陳紅躍 楊萌萌 栗粟 武紅園 婁永慶

(1河南省中醫(yī)院甲狀腺乳腺科，河南 鄭州 450002；2河南中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院)

近十年來甲狀腺腫瘤正在以每3.6%年的增長(zhǎng)趨勢(shì)快速發(fā)展〔1〕，已躍居全球惡性腫瘤的前十位癌譜，占癌癥總發(fā)病數(shù)的1%以上〔2〕，其中甲狀腺乳頭狀癌(PTC)占比較大。PTC由于濾泡上皮高度分化，病理學(xué)常表現(xiàn)為多灶性，長(zhǎng)期以來甲狀腺切除術(shù)是主流療法，同時(shí)術(shù)后輔助TSH抑制和I131清甲治療，規(guī)范化診療可以使大部分患者的5年生存率提高到97%〔3〕。但面臨了手術(shù)造成永久性喉返神經(jīng)和甲狀旁腺功能損傷，左旋甲狀腺素易誘發(fā)絕經(jīng)婦女骨質(zhì)疏松，放射性碘可波及唾液腺〔4～7〕等，因此探索更有效防治PTC的藥物成了當(dāng)下的研究熱點(diǎn)。中藥夏枯草用以防治甲狀腺疾病已有千年之久，始記于《神農(nóng)本草經(jīng)》“主寒熱瘰疬，散癭結(jié)氣”〔8〕?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究〔9〕發(fā)現(xiàn)夏枯草的主要成分咖啡酸、迷迭香酸及三萜類組分發(fā)揮抗腫瘤作用，但對(duì)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞系B-CPAP的相關(guān)研究較少，作用機(jī)制尚不明確。故本課題選用B-CPAP細(xì)胞，利用多種分子生物學(xué)技術(shù)，觀察中藥夏枯草對(duì)其惡性生物學(xué)行為的影響，以期為臨床治療甲狀腺癌提供新的思路。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株 人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞株 B-CPAP，購于上海賽百慷生物技術(shù)股份有限公司；

1.1.2實(shí)驗(yàn)藥物 夏枯草顆粒(編號(hào)：B14000020441，國(guó)藥準(zhǔn)字：Z20050519，規(guī)格：2 g×8袋)產(chǎn)自江蘇晨牌藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司；

1.1.3實(shí)驗(yàn)主要試劑與設(shè)備 胎牛血清、RPMI1640、磷酸鹽緩沖液(PBS)、0.25%胰蛋白酶(Biological Industries)；青鏈霉素雙抗混合液、二甲基亞砜(DMSO)、高效RIPA裂解液、ECL超敏化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒、膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(北京索萊寶)；CCK-8試劑盒(上海同仁化學(xué)科技)；苯甲基磺酰氟(PMSF)蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑(武漢博士德)；聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天生物技術(shù))；蛋白電泳凝膠制備試劑盒(西安晶彩生物技術(shù))；Transwell細(xì)胞共培養(yǎng)小室(美國(guó)Corning公司)；超凈工作臺(tái)(JB-CJ-2FC型)；柜式恒溫培養(yǎng)箱(HZ150L型)；日立超速離心機(jī)(日本HITACHI型)；全波長(zhǎng)掃描式多功能讀數(shù)儀(芬蘭Thermo Fisher型)；超速低溫離心機(jī)(美國(guó)SIGMA3-K型)；蛋白凝膠成像系統(tǒng)(XBCX-S-044型)等。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人甲狀腺乳頭狀癌B-CPAP細(xì)胞，培養(yǎng)于含10%熱滅活胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2及飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2夏枯草溶液的制備 1 g夏枯草顆粒充分溶解于20 ml RPMI1640完全培養(yǎng)液中，震蕩混勻，超聲處理30 min，超速離心機(jī)1200 r/min，離心10 min，粗過濾去除沉渣雜質(zhì)，0.22 mm超微過濾器正壓抽濾除菌，制得原濃度為40 mg/ml的生藥，4℃分裝保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3CCK8測(cè)定細(xì)胞存活率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期B-CPAP單細(xì)胞懸液，按6 000個(gè)/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，夏枯草生藥用2%血清濃度的RPMI1640培養(yǎng)液以10倍比稀釋，調(diào)整實(shí)驗(yàn)組濃度梯度為0.50、0.75、1.00、1.50、2.00 mg/ml，空白組為不含藥的2%血清濃度培養(yǎng)液，各組同時(shí)設(shè)置6個(gè)平行孔。24 h后每孔加入CCK8試劑10 μl，37℃溫箱繼續(xù)孵育4 h。自動(dòng)酶標(biāo)讀數(shù)儀調(diào)整參數(shù)，選擇波長(zhǎng)為450 nm處的測(cè)量OD值。記錄數(shù)據(jù)，并繪制生長(zhǎng)曲線。細(xì)胞存活率=(空白組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/空白組OD值×100%，

1.2.4流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡比例 B-CPAP接種于6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h，加入濃度為0.0、0.5、1.0、1.5 mg/ml的夏枯草溶液。PBS潤(rùn)洗1～2遍，胰酶消化離心，4℃預(yù)冷的PBS 重懸細(xì)胞一次，加入Annexin V-FITC 5 μl，輕輕混勻細(xì)胞，37℃避光孵育15～20 min，上機(jī)前5 min加入PI染色劑5 μl，通過四象限圖來分析各組細(xì)胞所處狀態(tài)分布。

1.2.5劃痕修復(fù)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲性 用marker筆在6孔板底畫好6條等距細(xì)線作為參考，B-CPAP細(xì)胞后接種于6孔板中，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞鋪滿整個(gè)孔時(shí)，用無菌20 μl槍頭在6孔板內(nèi)劃出“一”形劃痕，吸出培養(yǎng)基，PBS清洗2～3遍，加入濃度梯度為0.0、0.5、1.0、1.5 mg/ml的夏枯草稀釋液，置于ZOOM培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，設(shè)定程序?yàn)槊? h拍照1次，ImageJ軟件測(cè)量劃痕愈合率。

1.2.6Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞的遷移力 B-CPAP細(xì)胞預(yù)先撤去血清進(jìn)行饑餓，常規(guī)胰酶消化離心，用不含血清的RPMI1640培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸，以每孔100 μl的體積接種于24孔板小室上層，下層小室加入濃度分別為：0.0、0.5、1.0、1.5 mg/ml夏枯草溶液500 μl，培養(yǎng)箱孵育24 h后棄去小室內(nèi)培養(yǎng)基，無菌鹽水沖洗，4%組織細(xì)胞固定液固定小室中的細(xì)胞15～30 min，0.1%結(jié)晶紫染色，棉簽輕輕擦去上層未遷移的細(xì)胞，用倒置顯微鏡顯微以×400倍數(shù)計(jì)數(shù)，每個(gè)視圖分析3個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)透過底層聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)目。

1.2.7Western印跡檢測(cè)B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3、整合素連接激酶(ILK)、磷酸化(p)-細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)/ERK蛋白的表達(dá) 常規(guī)消化接種細(xì)胞，6孔細(xì)胞培養(yǎng)板分別加入濃度為0.0、0.5、1.0、1.5 mg/ml的夏枯草溶液，24 h后加入胰酶回收細(xì)胞，RIPA裂解液裂解細(xì)胞，超低溫離心兩遍留取上清液。BCA蛋白定量試劑盒測(cè)量各組樣品的蛋白濃度并計(jì)算上樣體積，按比例加入5×上樣緩沖液，煮沸變性。上樣后行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，120 V，90 min，電泳后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜，240 mA，1.5 h。脫脂牛奶常溫下封閉2 h，一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜5遍，二抗孵育1h，洗膜5遍，增強(qiáng)型免疫熒光發(fā)光試劑(ECL PLUS)化學(xué)發(fā)光，Image Lab軟件定量測(cè)定灰度值，取3次測(cè)定結(jié)果平均值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、秩和檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1夏枯草抑制B-CPAP細(xì)胞增殖的作用 光鏡下觀察到空白組細(xì)胞生長(zhǎng)良好，實(shí)驗(yàn)組加入夏枯草作用24 h后細(xì)胞逐漸變?yōu)閳A形或不規(guī)則形，折光性變差，細(xì)胞活性降低。0.00、0.50、0.75、1.00、1.50、2.00 mg/ml組，細(xì)胞存活率分別為(100.00±0.00)%、(82.71 ± 1.30)%、(76.84 ± 0.92)%、(41.71 ± 0.77)%、(21.29 ± 0.25)%、(19.20 ± 0.23)%。實(shí)驗(yàn)組B-CPAP細(xì)胞存活率明顯降低，與空白組相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，隨著藥物劑量的增加細(xì)胞存活率顯著下降(P<0.001)，計(jì)算夏枯草的半量抑制濃度(IC50)約為0.94 mg/ml。

2.2夏枯草誘導(dǎo)B-CPAP細(xì)胞凋亡的作用 流式結(jié)果(圖1)顯示夏枯草濃度越高Q1區(qū)死亡細(xì)胞數(shù)目越多，Q4區(qū)活細(xì)胞數(shù)目越少，且細(xì)胞總凋亡率(Q2+Q3)也隨藥物濃度增加而遞增，0.5、1.0、1.5 mg/ml組細(xì)胞凋亡率顯著高于0.0 mg/ml組(P<0.05)。見表1。中低濃度夏枯草主要將B-CPAP細(xì)胞生長(zhǎng)抑制在晚凋亡期，而較高濃度夏枯草在早凋亡期發(fā)揮促凋亡作用。

圖1 夏枯草對(duì)B-CPAP細(xì)胞凋亡的影響

2.3夏枯草抑制B-CPAP細(xì)胞遷移力的作用 隨著加入夏枯草濃度的增高，0.0 mg/ml組透膜的細(xì)胞數(shù)量最多，0.5 mg/ml組比0.0 mg/ml組稍有減少，1.0 mg/ml組透膜的細(xì)胞數(shù)量減少了一半，而1.5 mg/ml夏枯草近乎完全抑制了細(xì)胞的透膜遷移進(jìn)程，未見染色細(xì)胞。見圖2。各加藥組的透膜細(xì)胞數(shù)量均低于0.0 mg/ml組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見表1。

圖2 夏枯草對(duì)B-CPAP細(xì)胞遷移能力的影響(結(jié)晶紫染色，×200)

表1 夏枯草對(duì)B-CPAP細(xì)胞凋亡、遷移能力及Bax、Bcl-2、Caspase-3、ILK及p-ERK/ERK蛋白表達(dá)的影響

2.4夏枯草抑制B-CPAP細(xì)胞侵襲性的作用 ZOOM顯微鏡捕捉到劃痕逐步愈合的過程(圖3)，夏枯草分別作用12、24 h后，0.0 mg/ml組劃痕區(qū)域基本長(zhǎng)滿細(xì)胞，加入夏枯草濃度越高，作用時(shí)間越長(zhǎng)，劃痕分界越明顯。相同時(shí)間點(diǎn)0.5、1.0、1.5 mg/ml組與0.0 mg/ml組的劃痕愈合率比較差異明顯；且12 h與24 h的劃痕愈合率對(duì)比的結(jié)果差異更加明顯(P<0.05)。見表2。說明夏枯草能夠削減B-CPAP細(xì)胞劃痕傷口的愈合進(jìn)程，抑制侵襲的作用有著劑量和時(shí)間依賴性。

圖3 ZOOM顯微鏡下夏枯草對(duì)B-CPAP細(xì)胞劃痕愈合率的影響(×100)

表2 夏枯草對(duì)B-CPAP細(xì)胞劃痕愈合率的影響

2.5夏枯草對(duì)B-CPAP細(xì)胞Bax、Bcl-2、Caspase3、ILK、p-ERK/ERK蛋白表達(dá)的影響 夏枯草下調(diào)了B-CPAP細(xì)胞的抗凋亡蛋白Bcl-2和侵襲蛋白ILK的表達(dá)水平，而凋亡蛋白BAX和Caspase-3的表達(dá)水平上調(diào)；同時(shí)降低了MAPK通路相關(guān)蛋白p-ERK/ERK磷酸化水平，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.001)。見表1、圖4。說明夏枯草能夠促進(jìn)B-CPAP細(xì)胞凋亡、抑制癌癥侵襲進(jìn)程，具體機(jī)制可能通過誘導(dǎo)凋亡蛋白家族表達(dá)，下調(diào)ILK蛋白與MAPK信號(hào)通路交聯(lián)以發(fā)揮抑癌作用。

圖4 不同濃度夏枯草對(duì)B-CPAP細(xì)胞Bax、Bcl-2、Caspase3、ILK及p-ERK/ERK蛋白磷酸化水平的影響

3 討 論

甲狀腺癌在中醫(yī)學(xué)隸屬“石癭”的范疇，病機(jī)為五臟瘀血、濁氣、痰滯〔10〕。中藥夏枯草能夠化痰散結(jié)、清熱解毒，已廣泛應(yīng)用于甲亢、亞急性甲狀腺炎及橋本甲狀腺炎等〔11,12〕疾病的治療當(dāng)中。夏枯草能夠通過辨證施治，實(shí)現(xiàn)減毒增效，有效抑制甲狀腺腫瘤的生長(zhǎng)，具有開發(fā)成為防治PTC藥物的潛力，其作用是多靶點(diǎn)、多層次、多種途徑的。Yin等〔13〕使用逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)證實(shí)夏枯草顯著增加高分化甲狀腺癌細(xì)胞系的Bcl-2和Caspase-3基因表達(dá)。蒙雯雯等〔14〕研究小劑量山慈姑與夏枯草聯(lián)合用藥對(duì)作用于SW579細(xì)胞的增殖抑制作用較單藥明顯，抗增殖作用由核蛋白類調(diào)控基因產(chǎn)物(c-myc)蛋白負(fù)向調(diào)控。張樂樂〔15〕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)卷曲螺旋蛋白CCDC67作為抑癌基因在甲狀癌中表達(dá)缺失，夏枯草提取物不僅能下調(diào)甲狀腺癌的CCDC67基因表達(dá)，還能夠增強(qiáng)細(xì)胞的自噬能力。熊燚等〔16,17〕實(shí)驗(yàn)觀察夏枯草對(duì)體外培養(yǎng)的不同病理類型人甲狀腺癌細(xì)胞的抗增殖作用，篩選得出PTC分型的敏感性明顯高于其他三型。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示夏枯草物作用于B-CPAP細(xì)胞的半數(shù)致死量IC50為0.94 mg/ml，以劑量和時(shí)間依賴性的方式有效抑制細(xì)胞增殖，促使凋亡細(xì)胞比率的增加，同時(shí)削弱癌癥的遷移能力及侵襲表型。

甲狀腺乳頭狀癌作為最常見的病理亞型，BRAF V600E基因突變?cè)趤喼奕巳旱臋z出率高達(dá)56%～82%〔18〕。BRAF基因可誘導(dǎo)蘇氨酸/絲氨酸發(fā)生磷酸?；x予MAPK通路強(qiáng)活性，內(nèi)在的線粒體途徑激活引起細(xì)胞色素c因子釋放，促細(xì)胞凋亡的Caspase家族被激活，其中起主要作用的是下游效應(yīng)子Caspase-3因子表達(dá)增強(qiáng)，Bcl-2家族與其銜接緊密共同發(fā)揮作用。Bcl-2扼制凋亡進(jìn)程的具體機(jī)制是與Bcl-2同源3結(jié)構(gòu)域蛋白共同作用誘發(fā)線粒體信號(hào)，而Bax蛋白能夠與之相對(duì)抗，快速啟動(dòng)凋亡的通路〔19〕。

PTC的侵襲進(jìn)程主要由ILK負(fù)責(zé)調(diào)控，ILK作為上皮細(xì)胞外基質(zhì)黏附的關(guān)鍵組成部分，調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮配體與表面受體結(jié)合，錨定-非依賴性細(xì)胞生長(zhǎng)增加，介導(dǎo)細(xì)胞的黏附功能，在腫瘤轉(zhuǎn)移進(jìn)程中扮演者重要的角色〔20〕。最適藥物濃度范圍內(nèi)夏枯草能夠下調(diào)B-CPAP細(xì)胞ILK蛋白表達(dá)，降低MAPK通路相關(guān)蛋白p-ERK/ERK的磷酸化水平，因此推測(cè)夏枯草能夠抑制甲狀腺乳頭狀癌BRAF基因突變誘發(fā)的MAPK通路磷酸化水平，與ILK交聯(lián)并下調(diào)其表達(dá)，共同削弱癌癥的轉(zhuǎn)移侵襲進(jìn)程。

夏枯草作為新型抗腫瘤中成藥，抑制甲狀腺乳頭狀癌惡性生物學(xué)行為的效果顯著，有望成為該病的潛在治療手段。在臨床手術(shù)切除原發(fā)癌灶后，可加服夏枯草制劑，實(shí)現(xiàn)減毒增效，延緩癌癥轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，有效改善預(yù)后。