律對維持雄性生殖具有重要的作用。諸多研究表明，生物鐘基因不僅表達于下丘腦的SCN，也廣泛表達于包括肝臟、腎臟、胰臟、睪丸、胸腺和血液在內(nèi)的多種外周組織和器官中，構成外周生物鐘。

最早被發(fā)現(xiàn)表達于睪丸組織中的生物鐘基因是Per1，之后Per2、Per3、Cry1、Cry2、Bmal1和Clock的表達也相繼被發(fā)現(xiàn)和證明[17]。然而，這些基因在睪丸中的表達是否具有節(jié)律性一直存在廣泛的爭議。Zylka等[18]研究表明，Per2低表達于小鼠睪丸中，但Per1和Per3的表達具有明顯的節(jié)律性。之后，Yamamoto等[19]研究發(fā)現(xiàn)，雖然大部分生物鐘基因(Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2、Clock)在睪丸組織中未表現(xiàn)出明顯的節(jié)律性表達，但部分生物鐘基因(Bmal1、Rev-erbα、Dbp)的表達存在一定的節(jié)律性變化。此外，Bebas等[20]研究發(fā)現(xiàn)Per1、Per2和Bmal1在小鼠睪丸組織中的表達也具有節(jié)律性，而且值得注意的是：Bmal1和Per的表達時相一致。Meyer等[21]在不同品系倉鼠睪丸中檢測到了Bmal1、Per1、Per2、Clock、Cry1和Cry2的節(jié)律性表達。Tong等[22]在敘利亞倉鼠睪丸中，檢測到了Per1的節(jié)律性表達，Bmal1基因的表達并沒有明顯的節(jié)律性。然而，將倉鼠長期置于黑暗環(huán)境中則可檢測到Bmal1基因明顯的節(jié)律性表達。與之相反，Morse等[23]發(fā)現(xiàn)Per1與Bmal1在睪丸中不具有節(jié)律性。Alvarez等[24]研究表明，雖然睪丸組織可檢測到生物鐘基因Bmal1、Per1、Per2、Clock、Cry1和Npas2的表達，但是這些基因也不具有節(jié)律性。此外，Mazzoccoli等[25]與Chen等[26]的研究也并未發(fā)現(xiàn)生物鐘基因在睪丸組織中的節(jié)律性表達。綜上所述，雖然生物鐘基因表達于睪丸組織中，但因種屬差異、睪丸細胞種類的復雜性抑或檢測方法的靈敏性差異等，研究結果表明生物鐘基因在睪丸組織中的表達變化規(guī)律存在明顯的差別。

3 睪丸生物鐘的生理功能

生物鐘基因在睪丸組織中的廣泛表達提示其在雄性生殖過程中扮演著重要的角色。生物鐘基因敲除小鼠模型的建立為研究生物鐘在雄性生殖過程中的作用機制提供了重要手段。研究表明，Bmal1基因敲除小鼠表現(xiàn)出不育癥狀，而Clock基因的突變與Rev-erbα基因的敲除均會導致小鼠繁殖力的下降，表明生物鐘基因對雌雄動物生殖功能的穩(wěn)態(tài)維持具有關鍵調(diào)控作用[27-30]。

睪丸由間質細胞、支持細胞、管周肌細胞和各級生殖細胞等多種類型的細胞組成。睪丸間質細胞分泌睪酮，睪酮的分泌受下丘腦-垂體-睪丸性腺軸的調(diào)節(jié)。已有證據(jù)表明多種哺乳動物血清睪酮含量存在24 h周期性節(jié)律變化，哺乳動物生物鐘調(diào)控睪酮的合成[27, 31-33]。Alvarez等[27]研究發(fā)現(xiàn)，BMAL1蛋白在睪丸間質細胞中的表達具有明顯的節(jié)律性。之后，生物鐘基因Bmal1、Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2、Rorb、Rev-erbα與Rev-erbβ在睪丸間質細胞中表達的節(jié)律性也被相繼發(fā)現(xiàn)，并伴有睪酮合成相關基因細胞色素P450膽固醇側鏈裂解蛋白酶(cytochrome P450 family 11 subfamily A member 1，Cyp11a1)、3β-羥基類固醇脫氫酶(3β-hydroxysteroid dehydrogenase 2，Hsd3b2)、類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白(steroidogenic acute regulatory protein，StAR)與細胞色素P45017A1(cytochrome P450 steroid 17-α-monooxygenase，Cyp17a1)的節(jié)律性表達[26, 34-39]，提示生物鐘在睪丸間質細胞睪酮合成過程中扮演著重要角色。此外，還有研究表明Bmal1基因敲除雄性小鼠睪酮水平降低，且睪酮合成相關基因StAR、3β-HSD、Cyp17a1與17β-羥基類固醇脫氫酶(17β-hydroxysteroid dehydrogenase，17β-HSD)的表達顯著下調(diào)，并伴有睪丸精囊縮小，曲細精管直徑縮減，精子密度顯著下降，并表現(xiàn)出不育等癥狀[27]。另外，Per2KO小鼠與Per1/Per2dKO小鼠也表現(xiàn)出StAR表達水平的降低。進一步體外試驗表明，BMAL1可直接調(diào)控StAR的轉錄[27]。山羊睪丸間質細胞過表達BAML1可顯著促進StAR和HSD17B3的轉錄，BMAL1基因敲減導致睪酮合成關鍵基因表達下降及睪酮分泌減少[37]。此外，還有研究指出，BMAL1的缺失可促進小鼠TM3睪丸間質細胞的凋亡[40]。綜上所述，生物鐘系統(tǒng)可通過多種途徑參與調(diào)控睪酮的合成。

在生物鐘調(diào)控精子發(fā)生研究領域，多項研究表明生物鐘基因表達于各級生殖細胞中。Morse等[23]發(fā)現(xiàn)Per1主要定位于精子細胞，Clock富集于精原細胞和粗線期精母細胞。Alvarez等[24]研究表明，Per1表達于精原細胞和精子細胞，Clock主要表達于圓形精子的頂體中。且有研究表明，通過向睪丸直接注射Clock干擾質粒，Clock基因表達的下調(diào)可致精子體外受精能力和頂體酶活性顯著降低[41]。Cry1基因對睪丸功能的維持也具有至關重要的作用，Cry1基因敲除將會導致小鼠睪丸免疫反應相關基因表達發(fā)生改變，并促進精子細胞的凋亡，然而睪酮合成水平與WT小鼠無顯著差異[42]。

此外，還有研究表明，在哺乳動物中，生物鐘相關基因Per1和Bmal1在生殖管道(附睪、輸精管與儲精囊)與前列腺中的表達均具有節(jié)律性，且液泡膜H+-ATP酶(Vacuolar-type H+-ATPase，V-ATPase)與碳酸酐酶(Carbonic Anhydrase，CA)表達也表現(xiàn)出明顯的節(jié)律性[20]。V-ATPase和CA-II對哺乳動物生殖管道中離子穩(wěn)態(tài)的建立具有重要作用。CA-II與V-ATPase在生殖管上皮的表達表明，它參與質子分泌和精子對碳酸氫鹽的再吸收過程，且兩者都可使精液保持較低pH值。生殖管道中精液的酸化可抑制精子的游動，同時為精子成熟和防止過早的頂體酶激活創(chuàng)造適當環(huán)境[20]。因此，生物鐘系統(tǒng)也參與調(diào)控精子的成熟過程。

在睪丸內(nèi)，睪酮與雄激素結合蛋白相互作用，對生精小管內(nèi)雄激素水平及生精細胞增殖和發(fā)育發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[43]。睪酮的分泌與合成同樣對雄性動物生殖器官發(fā)育、副性腺發(fā)育以及維持精子發(fā)生至關重要[44]。在胚胎時期低睪酮水平理論上勢必會造成雄性小鼠生殖器官發(fā)育與分化的受阻，從而造成其性無能。然而雄性Bmal1-/-小鼠的精子卻具有一定的活力，可以實現(xiàn)獲能并且能夠在體外使卵子受精，甚至存在雄性Bmal1-/-小鼠成功與雌性WT小鼠交配并產(chǎn)下幼仔的案例[17]。這可能與Bmal1的缺失并不會導致睪酮合成完全受阻有關[45]。

4 睪丸生物鐘影響因素

衰老與生物節(jié)律的調(diào)控失衡之間存在著密切關系。在小鼠和人體內(nèi)，隨著衰老的進行，生物鐘基因表達水平都存在下降現(xiàn)象，并且近日節(jié)律的相位前移。有研究認為這主要與在衰老過程中SCN內(nèi)的神經(jīng)細胞數(shù)量降低以及神經(jīng)信號強度的減弱有關[46-47]。在向衰老動物體內(nèi)移植胎兒SCN后，各種生物鐘基因的表達水平恢復正常[48]。此外，向衰老倉鼠體內(nèi)移植新生倉鼠的SCN后，衰老倉鼠恢復了近日節(jié)律，并且延長了壽命[49-50]。

進一步研究發(fā)現(xiàn)睪丸間質細胞內(nèi)分泌節(jié)律隨著衰老而減弱，衰老造成了睪酮振蕩幅度的下降。除了減少睪酮分泌外，衰老還降低了Insl3的表達，Insl3是睪丸間質細胞功能的另一個重要標志物。睪酮產(chǎn)生的減少以及Insl3表達的降低反映了老年睪丸間質細胞的功能障礙。但未檢測到能夠對睪酮和Insl3進行正調(diào)控的黃體生成素表達水平的下降，其表達水平的節(jié)律振蕩亦沒有受到影響[34]。此外，衰老也減弱了睪丸間質細胞中類固醇生成相關基因的節(jié)律表達和生物鐘基因的節(jié)律表達[51]。再者，有證據(jù)表明BMAL1對氧化應激和DNA損傷的調(diào)節(jié)反應相當重要，而BMAL1缺乏時誘導的機體失調(diào)導致體內(nèi)應激反應加劇衰老進程[52]。還有研究指出，在衰老小鼠睪丸中，衰老引起的內(nèi)質網(wǎng)應激可通過調(diào)控小鼠睪丸間質細胞的生物鐘進而影響睪酮的合成[38]。

除了衰老引起的氧化應激和內(nèi)質網(wǎng)應激可調(diào)節(jié)睪丸生物鐘之外，還有研究指出束縛應激(Immobilization stress)也可影響睪丸生物鐘的維持。Medar等[53]研究發(fā)現(xiàn)，應激不僅可導致與類固醇生成相關的基因(Lhcgr，Nr3c1，Cyp11a1，Cyp17a1，Hsd3b1/2)在非活動(輕度)階段下調(diào)，降低睪酮水平，還可促進生物鐘基因(Bmal1，Per1/2和Rev-erba)的表達。進一步研究表明，應激可導致糖皮質激素上升，且糖皮質激素處理的大鼠表現(xiàn)出與束縛應激相似的反應，也可促進生物鐘基因(Rev-erbα/β，Cry1/2，Per1/2)的表達，表明束縛應激可通過誘導糖皮質激素的表達參與調(diào)節(jié)睪丸生物鐘的維持[53]。

此外，一些化學物質也可以影響睪丸生物鐘系統(tǒng)的運轉。有研究表明氰戊菊酯殺蟲劑(Fenvalerate, Fen)會造成小鼠睪丸間質細胞內(nèi)生物鐘相關基因(Bmal1、Rev-erbα、Rorα)的表達節(jié)律異常，并存在Ca2+的水平上升以及StAR基因mRNA的表達變化，提示Fen可通過影響小鼠睪丸間質細胞內(nèi)的Ca2+水平與生物鐘相關基因以及類固醇合成關鍵基因StAR的表達抑制睪酮合成[54-55]。近期研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境內(nèi)分泌干擾物雙酚A(Bisphenol A，BPA)可顯著抑制生物鐘系統(tǒng)負反饋因子Nr1d1的表達，影響睪丸及睪丸間質細胞的生物鐘，進而引起睪酮合成相關通路關鍵酶基因表達水平的下降，造成睪酮含量的降低[56]。此外，進一步研究發(fā)現(xiàn)，霉菌毒素赤霉烯酮(Zearalenone，ZEA)可通過抑制間質細胞生物鐘基因(Bmal1、Dbp、Per2和Nr1d1)及類固醇基因(StAR、Hsd3b2和Cyp11a1)的表達進而降低睪酮的合成和分泌，導致雄性小鼠的生殖障礙[57]。

5 結語

越來越多的研究表明睪丸生物鐘在調(diào)控生殖生理、生殖內(nèi)分泌與代謝等方面起著至關重要的作用。生物節(jié)律的紊亂會誘導包括生殖障礙在內(nèi)的各種疾病的發(fā)生。睪丸生物鐘調(diào)控睪酮合成及精子發(fā)生，繼而影響雄性生殖力。衰老及有害化學物質都會對睪丸生物鐘產(chǎn)生極不利的影響，通過降低睪酮的合成進一步影響雄性生殖力。然而，當前研究大多聚焦于生物鐘系統(tǒng)對睪酮合成及精子發(fā)生的影響，對睪丸生物鐘維持的內(nèi)在機制及其對其他生殖輔助細胞如支持細胞等生理功能調(diào)控的研究還較少。此外，睪丸功能及精子發(fā)生具有時空特異性，現(xiàn)有的研究缺乏生物鐘對睪丸與精子特定發(fā)育時期功能的影響，而組織特異性及條件性敲除小鼠模型的構建，將為研究生物鐘系統(tǒng)在睪丸組織中的功能及調(diào)控機制提供重要研究手段。如何通過調(diào)控睪丸生物鐘提高睪酮水平及精子活力，高效發(fā)揮雄性種畜生殖潛力，已經(jīng)成為時間生物學與生殖生理學學科的一個交叉研究方向，有待于進一步深入研究。