何 遙，李 偉，董榮錄，祁秋景，李 萍，林東岳*，孟凡利，楊良保*

1.安徽大學(xué)物質(zhì)科學(xué)與信息技術(shù)研究院，安徽 合肥 230039 2.中國科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院健康與醫(yī)學(xué)技術(shù)研究所，安徽 合肥 230031 3.安徽省公安廳物證鑒定管理處，安徽 合肥 230000 4.東北大學(xué)信息科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 沈陽 110819 5.東營市疾病預(yù)防控制中心，山東 東營 257091

引 言

1972年，美國食品藥品監(jiān)督管理局正式批準芬太尼為靜脈麻醉劑[1]。近年來，由于芬太尼類物質(zhì)具有更強麻醉作用，早已替代傳統(tǒng)毒品成為全球流行的第三代毒品。2017年芬太尼成為美國藥物濫用致死排行榜榜首，致死人數(shù)高達2.9萬人，是海洛因的1.8倍[2]。據(jù)美國國家法醫(yī)實驗室信息系統(tǒng)統(tǒng)計，僅2019年芬太尼類出具報告100 378例，比2018年增加了12%[3]。在2012年至2015年國內(nèi)累計僅發(fā)現(xiàn)6份芬太尼類物質(zhì)，但在2016年卻發(fā)現(xiàn)了66份芬太尼類物質(zhì)，是前三年的11倍[4]。我國在2018年已經(jīng)有25種芬太尼類物質(zhì)被列入管制的新精神活性物質(zhì)，占所有新精神活性物質(zhì)的15%[5]。走私與生產(chǎn)芬太尼類物質(zhì)的案件數(shù)在我國不斷攀升，而且新型芬太尼類物質(zhì)也不斷涌現(xiàn)，嚴重威脅公共安全與人們健康，因此檢測與分析此類毒品具有重要意義。

芬太尼類物質(zhì)經(jīng)過人體吸收與代謝后[6]，仍然會存在一定原體隨著尿液排出。表面增強拉曼光譜(surface enhanced Raman spectroscopy，SERS)可以反映待測物的信息以進行物質(zhì)的識別。利用金、銀等貴金屬納米材料作為增強基底，目標物的SERS信號可以百萬倍的放大，甚至能夠達到超靈敏的單分子檢測水平，因此可以利用SERS對復(fù)雜體系中的痕量物質(zhì)進行檢測。SERS增強原理普遍認為有兩種：(1)基于光-貴金屬納米材料的光學(xué)特性引起電磁場增強的物理增強機制[7-8]；(2)基于分子-貴金屬納米材料相互作用而產(chǎn)生的更具分析物特異性的化學(xué)增強機制[9-10]。一般情況下，化學(xué)增強由于其作用效果較弱。化學(xué)增強中主要的電子效應(yīng)被理解為非共振變化、分子激發(fā)共振增強和電荷轉(zhuǎn)移共振的累積而導(dǎo)致分子極化率的改變。因此，影響SERS光譜譜峰特征的主要因素為分子電子結(jié)構(gòu)、振動模式與振動頻率。然而尿液背景峰與芬太尼類物質(zhì)SERS光譜特征峰存在高度重疊，芬太尼類SERS光譜強特征峰1 000與1 030 cm-1處譜峰特征幾乎完全被尿液背景峰掩蓋，這對尿液中芬太尼類物質(zhì)SERS光譜的識別造成很大的干擾。尿液背景峰的扣除與芬太尼類SERS光譜特征還原對光譜識別具有重要意義。

通常分析復(fù)雜混合物成分時會使用譜峰分解模型，再根據(jù)解析出的譜峰進行分析與計算[11]。計算時，線型以及迭代算法的選擇較為重要，其將直接影響解析模型的速度與正確度。通常解析模型所使用的線型為高斯，迭代算法為非線性最小二乘法[12]。但這并不適合SERS光譜的譜峰解析，因為SERS光譜具有較強的噪聲與熒光干擾[13]，且使用平滑去噪算法[14-15]會影響其解析結(jié)果正確性。非線性最小二乘法進行迭代計算時受約束條件與初始值預(yù)估等諸多因素干擾，容易出現(xiàn)無法求解的現(xiàn)象。尿液中芬太尼類SERS光譜重疊嚴重，過度使用平滑去噪會對譜峰解析造成影響，無法求解出準確結(jié)果，影響后續(xù)尿液背景扣除與芬太尼類SERS光譜特征還原。噪聲與熒光信息對SERS光譜的干擾，導(dǎo)致其很難對迭代參數(shù)的初始值進行準確預(yù)估，這直接影響譜峰分解的速度與精確度[16]。

選擇Voigt線型建立譜峰解析模型，對尿液與芬太尼類重疊SERS光譜片段935～1 100 cm-1進行譜峰分析。為解決SERS光譜具有噪聲與熒光干擾等問題，選擇對初始值并不敏感的無約束非線性優(yōu)化算法(Nelder-Mead算法)[17]作為參數(shù)迭代的算法。利用其對SERS光譜進行譜峰分解，防止出現(xiàn)不收斂與過擬合的情況。根據(jù)SERS光譜特征半峰寬與峰高的特征對解析峰集合進行篩選，設(shè)計合適的條件對含芬太尼類SERS光譜的尿液背景峰進行扣除，并還原芬太尼類SERS光譜特征。利用相似系數(shù)(hit quality index，HQI)作為光譜判別條件，對還原后的SERS光譜片段進行識別，區(qū)分尿液中奧芬太尼、乙酰芬太尼與呋喃芬太尼三種芬太尼。

1 算法介紹

1.1 建立扣除尿液SERS光譜背景峰的解析模型

在SERS光譜中，尿液與芬太尼類在1 000與1 030 cm-1兩處特征峰高度重合。芬太尼類物質(zhì)主要特征峰幾乎被尿液背景峰所覆蓋。為了提取出芬太尼類SERS光譜，利用算法對尿液背景峰進行扣除，還原芬太尼類物質(zhì)原本SERS光譜特征，建立尿液與芬太尼類SERS光譜解析模型，通常使用高斯線型進行譜峰解析，拉曼譜峰實際線型更貼近勞倫茲線型[18]。但是由于檢測儀器與樣本的不同，實際SERS光譜特征峰更接近Voigt線型。Voigt線型定義如式(1)所示[19]

(1)

式(1)中，α為高斯-勞倫茲系數(shù)；β為峰高；x為拉曼位移；ω為峰位；φ為半峰寬，可直接影響Voigt線型。待解析光譜則可視為n個Voigt峰之間的疊加。如式(2)所示

(2)

式(2)中，θi為解析模型中第iVoigt線型的需要求解的參數(shù)。針對以上解析模型，一般使用非線性最小二乘法對n以及需要求解的參數(shù)進行迭代，尋找其最優(yōu)解。由于噪聲干擾與熒光背景，結(jié)合對初始值不敏感的無約束非線性優(yōu)化算法(Nelder-Mead算法)進行參數(shù)迭代。

尿液與芬太尼類SERS光譜譜峰大多為單峰與重疊峰。在進行單峰譜峰解析時，光譜片段噪聲與熒光背景不多，可直接對其進行迭代計算。但尿液中芬太尼類SERS光譜1 000與1 030 cm-1處為重疊峰。在進行重疊峰分解時，其為多個譜峰的疊加且噪聲等干擾較多，不能單獨進行分解，需對其進行聯(lián)合分解，并考慮其重疊部分。本文提出在進行譜峰解析前直接設(shè)定需要解出譜峰的個數(shù)N，并對其進行迭代參數(shù)粗略的預(yù)估與設(shè)計。對重疊峰的譜峰分解步驟如下所示：

(1)載入光譜片段，去基線，并對處理后的光譜進行峰值歸一化；

(2)初始化分解峰集合Ω={}與光譜解析峰的個數(shù)N=1；

(3)對ω(峰位)、φ(半峰寬)與α(高斯-勞倫茲系數(shù))進行預(yù)估；

(4)利用Nelder-Mead算法進行迭代，并計算擬合光譜與原始光譜的誤差，然后將擬合峰存入Ω中；

(5)若誤差小于0.1，則其算法結(jié)束，集合Ω即為背景光譜的所有解析峰，若誤差大于0.1，則需擬合峰的個數(shù)N+1，返回步驟(3)繼續(xù)算法。

在步驟(3)中對ω(峰位)的預(yù)估的方法與峰個數(shù)N與光譜起始位置有關(guān)，將光譜平均分成N等份，以分割線的位置作為ω(峰位)的預(yù)估值。等份的長度作為φ(半峰寬)的預(yù)估值。α(高斯-勞倫茲系數(shù))初始值為0.4。

1.2 扣除尿液SERS光譜背景峰擬合算法

為了還原其中芬太尼類物質(zhì)SERS特征峰，不僅需要對其進行譜峰分解，還需扣除尿液背景峰。在進行譜峰解析后，根據(jù)拉曼特征峰的特點對分解峰進行濾除，自動扣除尿液背景干擾，還原芬太尼類SERS光譜。利用SERS光譜特征半峰寬對芬太尼類光譜進行還原步驟如下所示：

(1)載入光譜片段，并對光譜進行譜峰解析，得到其分解峰集合Ω；

(2)計算原始光譜1 000與1 030 cm-1處半峰寬x1與x2；

(3)若集合Ω中解析峰半峰寬xΩ∈[x2,x1]，則該分解峰計入芬太尼類SERS光譜分解峰中，反之則計入尿液背景峰中；

(4)對芬太尼類SERS光譜分解峰集合進行擬合，并在標準品數(shù)據(jù)庫中進行搜索，用相似系數(shù)HQI作為物質(zhì)分類的標準，HQI計算公式如式(3)所示：

(3)

(5)遍歷光譜庫中標準品SERS光譜后，匹配系數(shù)最大且高于85%的標準譜為最終結(jié)果。

2 實驗部分

2.1 材料和試劑

SERS增強基底由安徽中科賽飛爾科技有限公司提供。呋喃芬太尼、乙酰芬太尼與奧芬太尼均來自安徽省公安廳物證鑒定中心。在整個實驗過程中使用的超純水為18.25 MΩ·cm。

尿樣來自于中國科學(xué)院合肥腫瘤醫(yī)院，分別將三種芬太尼加入到人的尿樣中，分別制備成含有50，10，1和0 mg·kg-1三種芬太尼類物質(zhì)的模擬尿樣。

2.2 儀器與設(shè)備

手持式拉曼光譜儀由安徽中科賽飛爾科技有限公司提供，具體配置為：焦距為7.5 mm，光譜分辨率為7 cm-1，光斑范圍1 μm2，激光波長785 nm，最大功率為500 mW。數(shù)據(jù)分析所用軟件為：Matlab 2016b。電腦配置為：Intel core i7-9750 H。

2.3 光譜采集

每種濃度樣品各準備10個樣品，每個樣品測20條光譜。部分SERS光譜數(shù)據(jù)如圖1所示。分析尿液與芬太尼類拉曼特征，發(fā)現(xiàn)其在1 000與1 030 cm-1處高度重合，于是選取935～1 100 cm-1拉曼片段進行譜峰分解。

圖1 尿液與含不同芬太尼尿樣的SERS光譜對比圖

3 結(jié)果與討論

3.1 譜峰解析模型參數(shù)的優(yōu)化

在進行譜峰分解時，需要選擇合適的線型對光譜片段進行解析。線型的選擇與解析結(jié)果密切相關(guān)。通常使用高斯線型對光譜譜峰進行解析，但是其擬合效果較差，無法較精準擬合原始光譜，容易出現(xiàn)峰位偏移與峰形畸變。檢測儀器與檢測樣本的不同，洛倫茲線型并不能還原芬太尼類標準品的拉曼特征，幾乎無法對模型進行求解。但高斯線型與勞倫茲線型特點相結(jié)合的Voigt線型對譜峰進行分解，其對尿液中芬太尼類物質(zhì)特征有較為準確的解析，它能夠扣除尿液背景峰，還原芬太尼類物質(zhì)拉曼特征峰。三種函數(shù)線型如圖2所示。

圖2 Voigt線型、洛倫茲線型和高斯線型三種函數(shù)線型的對比

由圖2可以看出這三種線型的半峰寬、峰高與峰位一致時，差距主要在譜線下半部分。譜線的半峰寬主要分為均勻半峰寬、非均勻半峰寬和綜合半峰寬這三大類。洛倫茲線型屬于均勻半峰寬的譜線輪廓，是理論中符合拉曼光譜特征的線型。高斯線型是多普勒頻移效應(yīng)導(dǎo)致的非線性半峰寬，是大部分譜峰解析時使用的線型。Voigt線型則是典型的綜合半峰寬，其譜線展寬并不是單一存在而是多種的疊加，但高斯線型與洛倫茲線型是單一譜線半峰寬的線型。然而在實驗中導(dǎo)致譜線展寬的因素并不唯一，所以選擇Voigt線型設(shè)計譜峰解析模型。洛倫茲線型在此解析方法中無法得出結(jié)果，圖3僅展示高斯線型與Voigt線型的解析結(jié)果對比圖。

通過圖3可以看出使用高斯線型與Voigt線型對尿液中奧芬太尼SERS光譜同一片段進行譜峰解析時，雖然兩者擬合光譜與原始光譜相似度均超過0.99，但是在上圖中也能明顯看出Voigt線型的擬合效果明顯優(yōu)于高斯線型的擬合效果，高斯線型擬合結(jié)果明顯出現(xiàn)峰位的偏移。且在解析峰集合中高斯線型解析結(jié)果中也并不含有奧芬太尼特征的解析峰，而Voigt線型解析峰中包含奧芬太尼特征的解析峰。這為尿液基質(zhì)背景峰的扣除以及芬太尼類特征峰的還原提供了基礎(chǔ)條件。

圖3 高斯線型與Voigt線型的解析結(jié)果對比圖

3.2 尿液背景峰扣除及芬太尼類光譜還原

尿液背景峰與芬太尼類拉曼特征峰在1 000與1 030 cm-1幾乎完全重合。而在芬太尼類SERS光譜中特征峰也在1 000與1 030 cm-1處，由此對尿液中芬太尼類混合SERS光譜高度重合部分935～1 100 cm-1進行譜峰解析。解析結(jié)果大致如圖4所示。

圖4 譜峰解析結(jié)果

由圖4可知，在進行譜峰分解后得出的是一個Voigt峰的集合。集合中包含芬太尼類物質(zhì)拉曼峰和尿液背景峰。根據(jù)拉曼峰特征對Voigt峰的集合進行篩選，提取其中芬太尼類SERS光譜，扣除尿液背景峰。通過分析尿液與芬太尼類標準品SERS光譜1 000與1 030 cm-1兩處拉曼特征峰進行分析，發(fā)現(xiàn)其在半峰寬處有較大的差異。根據(jù)這一特點設(shè)置條件，對Voigt峰的集合進行篩選。

首先計算原始光譜1 000與1 030 cm-1處半峰寬x1與x2，將集合Ω中解析峰半峰寬xΩ與其進行對比，若解析峰半峰寬xΩ在x2與x1之間，則該分解峰計入芬太尼類SERS光譜分解峰中，反之則為尿液背景峰。最后對芬太尼類還原光譜進行擬合，作為扣除尿液背景后還原的芬太尼類光譜。其還原效果如圖5所示。

根據(jù)圖5可以看出，尿液中芬太尼類SERS光譜還原效果較好。還原后的芬太尼類光譜與標準品SERS光譜相似度均在95%以上，且1 000與1 030 cm-1兩處光譜的半峰寬與峰比例幾乎一致，符合芬太尼類SERS光譜特征。因此，可利用還原后芬太尼類SERS光譜進行光譜類別判斷。

圖5 尿液中芬太尼類SERS光譜還原效果

3.3 芬太尼類光譜自動識別

由于尿液背景中與芬太尼類強信號峰1 000與1 030 cm-1高度重合，直接對兩種物質(zhì)進行建庫與識別時，僅依靠峰位的識別方法已經(jīng)無法進行區(qū)分。而使用相似度識別方法也并沒有較大的差距，光譜之間的相似度均達到99%以上。對于儀器分辨率不高的手持式拉曼而言幾乎無法進行區(qū)分。同樣，與芬太尼類標準品SERS光譜進行匹配時，其也幾乎無法準確識別。尿液中芬太尼類SERS光譜匹配情況如圖6所示。

圖6 尿液中芬太尼類SERS光譜匹配情況

根據(jù)圖6可知，尿液中芬太尼類SERS光譜的識別效果并不理想。對光譜強信息片段進行譜峰分解并還原的光譜進行種類識別發(fā)現(xiàn)，其識別效果有一定程度上的提高。雖然仍然無法通過峰位的方法進行識別與區(qū)分，但是由于其高度還原了芬太尼類SERS光譜的特征峰特征，包括半峰寬、峰高以及峰比例。因此可以利用芬太尼類標準品SERS光譜進行建庫，再利用相似系數(shù)作為判斷依據(jù)進行識別。

尿液中芬太尼類SERS光譜識別步驟如下所示。首先使用芬太尼類標準品SERS光譜數(shù)據(jù)進行建庫，并對其進行平滑去噪處理；接著對待識別光譜進行譜峰解析并扣除尿液背景還原SERS光譜特征；然后進行相似系數(shù)計算；最后得出對應(yīng)芬太尼類別。

根據(jù)圖7可知，相比未進行還原的尿液中芬太尼類SERS光譜而言，其識別效果有一定程度的改善。且具有一定的區(qū)分度，在一定程度上可以減少分辨率較低的手持式拉曼檢測儀數(shù)據(jù)識別的問題。在對數(shù)據(jù)分解還原的過程中，對于純尿液光譜數(shù)據(jù)而言，還原光譜仍然保留純尿液光譜特征，分解峰集合中。這表明所建立的數(shù)學(xué)模型適合進行尿液中某些物質(zhì)的SERS光譜識別與分析。

圖7 還原光譜識別效果

3.4 分離與識別原因分析

針對上述中純尿液與尿液中芬太尼類SERS光譜進行譜峰分解時產(chǎn)生的不同情況進行分析，在純尿液進行1 000與1 030 cm-1處進行譜峰分析時，其并不會分解出含有芬太尼類的譜峰。而尿液中含有芬太尼類物質(zhì)時，則可利用譜峰解析出含芬太尼類光譜的特征峰，并根據(jù)還原光譜對芬太尼種類進行有效區(qū)分。針對此種情況將從以下兩個方面進行探究：一是混合光譜，二是分子振動。

在進行尿液中芬太尼類SERS光譜分析時，發(fā)現(xiàn)尿液中不同種類的芬太尼其特征峰1 000與1 030 cm-1的半峰寬與峰高之間具有一定差距。芬太尼類標準品SERS光譜的半峰寬和峰高與純尿液本身具有較大的差距。尿液中的芬太尼類SERS光譜在半峰寬與峰高間也存在著較大的差異。純尿液拉曼特征峰與芬太尼類拉曼特征峰的差異如圖8所示。

圖8 尿液與芬太尼類拉曼特征峰及其振動模式

由圖8可知，純尿液SERS光譜在1 000 cm-1處特征峰半峰寬較寬，而芬太尼類在此處半峰寬都較窄。且純尿液與芬太尼類SERS光譜1 000與1 030 cm-1之間的峰高比例也不同。而尿液與芬太尼類物質(zhì)不會發(fā)生新的化學(xué)反應(yīng)，所以當兩種物質(zhì)混合在一起時光譜也會具有半峰寬與峰高上的特征。而譜峰分解模型中半峰寬與峰強對解析結(jié)果有影響，所以采用此方法可以還原芬太尼類拉曼特征峰，扣除尿液背景干擾。芬太尼類SERS光譜特征峰半峰寬與峰高不同的原因是分子振動模式與振動頻率的不同。圖8中包含三種芬太尼1 000與1 030 cm-1處的分子振動模式。ν為伸縮振動，δ為面內(nèi)變形振動。

4 結(jié) 論

利用Voigt線型建立譜峰解析模型，并結(jié)合Nelder-Mead算法進行迭代分析，計算出最優(yōu)分解峰集合。針對SERS光譜具有噪聲與熒光背景等問題，使用對初始值不敏感的無約束非線性優(yōu)化算法對模型進行解析，避免出現(xiàn)過擬合與解不出的問題。針對由于尿液中尿素等物質(zhì)背景峰與芬太尼類SERS特征峰高度類似而產(chǎn)生的光譜疊加問題，對尿液中芬太尼類拉曼光譜935～1 100 cm-1光譜片段進行譜峰解析，以還原芬太尼類拉曼光譜1 000與1 030 cm-1處拉曼譜峰特征，與芬太尼類標準品拉曼光譜相似度均超過95%。根據(jù)芬太尼類拉曼光譜特征峰半峰寬特點，設(shè)計尿液背景扣除與芬太尼類拉曼特征峰還原條件，對最優(yōu)分解峰集合中Voigt峰進行篩選與濾除，最終將符合條件的譜峰擬合作為芬太尼類還原光譜。利用相似系數(shù)HQI進行物質(zhì)判別依據(jù)，實現(xiàn)了尿液中芬太尼類拉曼光譜識別，提高了識別的準確度。此解析體系也可對尿液中或者毛發(fā)中冰毒的強信號峰1 000與1 030 cm-1的扣除與還原具有一定的效果，有望為復(fù)雜基質(zhì)中目標毒物的識別與判斷提供解決實際問題的途徑。