李秋陽(yáng)，唐金鑫，劉士偉，鄒佳琪，王麗娜，于雷，畢云楓*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，吉林 吉林 132013）

人參作為一種草本植物，具有非常高的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，在中國(guó)醫(yī)藥研究和工業(yè)應(yīng)用領(lǐng)域一直占有極其重要的戰(zhàn)略地位，人參中的活性物質(zhì)也受到了較高的關(guān)注[1]。在草藥市場(chǎng)，人參主要經(jīng)過(guò)3種方式加工后被食用，即通過(guò)陽(yáng)光脫水后可以從鮮人參中獲得白參[2]，鮮人參蒸制一次后曬干用于生產(chǎn)紅參[3-4]，以及近年來(lái)通過(guò)“九蒸九曬”制成的黑參也因其表現(xiàn)出比白參或紅參更強(qiáng)大的生物活性而引起研究者的關(guān)注[5]。紅參的抗氧化活性和免疫調(diào)節(jié)功能被證明優(yōu)于白參[6]。然而，研究表明，人參中的活性物質(zhì)可在蒸煮過(guò)程中改變部分結(jié)構(gòu)[7-8]。人參也可以利用微生物加工制成發(fā)酵人參，這種處理又進(jìn)一步改變了人參提取物的組成，由于這些處理過(guò)程復(fù)雜多樣，因此識(shí)別其被加工后的活性成分變化及藥理功效是有重要意義的。

發(fā)酵食品備受關(guān)注是因?yàn)樗鼈兊木晏禺愋阅芰梢园l(fā)揮超出其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的免疫調(diào)節(jié)作用[9]。多個(gè)研究表明，發(fā)酵后的人參及其加工品無(wú)論是從生物活性還是功效作用上都表現(xiàn)出比發(fā)酵前更優(yōu)的效果[10-11]。盡管已經(jīng)開(kāi)發(fā)了大量的分析方法來(lái)檢測(cè)人參中存在的人參皂苷，但對(duì)氨基酸的關(guān)注相對(duì)較少。本文通過(guò)發(fā)酵白參、紅參、黑參，探究發(fā)酵前后人參炮制品的功能性成分變化，為后續(xù)的功效分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院新資源加工與利用實(shí)驗(yàn)室保存；腸膜明串珠菌腸膜亞種：中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；白參、紅參、黑參：市售，經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院何忠梅教授鑒定分別為五加科植物人參、紅參及黑參的干燥根；蜂蜜：市售；鄰苯二甲醛（O-phthalaldehyde，OPA）、3-巰基丙酸、17種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品、天冬酰胺標(biāo)準(zhǔn)品、谷氨酰胺標(biāo)準(zhǔn)品、瓜氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、正纈氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、21-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、肌氨酸標(biāo)準(zhǔn)品：Sigma-Alarich生物科技公司；101型大孔吸附樹(shù)脂：天津市海光化工有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒：南京建成生物工程研究所；3，5-二硝基水楊酸、異辛烷、醋酸銅、油酸、橄欖油、福林酚、聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）：上海源葉生物科技有限公司；沒(méi)食子酸、L-酪氨酸：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；乙腈、甲醇（均為色譜純）：賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2600I/島津型可見(jiàn)分光光度計(jì)：島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司；YT1101酶標(biāo)儀：賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；Agilent1100高效液相色譜儀：安捷倫（中國(guó)）科技有限公司；BXM-30R型滅菌鍋：上海東亞壓力容器制造有限公司；300A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：中國(guó)力辰科技有限公司；DOU-2HP型粉碎機(jī)：日本佑琦有限公司。

1.3 方法

1.3.1 人參發(fā)酵樣品的制備

原料經(jīng)過(guò)粉碎后，過(guò)60目篩，準(zhǔn)確稱(chēng)取60.00 g，添加120.00 mL水，接種4%混合菌[植物乳桿菌∶腸膜明串珠菌腸膜亞種=1∶1（體積比）]，菌液濃度為3.63×108CFU/mL，室溫（30℃～32℃）發(fā)酵23 d。

1.3.2 總酸含量的測(cè)定

參照GB 12456—2021《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中總酸的測(cè)定》中的指示劑滴定法檢測(cè)，結(jié)果以檸檬酸計(jì)。

1.3.3 總糖含量的測(cè)定

參照NY/T 2332—2013《紅參中總糖含量的測(cè)定分光光度法》中分光光度法測(cè)定總糖含量，結(jié)果以葡萄糖計(jì)?？偺呛康挠?jì)算公式如下。

式中：W 為總糖含量，%；m1為葡萄糖含量，mg；V為試樣的定容體積，mL；V1為稀釋液的體積，mL；f為稀釋倍數(shù)；m為試樣的質(zhì)量，g。

1.3.4 總酚含量的測(cè)定

總酚含量采用福林酚法測(cè)定，以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)計(jì)。稱(chēng)取0.5 g沒(méi)食子酸溶于10 mL無(wú)水乙醇中，再用蒸餾水定容至100 mL，得到5 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。量取 1、3、5、7、9 mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液于 100 mL 容量瓶中，用蒸餾水定容，配制沒(méi)食子酸系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取0.1 mL沒(méi)食子酸系列標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中，添加0.5mL福林酚溶液，混勻，室溫（30℃～32℃）下反應(yīng)5 min，加入2.0 mL 15%碳酸鈉溶液，蒸餾水定容至10 mL，置于室溫（30℃～32℃）下暗處反應(yīng)2 h。在波長(zhǎng)765 nm處測(cè)定吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.001 5x+0.04（R2=0.999 5）。發(fā)酵樣品3 500 r/min離心10 min，取上清液0.1 mL于10 mL容量瓶中，添加0.5 mL福林酚溶液，之后的步驟同前述方法。

1.3.5 人參皂苷含量的測(cè)定

1.3.5.1 人參皂苷的提取方法

準(zhǔn)確稱(chēng)取適量發(fā)酵前后樣品于燒杯中，加入3倍體積的甲醇，超聲處理30 min，靜置12 h后以3 500 r/min離心10 min，倒出上清液，所剩樣品繼續(xù)加入相同量的甲醇超聲30 min，靜置12 h，以3 000 r/min離心10 min，合并2次上清液，80℃水浴蒸發(fā)至溶液的一半，隨后加入4倍體積的正丁醇溶液，搖勻，靜置12 h，將上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，加入5 mL甲醇溶解，溶液過(guò)0.22 μm濾膜，即得人參皂苷待測(cè)溶液。

1.3.5.2 色譜條件

色譜柱為C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈（A）-0.05%磷酸鹽水溶液（B）；梯度洗脫（0.1 min～5 min，18%A；5 min～20 min，21%A；20 min～22 min，21%～26%A；22 min～26 min，26%～32%A；26 min～46 min，32%～33.8%A；46 min～51 min，33.8%～38%A；51 min～57.7 min，38%～49%A；57.7 min～58 min，49%～49.1%A；58 min～62 min，49.1%A；62 min～63 min，49.1%～50.6%A；63 min～68 min，50.6%～59.6%A；68 min～69.8 min，59.6%～65%A；69.8 min～77 min，65%A；77 min～94 min，65%～85%A；94 min～120 min，18%A）。檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm，流速：1.0 mL/min，進(jìn)樣量：10 μL，柱溫：35 ℃。

1.3.6 游離氨基酸含量的測(cè)定

1.3.6.1 樣品前處理

將樣品研碎，稱(chēng)取1.5 g樣品置于10 mL離心管中，加0.01 mol/L鹽酸5 mL，混勻，沸水浴30 min后，10 000 r/min離心10 min，取上清液；沉淀中加入2 mL 0.01 mol/L鹽酸后懸浮超聲5 min，離心（3 500 r/min，10 min），合并上清液，蒸餾水定容至 10 mL，過(guò) 0.22 μm濾膜。

1.3.6.2 在線柱前衍生

采用安捷倫公司自動(dòng)在線衍生化方法，一級(jí)氨基酸與鄰苯二甲醛（OPA）、二級(jí)氨基酸與芴甲氧羰酰氯（fluorenylmethyloxycarbonyl，F(xiàn)MOC）衍生后過(guò)柱檢測(cè)。柱前衍生進(jìn)樣流程：先從樣品抽取1 μL樣品液（進(jìn)樣針插入洗液瓶中1次，清洗進(jìn)樣針外壁，以下每次進(jìn)樣相同），隨后抽取2 μL硼酸緩沖液，在空氣中反復(fù)抽吸3次，混勻，再抽取1 μL OPA衍生試劑，在空氣中反復(fù)抽吸3次混勻，靜置反應(yīng)0.5 min，同樣抽取1 μL FMOC衍生試劑，在空氣中反復(fù)抽吸3次混勻，靜置反應(yīng)0.5 min，最后抽取13 μL超純水，在空氣中反復(fù)抽吸3次混勻，進(jìn)樣。

1.3.6.3 色譜條件

色譜柱為ZORBAX Eclipse AAA（4.6 mm×75 mm，3.5 μm）；檢測(cè)信號(hào)為紫外波長(zhǎng) 338（0～19 min）、266 nm（19.01 min～25 min）；流動(dòng)相為（A）乙腈，（B）乙腈 ∶甲醇∶水=45∶45∶10（體積比）；梯度洗脫（0.1 min～1 min，100%A；1 min～7.5 min，100%～23%A；7.5 min～12 min，23%～40%A；12 min～23 min，40%～46%A；23 min～27 min，46%～0%A；27 min～40 min，0%～100%A）。流速：1.0 mL/min，進(jìn)樣量：10 μL。

1.3.7 蛋白酶酶活力的測(cè)定

稱(chēng)取發(fā)酵前后樣品10 g，4 000 r/min離心20 min，取上層清液1 mL于10 mL容量瓶中，蒸餾水定容后取0.5 mL，滴加0.5 mol/L 0.2 mL氫氧化鈉溶液，加入80 mL緩沖液（pH7.5磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉溶液），在沸水浴中邊加熱邊攪拌，直至完全溶解，冷卻后轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，用緩沖液定容，備用。蛋白酶酶活力的測(cè)定參照王學(xué)標(biāo)等[12]的方法。

1.3.8 脂肪酶酶活力的測(cè)定

取發(fā)酵前后樣品10 g，4 500 r/min離心25 min，取上清液0.5 mL于10 mL容量瓶中，加蒸餾水定容，備用。脂肪酶酶活力的測(cè)定參照孫淑夷[13]的方法。

1.3.9 SOD酶活力的測(cè)定

取發(fā)酵前后樣品10 g，4 000 r/min離心15 min，取上清液0.5 mL于10 mL容量瓶中，加蒸餾水定容，取適量稀釋后的樣品液，按照SOD酶試劑盒方法進(jìn)行SOD酶活力的測(cè)定。

1.3.10 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，使用Microsoft Excel 2019和Origin pro 8.5作圖及SPSS 26進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵前后基本理化指標(biāo)結(jié)果分析

總酸、總糖、總酚是發(fā)酵產(chǎn)品中理化檢測(cè)的指標(biāo)，其中，總酸作為微生物代謝酒精發(fā)酵及蘋(píng)果酸-乳酸發(fā)酵過(guò)程中最終合成的代謝產(chǎn)物，常常被用于優(yōu)化發(fā)酵工藝，在發(fā)酵過(guò)程中微生物會(huì)不斷分解糖類(lèi)用來(lái)滿(mǎn)足自身生長(zhǎng)所需的碳源[14]；同時(shí)，微生物代謝產(chǎn)生的酚類(lèi)物質(zhì)具有很強(qiáng)的清除自由基的能力，還有抑制低密度脂蛋白氧化等功能[15]。利用指示劑滴定法測(cè)定總酸含量，分光光度計(jì)法測(cè)定總糖和總酚含量，表1為發(fā)酵前后總酸、總糖、總酚含量對(duì)比。

表1 發(fā)酵前后總酸、總糖、總酚含量對(duì)比Table 1 Comparison of total acid，total sugar and total phenol content before and after fermentation

由表1可知，在發(fā)酵后，人參炮制品的總酸含量增加，其中，紅參發(fā)酵前后總酸含量增幅最大，由3.840 mg/mL增至43.390 mg/mL；白參對(duì)總糖利用率最高，達(dá)到75.00%；發(fā)酵后的黑參總酚含量由0.680 mg/mL增至1.360 mg/mL，增加至2倍左右。從結(jié)果可以看出，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，微生物對(duì)底物的不斷利用使發(fā)酵液中總糖含量降低，作為發(fā)酵代謝產(chǎn)物的總酚及總酸含量增加，這些理化指標(biāo)的變化表明，發(fā)酵過(guò)程符合微生物生長(zhǎng)代謝基本生理變化，同時(shí)也不同程度地提升了發(fā)酵液的功能性。

2.2 發(fā)酵前后人參皂苷轉(zhuǎn)化結(jié)果分析

采用高效液相色譜法對(duì)人參皂苷進(jìn)行了分析，發(fā)酵前后人參皂苷含量對(duì)比結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 發(fā)酵前后人參皂苷含量對(duì)比Table 2 Comparison of ginsenoside content before and after fermentation

由表2可知，發(fā)酵前的白參中人參皂苷Rb1、Rc及Re的含量較高，由于高溫加工的進(jìn)行，紅參和黑參中 Rb1、Rc、Rb2 及 Re含量減少，轉(zhuǎn)化成 Rg3、Rk1 和F2等白參中極少含有的稀有皂苷。白參生成的二醇型次級(jí)代謝產(chǎn)物主要為Rg3、F2和Rh2，含量分別為0.16、0.69 mg/g和0.21 mg/g；生成的三醇型次級(jí)代謝產(chǎn)物主要為Rg2和Rh4，含量分別為1.94 mg/g和0.49 mg/g。紅參中的二醇型人參皂苷主要轉(zhuǎn)化為稀有皂苷Ck、Rk1和F2，轉(zhuǎn)化率分別為200.00%、44.00%和216.67%；主要三醇型皂苷轉(zhuǎn)化為稀有皂苷Rk3、Rg2和Rh4，轉(zhuǎn)化率分別為21.05%、40.74%和69.23%；苷元PPD和PPT的轉(zhuǎn)化率為568.42%和282.35%。黑參中的主要二醇型皂苷主要轉(zhuǎn)化為稀有皂苷Ck、F2和Rh2，轉(zhuǎn)化率分別為366.67%、269.57%和100.00%；三醇型人參皂苷主要轉(zhuǎn)化為稀有皂苷Rh1、Rk3和Rh4，轉(zhuǎn)化率分別為300.00%、80.00%和361.22%；苷元PPD和PPT的轉(zhuǎn)化率為555.17%和207.69%。

2.3 發(fā)酵前后游離氨基酸含量結(jié)果分析

人參中富含多種氨基酸，其中包含8種人體必需氨基酸，其含量已成為衡量人參產(chǎn)品質(zhì)量的指標(biāo)之一。利用高效液相色譜法測(cè)定人參炮制品發(fā)酵前后游離氨基酸的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 發(fā)酵前后游離氨基酸含量對(duì)比Table 3 Comparison of free amino acid content before and after fermentation

續(xù)表3 發(fā)酵前后游離氨基酸含量對(duì)比Continue table 3 Comparison of free amino acid content before and after fermentation

由表3可知，在發(fā)酵前，人身炮制品中游離氨基酸含量大小排序?yàn)榘讌ⅲ炯t參＞黑參，可能是由于在加熱過(guò)程中發(fā)生的美拉德反應(yīng)使汽蒸過(guò)程中氨基酸含量有所下降。在發(fā)酵后，3種參總氨基酸含量大幅度降低。在發(fā)酵前，必需氨基酸含量排序?yàn)榘讌ⅲ炯t參＞黑參，發(fā)酵后，除白參中必需氨基酸含量增加外，紅參和黑參的必需氨基酸含量均明顯降低，但發(fā)酵后必需氨基酸的占比均有所提高。對(duì)于發(fā)酵后游離氨基酸含量的降低，一方面可能由于發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)導(dǎo)致氨基酸在缺乏氮源時(shí)被微生物作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗，另一方面在發(fā)酵過(guò)程中游離氨基酸代謝生成了蛋白質(zhì)及酶，但具體原因還需進(jìn)一步研究。

2.4 發(fā)酵前后功效酶酶活力結(jié)果分析

蛋白酶、脂肪酶以及SOD被稱(chēng)為人體主要的功效酶。其中，SOD為廣泛存在于生物機(jī)體內(nèi)抗氧化酶的總稱(chēng)，能夠清除動(dòng)植物體內(nèi)自由基和活性氧，在預(yù)防衰老和抗氧化等方面起到重要作用。蛋白酶是一組大分子復(fù)雜酶，可水解氨基酸和蛋白質(zhì)之間的肽鍵。大量的蛋白酶主要來(lái)源于微生物發(fā)酵過(guò)程，因其對(duì)生物分子具有特異性、參與調(diào)節(jié)某些生理途徑，在生物科技及醫(yī)藥中備受關(guān)注。脂肪酶是酶類(lèi)的一種，也可以進(jìn)行水解反應(yīng)以及酯化反應(yīng)，而其本質(zhì)是由氨基酸組成的蛋白質(zhì)物質(zhì)。蛋白酶及脂肪酶可以有效分解食物中蛋白質(zhì)、油脂等高熱量物質(zhì)，所以被廣泛應(yīng)用于減肥產(chǎn)品、保健產(chǎn)品中。這3種功效酶酶活力常被作為微生物發(fā)酵類(lèi)保健產(chǎn)品的檢測(cè)指標(biāo)[16-17]。

圖1～圖3分別為3種參發(fā)酵前后SOD、蛋白酶、脂肪酶酶活力的對(duì)比圖。

圖1 發(fā)酵前后SOD酶活力的變化Fig.1 Changes of SOD enzyme activity before and after fermentation

圖2 發(fā)酵前后蛋白酶酶活力的變化Fig.2 Changes of protease enzyme activity before and after fermentation

如圖1所示，SOD酶活力在發(fā)酵前后，黑參都屬最高，發(fā)酵后的SOD酶活力是發(fā)酵前的2.13倍，達(dá)到88.59 U/mL。由圖2可以看出，在發(fā)酵前，黑參蛋白酶酶活力最高，為20.423 8 U/mL，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，3組人參炮制品的蛋白酶酶活力均增加，且發(fā)酵后黑參中的蛋白酶酶活力最高，為36.421 9 U/mL。由圖3可知，脂肪酶酶活力在發(fā)酵后也有所提升。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，黑參脂肪酶酶活力由6.48 U/mL提升至16.48 U/mL。以上結(jié)果表明，經(jīng)發(fā)酵，3組人參炮制品中人體主要的功效酶酶活力均有不同程度的提升，這將有利于功效性產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)。

3 討論與結(jié)論

人參是一種著名的功能性保健食品，用于提神醒腦、消除慢性疲勞、改善健康。在部分亞洲國(guó)家，它已被用作膳食補(bǔ)充劑[18-19]。在加工和發(fā)酵的過(guò)程中，人參中的人參皂苷和氨基酸等主要生物活性成分會(huì)發(fā)生變化，并產(chǎn)生多種生物活性化合物，這些化合物可能會(huì)在體內(nèi)誘導(dǎo)獨(dú)特的生理活性。對(duì)于人參皂苷含量的變化，在發(fā)酵前，白參中天然皂苷含量較高。與白參相比，紅參和黑參中 Rb1、Rc、Rb2、Re 含量逐漸減少，Rg3、Rk1和F2等稀有皂苷有少量生成。白參在發(fā)酵后，生成的次級(jí)代謝產(chǎn)物主要為F2、Rg2和Rh4，紅參在發(fā)酵后其主要轉(zhuǎn)化為稀有皂苷Ck、F2和Rh4，黑參其主要轉(zhuǎn)化為稀有皂苷Ck、F2、Rh1和Rh4，這與相關(guān)文章中分析的皂苷轉(zhuǎn)化路徑是相符合的。結(jié)果表明，人參皂苷通過(guò)高溫加工和微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化為更具功效的稀有皂苷。

人參中重要的化學(xué)成分除人參皂苷外還有人參氨基酸。氨基酸是含有羧基（-COOH）和氨基（-NH2）官能團(tuán)的重要有機(jī)化合物，以往的研究表明，人參中氨基酸含量豐富，是人參產(chǎn)品質(zhì)量控制的重要指標(biāo)[20]。Liu等[21]指出，經(jīng)過(guò)氨基酸處理的低極性人參皂苷的濃度顯著高于未經(jīng)處理的人參，這對(duì)提高人參功效更有意義。因此，文中對(duì)人參中24種游離氨基酸的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，在發(fā)酵前，白參中24種游離氨基酸的總含量最高，而黑參中氨基酸總含量最低。在發(fā)酵后，3種參的游離氨基酸含量大幅度減少。此外，功效酶酶活力也用來(lái)分析人參炮制品發(fā)酵前后功能性成分的變化，結(jié)果表明，人參炮制品在發(fā)酵后，主要的功效酶酶活力均有不同程度的提升。本研究以期為人參的加工和利用提供參考。