韓 琦，楊煥民，李士澤，張 旭，逯靜靜，徐 彬

(黑龍江八一農墾大學 動物科技學院，黑龍江 大慶 163319)

越來越多的研究證據(jù)表明，環(huán)境的異常變化對機體有著較大的影響，會影響代謝、呼吸、血液循環(huán)，還會增加死亡率。寒冷作為北方常見的應激原，是制約畜牧業(yè)發(fā)展的重要因素。長期暴露在冷環(huán)境中，會引起機體的應激反應。冷應激會降低動物機體的抵抗力，增加患病的風險。因此探明冷應激對機體功能的影響，對闡明冷應激的機理以及防止寒冷傷害具有重要意義。

腎臟作為人體泌尿系統(tǒng)中最重要的器官，在血液循環(huán)中，承擔著濾過代謝廢物并排出體外及重吸收各種營養(yǎng)物質的重要使命。有研究表明低溫會損傷腎小管上皮細胞[1]，導致腎功能下降，進而造成腎臟的損傷。有文獻指出，內質網(wǎng)應激(ERS)會參與腎臟損傷的過程[2]。

內質網(wǎng)(ER)是一種多用途的細胞器，存在于大多數(shù)細胞中，其主要功能之一是對新生成蛋白的翻譯后折疊和對錯誤折疊蛋白的再加工[3]。ER功能易受外界環(huán)境變化影響，如氧氣供應不足等會破壞ER腔內穩(wěn)態(tài)，引起ER功能損傷，導致未折疊及錯誤折疊蛋白的堆積，誘發(fā)ERS[4-7]。細胞為了降解ER中堆積的未折疊蛋白會啟動未折疊蛋白反應(unsaturated polyester resins,UPR)。研究發(fā)現(xiàn)，真核細胞通過3種不同的機制處理UPR，第1種是增強對未折疊蛋白的折疊；第2種是降低對蛋白質的翻譯；第3種是通過ER的降解作用降解未折疊和錯誤折疊蛋白[8]。UPR具有雙重性，短暫的ERS作用下UPR能夠幫助細胞回歸穩(wěn)定狀態(tài)，但在嚴重和持久的ERS條件下，因UPR的適應性不能消除堆積的未折疊蛋白，ER功能恢復正常狀態(tài)而導致機體產生的其他機制[9]。綜上，本試驗旨在探究冷暴露對腎臟造成損傷的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物5周齡SPF級C57BL/6雄性小鼠(體質量為22～24 g)，購于遼寧長生生物技術股份有限公司。在人工智能氣候室中：(24±2)℃，40%相對濕度下，明/暗：12 h/12 h，小鼠自由飲水進食。

1.2 試驗方法將5周齡雄性C57BL/6小鼠隨機分為室溫對照組和冷暴露組。室溫對照小鼠于(24±2)℃環(huán)境中飼養(yǎng)。冷暴露組小鼠在早上8點到晚上8點之間隨機在4℃環(huán)境中刺激3 h，共刺激3周。

1.3 主要儀器人工智能氣候室(濟南旭邦電子科技有限公司)、酶標儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)、電泳儀、電泳槽(BIO-RAD，美國)、化學發(fā)光數(shù)字成像系統(tǒng)(BIO-RAD，美國)、球磨儀(弗爾德儀器設備有限公司)。

1.4 主要試劑BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒均購于碧云天生物技術有限公司；HRP-山羊抗小鼠二抗、HRP-山羊抗兔二抗；P-eiF2α、eiF2α、XBP1、GRP78、Chop、LC3、P62、Beclin1、ATG7一抗(武漢三鷹生物技術有限公司)。

1.5 q-PCR檢測腎臟組織中TNF-α、IL-1β mRNA的表達向腎臟組織中加入1 mL TRIzol 進行RNA提取，反轉錄成cDNA，最后進行擴增。引物序列如表1所示。

表1 引物序列

1.6 HE染色取小鼠腎臟組織，用4%的多聚甲醛固定，包埋，切片，二甲苯脫蠟，水化，蘇木精染色，分化，伊紅染色，脫水，封片，最后用顯微鏡觀察。

1.7 對小鼠腎臟ERS和自噬相關蛋白表達的檢測剪取腎臟組織樣本，提取總蛋白。用BCA蛋白檢測試劑盒測定樣品蛋白濃度，根據(jù)標準曲線計算出蛋白濃度，樣品按統(tǒng)一濃度用RIPA稀釋，加入Buffer混勻，煮沸7 min。蛋白經SDS-PAGE凝膠電泳分離后，轉移至PVDF膜上，在5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h，4℃孵育一抗，室溫孵育二抗。最后用Image Lab軟件對蛋白灰度進行分析。

2 結果

2.1 腎臟組織中TNF-α、IL-1β mRNA的表達與對照組相比，冷暴露組小鼠腎臟組織中TNF-α、IL-1β mRNA的表達顯著升高(圖1)。

***. P<0.001； **.P<0.01。下同

2.2 慢性冷暴露后小鼠腎臟的病理學變化HE染色結果可觀察到與對照組相比，冷暴露組小鼠腎臟組織中炎癥細胞增多，腎小管上皮細胞可見變性壞死(圖2)。

A.對照組小鼠腎臟組織結構； B.冷暴露組小鼠腎臟組織結構

2.3 慢性冷暴露對小鼠腎臟ERS的影響蛋白質免疫印跡試驗結果表明，與對照組相比慢性冷暴露組內小鼠腎臟內質網(wǎng)應激相關蛋白(p-eiF2α、eiF2α、CHOP、XBP1、GRP78)蛋白的表達水平升高(圖3)。

A.Western blot；B.p-eiF2α/eiF2α比值;C.XBP1相對表達水平;D.GRP78相對表達水平;E.CHOP相對表達水平

2.4 慢性冷暴露對小鼠腎臟自噬的影響蛋白質免疫印跡試驗結果表明，與對照組相比慢性冷暴露組小鼠腎臟自噬相關蛋白(ATG7、Beclin1、LC3、P62)蛋白的表達水平升高(圖4)。

A.Western blot；B.ATG7相對表達水平;C.Beclin1相對表達水平;D.LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值;E.P62相對表達水平

3 討論

在北方高寒地區(qū)，低溫環(huán)境對畜禽養(yǎng)殖造成了很大的影響。徐晶等[10]研究發(fā)現(xiàn)急性冷暴露會影響仔豬腎臟的功能。本課題組前期試驗猜測冷暴露對小鼠腎臟功能也會有影響。于是本試驗對腎臟相關的血液生化指標尿素、肌酐及尿酐比的水平進行了檢測。肌酐水平可以反映出腎小球濾過功能受損的程度[11]。試驗結果顯示與對照組相比，冷暴露組小鼠肌酐水平升高，這提示冷暴露可能影響腎臟的功能，與本研究猜想相符合。

腎臟是機體一個重要的器官，其可以清除體內代謝產物并重吸收有用的物質。葉翠[12]研究發(fā)現(xiàn)腎小球濾過功能受損會導致腎病的發(fā)生。根據(jù)組織學和q-PCR結果顯示，冷暴露組小鼠腎臟組織中有炎癥細胞的浸潤，炎癥因子TNF-α、IL-6 mRNA表達顯著升高。這表明慢性冷暴露會促進腎臟發(fā)生炎癥反應。

已有研究證實ERS的激活參與腎小囊上皮細胞損傷、腎小球系膜細胞損傷及腎小管上皮細胞損傷[13]。因此本試驗檢測了ERS相關蛋白GRP78、XBP1的表達。GRP78主要參與UPR，當未折疊蛋白在ER中累積時，GRP78與跨膜蛋白分離，使跨膜信號蛋白聚集，感應并傳遞UPR信號[14-15]。XBP1可作為ERS的傳感器，調控UPR。同時有報道稱ERS激活會引起凋亡基因CHOP表達升高，CHOP的過度表達觸發(fā)凋亡途徑，使細胞發(fā)生凋亡[16]。本試驗中，CHOP、GRP78和XBP1在冷暴露組小鼠腎臟組織中表達較對照組升高。得出結論，當機體受到冷刺激后，會促進腎臟炎癥反應的發(fā)生，誘發(fā)ERS。

ERS與自噬的相互作用在很多生理與病理過程中都存在，ERS可通過多種分子機制誘導細胞發(fā)生自噬[17-18]，減輕ER壓力并維持細胞穩(wěn)態(tài)[19]。然而，高強度或持久的應激可啟動細胞依賴自噬的死亡程序。Beclin-1是自噬關鍵調控蛋白之一[20]，可形成 Beclin1-Vps34-Vps15 復合結構而啟動自噬、促進吞噬泡成核并召募蛋白形成自噬前體[21]。eiF2α的激活是多種疾病中錯誤折疊蛋白積累引起自噬激活所必需的，其激活可以促進LC3的轉化。LC3是參與自噬的關鍵蛋白[22]，其包括2種可以相互轉化的形式，分別是LC3Ⅰ和LC3Ⅱ[23]。LC3Ⅱ隨著自噬體膜的數(shù)量增多而增加。P62是自噬過程重要的受體，其與泛素化蛋白和LC3Ⅱ結合成復合體，啟動自噬體形成[24]。在本研究中，對自噬相關蛋白的檢測發(fā)現(xiàn)，慢性冷暴露會導致小鼠腎臟自噬激活。

綜上所述慢性冷暴露會促進腎臟炎癥反應的發(fā)生，引發(fā)ERS，誘發(fā)細胞自噬。而關于慢性冷暴露引起腎臟損傷的機制還需要進一步研究。