王旭旭，孫曉琪，陳海琴，趙建新，陳衛(wèi)，唐鑫

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)

脂質(zhì)積累量超過(guò)其生物量20%的一類微生物被稱為產(chǎn)油微生物[1]。其中的產(chǎn)油絲狀真菌高山被孢霉具有生產(chǎn)高附加值脂肪酸的能力，可積累大量的多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid, PUFAs)，尤其是花生四烯酸(arachidonic acid, AA)，其AA含量可達(dá)總脂肪酸的40%。作為商業(yè)化生產(chǎn)AA的最主要來(lái)源，高山被孢霉現(xiàn)已被認(rèn)定為是PUFAs生產(chǎn)中的重要工業(yè)化菌株[2]，因而受到業(yè)界的廣泛關(guān)注。PUFAs合成的兩大關(guān)鍵因素是乙酰輔酶A和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH)[3]。NADPH的供應(yīng)在產(chǎn)油微生物中引起了極大的研究興趣。特別是RATLEDGE[4]通過(guò)化學(xué)計(jì)量學(xué)評(píng)價(jià)了產(chǎn)油微生物中蘋(píng)果酸酶(malic enzyme, ME)和磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway, PPP)對(duì)NADPH的貢獻(xiàn)，結(jié)果得出在某些產(chǎn)油微生物中以上2種途徑產(chǎn)生的NADPH不能夠滿足產(chǎn)脂所需，并認(rèn)為NADP+依賴型異檸檬酸脫氫酶(NADP-isocitrate dehydrogenase, NADP-IDH)可能是潛在的NADPH供應(yīng)者。

IDH負(fù)責(zé)催化異檸檬酸氧化脫羧生成α-酮戊二酸(α-ketoglutaric acid, α-KG)和CO2，還原NAD(P)+為NAD(P)H[5]。根據(jù)輔酶依賴性不同可以將IDHs分為NAD-IDHs(EC 1.1.1.41)和NADP-IDHs(EC1.1.1.42)兩種類型，前者在三羧酸循環(huán)中催化第1個(gè)氧化脫羧反應(yīng)，因此在控制糖、脂質(zhì)和氨基酸代謝中發(fā)揮重要的作用，后者通過(guò)合成NADPH以及α-KG，參與抗氧化反應(yīng)，維持胞內(nèi)異檸檬酸和α-KG平衡[6-7]。二者在自然界生物中廣泛分布，但不同來(lái)源的IDH在功能方面存在一定的差異。

產(chǎn)油微生物中的IDH在脂肪酸合成中扮演著重要的角色。WYNN等[8]在探究芝麻酚抑制卷枝毛霉脂肪酸合成機(jī)制時(shí)，發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)NADP-IDH活性在芝麻酚作用后下降57%，NADPH的合成減少影響脂質(zhì)的積累。產(chǎn)油微生物中主要的NADPH供應(yīng)者PPP和ME的功能已得到充分的研究，本課題組研究發(fā)現(xiàn)高山被孢霉胞質(zhì)中NADP+依頓型的IDH4(Mortierellaalpinaisocitrate dehydrogenase4, MaIDH4)的過(guò)量表達(dá)可以促進(jìn)脂質(zhì)的積累[9-12]。但MaIDH4的性質(zhì)還未得到充分的研究，因此獲得高活性高產(chǎn)量的純酶具有重要的意義。

大腸桿菌(Escherichiacoli)和畢赤酵母都是優(yōu)良的表達(dá)宿主，前者具有培養(yǎng)簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)快速、遺傳背景清晰等特點(diǎn)[13-14]，后者具備真核生物共有的胞內(nèi)環(huán)境和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，利于真核來(lái)源蛋白活性結(jié)構(gòu)的組裝[15]。基于實(shí)驗(yàn)室前期的研究結(jié)果，本文選擇對(duì)高山被孢霉脂質(zhì)積累影響較為明顯的MaIDH4進(jìn)行異源表達(dá)，并利用鎳柱分離純化目的蛋白，比較大腸桿菌和畢赤酵母兩個(gè)宿主中純酶比活力和酶產(chǎn)量的差異，為深入研究MaIDH4的酶學(xué)性質(zhì)及生產(chǎn)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

宿主E.coliTop10、E.coliBL21(DE3)和PichiaPinkTMStrain 2菌株以及表達(dá)載體pET28a(+)和pPink-HC均購(gòu)自Invitrogen公司，攜帶10×His標(biāo)簽的pPink-HC-3CZHEK是基于pPink-HC改造獲得，現(xiàn)保存于江南大學(xué)食品生物技術(shù)中心。

KOD酶，東洋紡(上海)生物科技有限公司；DNA限制性內(nèi)切酶，Thermo Fisher公司；DNA-T4連接酶，日本TaKaRa公司；DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒，天根生化科技有限公司；DL-異檸檬酸三鈉鹽水合物，麥克林(中國(guó)上海)；NADP氧化型輔酶Ⅱ，上海生工(中國(guó)上海)；咪唑，國(guó)藥滬式(中國(guó)上海)；用于大腸桿菌和畢赤酵母培養(yǎng)的LB培養(yǎng)基、畢赤酵母腺嘌呤缺陷培養(yǎng)基(pichia adenine dropout, PAD)、緩沖甘油復(fù)合培養(yǎng)基(buffered glycerol-complex medium, BMGY)、緩沖甲醇復(fù)合培養(yǎng)基(buffered methanol-complex medium, BMMY)、酵母提取物蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基(yeast extract peptone dextrose medium, YPD)的配方，Thermo Fisher Scientific；引物的合成和基因測(cè)序由華大基因完成。

1.2 儀器與設(shè)備

HR30-IIA2生物安全柜，青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司；UV-2450島津分光光度計(jì)，日本島津公司；GRP-9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；ZQZY-VAF振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司；Tanon化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)，上海天能科技有限公司；DYY-7C電泳儀電源，北京六一生物科技有限公司；SX-300高壓蒸汽滅菌鍋，日本Tomy Seiko有限公司；電轉(zhuǎn)化儀，Eppendorf公司；17524701 HisTrapTMHP Ni柱，思拓凡公司；Sorvall ST40R臺(tái)式冷凍離心機(jī)，美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

1.3 重組菌的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)

1.3.1 重組大腸桿菌的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)

使用MaIDH4特異性引物(表1)和KOD高保真酶擴(kuò)增高山被孢霉ATCC32222[12]中的目的片段，PCR產(chǎn)物通過(guò)核酸電泳進(jìn)行驗(yàn)證。采用限制性核酸內(nèi)切酶(NdeⅠ和EcoR Ⅰ)對(duì)目的基因和載體pET28a(+)進(jìn)行雙酶切處理，酶切產(chǎn)物經(jīng)DNA-T4連接酶處理構(gòu)建重組質(zhì)粒。通過(guò)化學(xué)轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒[pET28a(+)-MaIDH4]和空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，使用pET28a(+)通用引物(T7引物)對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證，并送至公司測(cè)序，測(cè)序正確的轉(zhuǎn)化子用于后續(xù)試驗(yàn)。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

將重組菌E.coliBL21(DE3)-pET28a(+)-MaIDH4接種于含有Kana的LB培養(yǎng)基中，在37 ℃，200 r/min的條件下培養(yǎng)12 h。隨后按1%(體積分?jǐn)?shù))接種量接種于相同的新鮮LB培養(yǎng)基，使用以上培養(yǎng)條件進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)菌體密度OD600值達(dá)到0.6時(shí)向培養(yǎng)基中加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside, IPTG)(終濃度為0.4 mmol/L)，于20 ℃，200 r/min培養(yǎng)16 h以誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，之后于3 000×g離心5 min收集菌體，并保存于-80 ℃冰箱用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

使用細(xì)胞破碎緩沖液[50 mmol/L磷酸二氫鈉，pH 7.4；1 mmol/L苯甲基磺酰氟；5%(體積分?jǐn)?shù))甘油]回溶菌體，充分混勻后加入玻璃珠，漩渦振蕩30 s，冰上靜置30 s，重復(fù)此破碎步驟8～10次獲得全細(xì)胞破碎液。將全細(xì)胞破碎液于4 ℃，8 000×g條件下離心10 min收集上清液，上清液即為粗酶液。向樣品中加入Loading buffer，95 ℃金屬浴變性10 min，進(jìn)行SDS-PAGE和Western-Blot分析。

1.3.2 重組畢赤酵母的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)

采用StuⅠ和EcoR Ⅰ依次消化目的基因和表達(dá)載體pPink-HC-3CZHEK，對(duì)消化產(chǎn)物進(jìn)行核酸電泳驗(yàn)證，通過(guò)DNA-T4連接酶將二者連接構(gòu)建重組質(zhì)粒，采用化學(xué)轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coliTop10感受態(tài)細(xì)胞，挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證，并送至公司測(cè)序。提取空載質(zhì)粒和陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子中的重組質(zhì)粒，使用XagⅠ限制性核酸內(nèi)切酶將其進(jìn)行線性化，對(duì)線性化前后的產(chǎn)物進(jìn)行核酸電泳驗(yàn)證。將線性化的重組載體和空載質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化入PichiaPinkTMStrain 2感受態(tài)細(xì)胞，提取白色轉(zhuǎn)化子的基因組，使用pPink-HC-3CZHEK通用引物(AOX、CYC)進(jìn)行PCR驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子用于后續(xù)試驗(yàn)。

挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子接入PAD液體培養(yǎng)基，在28 ℃，200 r/min條件下培養(yǎng)24 h。隨后以1%的接種量接種于BMGY培養(yǎng)基，于28 ℃，200 r/min條件下擴(kuò)大培養(yǎng)36 h。將菌液在4 ℃，1 500×g下離心5 min以去除BMGY培養(yǎng)基，使用BMMY培養(yǎng)基重懸菌體，在28 ℃，200 r/min條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h。之后于3 000×g離心5 min收集菌體，并保存于-80 ℃冰箱用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。重組畢赤酵母細(xì)胞破碎方法以及SDS-PAGE和Western-Blot樣品制備方法同1.3.1中所述。

1.4 重組蛋白的純化

1.4.1 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中目的蛋白的純化

使用HisTrapTMHP Ni柱純化目的蛋白，所有純化操作均在4 ℃下完成。粗酶液經(jīng)0.22 μm的水系濾膜過(guò)濾后用于后續(xù)親和純化。首先使用結(jié)合緩沖液(20 mmol/L磷酸鈉緩沖液，500 mmol/L NaCl，pH 7.4)進(jìn)行柱平衡，然后將過(guò)濾后的粗酶液加載到Ni柱中，結(jié)合緩沖液過(guò)柱去除非特異性結(jié)合的雜蛋白，后面依次通過(guò)含有100、200、350 mmol/L咪唑的洗脫液(20 mmol/L磷酸鈉緩沖液，500 mmol/L NaCl,不同濃度的咪唑，5%甘油，pH 7.4)，收集所有的過(guò)柱流出組分。通過(guò)透析去除純化產(chǎn)物中的高濃度鹽離子并置換緩沖體系，透析液(50 mmol/L Tris-HCl，5%甘油)更換3次依次透析2、4、12 h。對(duì)純化過(guò)程中的每個(gè)流出組分進(jìn)行SDS-PAGE分析，確定產(chǎn)物的純度，并對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行驗(yàn)證。制備丙烯酰胺質(zhì)量濃度分別為50 g/L和100 g/L的濃縮膠和分離膠用于電泳分析。使用BCA試劑盒對(duì)蛋白濃度進(jìn)行定量。

1.4.2 畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中目的蛋白的純化

畢赤酵母的純化方法同大腸桿菌，純化過(guò)程所使用的細(xì)胞破碎液和結(jié)合緩沖液中需添加100 mmol/L咪唑。

1.5 酶活性分析

酶活力測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[16]，并略有改動(dòng)。反應(yīng)體系包含Tris-HCl(82.2 mmol/L，pH 8.0)、MnCl2/MgCl2(3 mmol/L)、NADP氧化型輔酶Ⅱ(0.6 mmol/L)、DL-異檸檬酸三鈉鹽水合物(5 mmol/L)，混合以上物質(zhì)于30 ℃孵育2 min，添加酶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，然后在島津UV-2450 UV-VIS分光光度計(jì)340 nm處監(jiān)測(cè)NADPH的生成。酶活力單位定義為每分鐘生成1 μmol的NADPH所需要的酶量。所有數(shù)據(jù)來(lái)自3個(gè)平行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組大腸桿菌的構(gòu)建和目的蛋白的鑒定

以高山被孢霉cDNA為模板使用特異性引物擴(kuò)增目的片段，PCR產(chǎn)物的核酸電泳結(jié)果如圖1-a所示，泳道1的1 000～1 200 bp附近處出現(xiàn)明顯的條帶，這與MaIDH4基因的理論大小(1 233 bp)一致，表明成功擴(kuò)增目的基因片段。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)化子，利用載體的通用引物對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證，結(jié)果如圖1-b所示，條帶出現(xiàn)在1 500 bp附近，這與理論值(1 510 bp)接近(PCR結(jié)果等于目的基因減去終止密碼子后的1 230 bp 加上含有6×His標(biāo)簽的載體片段280 bp，因此PCR的條帶大小與目的基因的條帶大小一致)，轉(zhuǎn)化子經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確，表明重組菌株E.coliBL21-pET28a(+)-MaIDH4構(gòu)建成功。

M-Marker a-MaIDH4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(1-目的基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物)； b-重組菌轉(zhuǎn)化子PCR驗(yàn)證結(jié)果[1-重組菌BL21-pET28a(+)- MaIDH4轉(zhuǎn)化子；2-陰性對(duì)照菌BL21-pET28a(+)轉(zhuǎn)化子]圖1 目的基因擴(kuò)增及重組大腸桿菌轉(zhuǎn)化子鑒定結(jié)果Fig.1 Amplification of target gene and identification of recombinant E.coli transformants

重組菌在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)目的蛋白。SDS-PAGE和Western-Blot結(jié)果如圖2所示，條帶出現(xiàn)在40～55 kDa附近，這與理論值46 kDa相一致，表明MaIDH4在E.coliBL21(DE3)中成功表達(dá)。

M-Marker；1-陰性對(duì)照菌E.coli BL21-pET28a(+) 細(xì)胞破碎液；2-重組菌E.coli BL21-pET28a(+)-MaIDH4 細(xì)胞破碎液 a-SDS-PAGE結(jié)果；b-Western-Blot結(jié)果圖2 目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果Fig.2 The results of target protein induction expression

2.2 重組畢赤酵母的構(gòu)建和目的蛋白的鑒定

將擴(kuò)增獲得的目的基因和載體pPink-HC-3CZHEK進(jìn)行雙酶切處理，酶切結(jié)果如圖3-a和圖3-b所示，酶切產(chǎn)物條帶大小與預(yù)期值相符(1 233、8 156 bp)表明雙酶切成功。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliTop 10獲得轉(zhuǎn)化子，利用載體的通用引物對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證，結(jié)果如圖3-c所示，條帶位于2 000 bp左右這與理論值1 929 bp相接近(PCR結(jié)果等于目的基因減去終止密碼子后的1 230 bp加上含有10×His標(biāo)簽和HRV 3C蛋白酶A的載體片段699 bp，因此PCR的條帶大小與目的基因的條帶大小一致)，轉(zhuǎn)化子經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確，表明重組菌株E.coliTop10-pPink-HC-3CZHEK-MaIDH4構(gòu)建成功。

M-Marker a-Stu Ⅰ酶切結(jié)果(1-目的基因經(jīng)Stu Ⅰ酶切前;2-目的基因經(jīng)Stu Ⅰ酶切后;3-載體經(jīng)Stu Ⅰ酶切前;4-載體經(jīng)Stu Ⅰ酶切后)；b-EcoR Ⅰ 酶切結(jié)果(1-目的基因經(jīng)EcoR Ⅰ酶切前;2-目的基因經(jīng)EcoRⅠ酶切后;3-載體經(jīng)EcoR Ⅰ酶切前;4-載體經(jīng)EcoR Ⅰ酶切后)；c-轉(zhuǎn)化子PCR 驗(yàn)證結(jié)果(1-空白反應(yīng)體系;2-E.coli Top10-pPink-HC-3CZHEK轉(zhuǎn)化子;3～5-E. coli Top10-pPink-HC-3CZHEK-MaIDH4轉(zhuǎn)化子)圖3 酶切及轉(zhuǎn)化子鑒定結(jié)果Fig.3 The results of enzyme digestion and transformants identification

空載質(zhì)粒和重組質(zhì)粒經(jīng)XagⅠ線性化的核酸電泳結(jié)果如圖4-a所示，條帶在8 000～10 000 bp時(shí)與理論值(8 179、9 394 bp)相符合。線性化產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化PichiaPinkTMStrain 2感受態(tài)細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)化子，利用載體的通用引物對(duì)轉(zhuǎn)化子的基因組進(jìn)行PCR，其結(jié)果如圖4-b所示，條帶在2 000 bp附近時(shí)與理論值(1 929 bp)一致，表明重組菌PichiaPinkTM-pPink-HC-3CZHEK-MaIDH4構(gòu)建成功。

M-Marker a-重組質(zhì)粒線性化結(jié)果(1-pPink-HC-3CZHEK經(jīng)Xag Ⅰ酶切前; 2-pPink-HC-3CZHEK經(jīng)Xag Ⅰ酶切后;3-pPink-HC-3CZHEK-MaIDH4 經(jīng)Xag Ⅰ酶切前;4-pPink-HC-3CZHEK-MaIDH4經(jīng)Xag Ⅰ酶切后；b-重組 菌轉(zhuǎn)化子基因組PCR驗(yàn)證結(jié)果(1-空白反應(yīng)體系;2-PichiaPinkTM- pPink-HC-3CZHEK轉(zhuǎn)化子;3～4-PichiaPinkTM-pPink-HC-3CZHEK- MaIDH4轉(zhuǎn)化子)圖4 線性化及轉(zhuǎn)化子鑒定結(jié)果Fig.4 The results of linearization and transformants identification

重組菌誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束，通過(guò)SDS-PAGE和Western-Blot對(duì)菌體樣本進(jìn)行分析，結(jié)果如圖5所示。Western-Blot結(jié)果顯示重組蛋白的條帶出現(xiàn)在55～72 kDa附近，這與理論分子質(zhì)量67 kDa接近，表明外源蛋白MaIDH4在PichiaPinkTMStrain 2中成功表達(dá)。由于二者使用的載體不同，大腸桿菌使用pET28a(+)，畢赤酵母使用pPink-HC-3CZHEK，除了目的基因外，大腸桿菌表達(dá)載體中包括6×His標(biāo)簽表達(dá)元件，畢赤酵母表達(dá)載體包括10×His標(biāo)簽和HRV 3C蛋白酶A表達(dá)元件，導(dǎo)致翻譯出來(lái)的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量存在差異。pPink-HC-3CZHEK是在高拷貝質(zhì)粒pPink-HC基礎(chǔ)上加入10×His標(biāo)簽，相比于pET28a(+)中的6×His標(biāo)簽更利于目的蛋白與Ni柱結(jié)合。另外，宿主細(xì)胞PichiaPinkTMStrain 2是在腺嘌呤缺陷型基礎(chǔ)上敲除了pep4基因，pep4的敲除可減少目的蛋白的水解，利用回補(bǔ)ADE2的pPink-HC質(zhì)粒和營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基來(lái)篩選轉(zhuǎn)化子，相對(duì)于抗生素篩選更加方便，另外在蛋白表達(dá)放大試驗(yàn)中能夠保持轉(zhuǎn)化子的穩(wěn)定性[17-18]。MaIDH4來(lái)源于真核生物高山被孢霉，這也是選擇真核表達(dá)系統(tǒng)畢赤酵母的一個(gè)重要原因。

2.3 不同表達(dá)系統(tǒng)對(duì)MaIDH4表達(dá)效果的影響

為探究MaIDH4在大腸桿菌和畢赤酵母兩個(gè)表達(dá)系統(tǒng)中的蛋白表達(dá)情況，采用SDS-PAGE檢測(cè)等質(zhì)量蛋白(15 μg)上樣的情況下，2個(gè)表達(dá)系統(tǒng)中目的蛋白的表達(dá)水平差異。由圖6可知，在總蛋白質(zhì)量一致的情況下，目的蛋白在大腸桿菌總蛋白中占比相對(duì)較高，主要因?yàn)榇竽c桿菌表達(dá)系統(tǒng)的總蛋白量較少，而畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中總蛋白量較多，因此，目的蛋白在畢赤酵母總蛋白中占比相對(duì)較小。

2.4 重組蛋白的純化與鑒定

2.4.1 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)目的蛋白的純化與鑒定

重組菌E.coliBL21-pET28a(+)-MaIDH4中目的蛋白的純化結(jié)果如圖7所示，在泳道7出現(xiàn)單一條帶證明了產(chǎn)物的純度，其大小在40～50 kDa,這與理論值(46 kDa)相一致。

M-Marker；1-全細(xì)胞破碎液；2-粗酶液；3-粗酶過(guò)濾液 (0.22 μm)；4-過(guò)柱流出液；5-含100 mmol/L咪唑的洗脫液； 6-含200 mmol/L咪唑的洗脫液；7～8-含350 mmol/L咪唑的洗脫液圖7 大腸桿菌重組菌目的蛋白的純化Fig.7 Purification of target proteins from E.coli BL21(DE3) recombinant strains

2.4.2 畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)目的蛋白的純化與鑒定

重組菌PichiaPinkTM-pPink-HC-3CZHEK-MaIDH4中目的蛋白的純化結(jié)果如圖8所示。目的蛋白主要出現(xiàn)在含有350 mmol/L咪唑的洗脫液中，泳道13中出現(xiàn)單一條帶證明了產(chǎn)物的純度，條帶大小位于60～70 kDa，這與理論分子質(zhì)量(67 kDa)基本一致。相比于大腸桿菌重組酶，畢赤酵母重組酶的純化相對(duì)復(fù)雜，畢赤酵母總蛋白量高于大腸桿菌，因此在酶純化過(guò)程中需要提前加入100 mmol/L的咪唑以減少雜蛋白與Ni柱的結(jié)合。

M-Marker；1-全細(xì)胞破碎液；2-粗酶液；3-粗酶過(guò)濾液 (0.22 μm)；4-過(guò)柱流出液；5～7-含100 mmol/L咪唑的洗脫液； 8～10-含200 mmol/L咪唑的洗脫液；11～15-含350 mmol/L 咪唑的洗脫液圖8 畢赤酵母重組菌目的蛋白的純化Fig.8 Purification of target proteins from PichiaPink recombinant strains

2.5 不同表達(dá)系統(tǒng)對(duì)純酶活性的影響

對(duì)不同表達(dá)系統(tǒng)的純酶比活力和酶產(chǎn)量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表2所示，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中的純酶比活力和酶產(chǎn)量分別是大腸桿菌的1.3倍和15.5倍，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)在這2個(gè)方面均優(yōu)于大腸桿菌。因此畢赤酵母為MaIDH4的最佳表達(dá)宿主。真核表達(dá)體系畢赤酵母具有嚴(yán)格接受甲醇誘導(dǎo)而進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的醇氧化酶I啟動(dòng)子利于外源基因的控制表達(dá)，強(qiáng)有力呼吸系統(tǒng)可促進(jìn)細(xì)胞的高密度生長(zhǎng)[19]，并且具備很多高級(jí)真核生物翻譯后的修飾，利于外源蛋白活性結(jié)構(gòu)的形成[20]。而大腸桿菌缺乏一些高級(jí)真核生物所具備的翻譯后修飾功能，進(jìn)而影響重組蛋白的穩(wěn)定性和活性。另外，大腸桿菌缺乏真核生物中的一些稀有密碼子，導(dǎo)致相關(guān)蛋白的表達(dá)提前終止[21]。MaIDH4更適合在畢赤酵母中表達(dá)，這一點(diǎn)與抗病毒蛋白R(shí)C28、黃曲霉毒素B1單鏈抗體以及木聚糖酶相一致[22-24]。這些可能是因?yàn)檎婧吮磉_(dá)系統(tǒng)的翻譯后修飾機(jī)制利于蛋白活性形式的組裝。

表2 不同表達(dá)體系的MaIDH4活性和產(chǎn)量差異Table 2 Differences in MaIDH4 activity and yield of different expression systems

3 結(jié)論

絲狀真菌高山被孢霉具有較強(qiáng)的脂肪酸合成能力，現(xiàn)已成為一個(gè)重要的脂質(zhì)合成模式生物。作為還原力供應(yīng)者之一的胞質(zhì)NADP-IDH在PUFAs生產(chǎn)中發(fā)揮著一定的作用。目前關(guān)于高山被孢霉來(lái)源的MaIDH4還未得到表征，本研究在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)和畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中分別表達(dá)和純化了MaIDH4，比較了2個(gè)系統(tǒng)的純酶活性及酶產(chǎn)量的差異，確定了畢赤酵母為MaIDH4的優(yōu)良表達(dá)宿主，該宿主更具大規(guī)模發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)，這為MaIDH4的酶學(xué)性質(zhì)研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。