張淑紅，王龍瓊，丁德勝，何小玲，蔡甜，張華*，陳科偉*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715)2(西南大學(xué) 食品科學(xué)與工程國家級實驗教學(xué)示范中心，重慶，400715) 3(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 婦產(chǎn)科，重慶，400016)4(西南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，重慶，400715)

母乳中含有蛋白質(zhì)、脂類、乳糖、礦物質(zhì)和維生素等各種營養(yǎng)素，其中母乳脂以脂肪球的形式穩(wěn)定存在于乳中，甘油三酯和膽固醇酯等中性脂被包裹在其核芯，膽固醇則嵌入在乳脂肪球膜的磷脂膜中以穩(wěn)定乳脂肪球的外層雙層膜[1]。膽固醇不僅對乳脂肪球膜起穩(wěn)定作用，對所有細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)都發(fā)揮重要作用，尤其是對大腦生長至關(guān)重要的神經(jīng)系統(tǒng)中的髓磷脂膜[2]。膽固醇還作為乳糜微粒和脂蛋白的重要結(jié)構(gòu)部分，促進(jìn)嬰兒體內(nèi)長鏈脂肪酸的吸收和運輸[3]。因此，膽固醇對于嬰兒器官的生長發(fā)育，尤其對大腦和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育是不可或缺的。另一方面，膽固醇作為膽汁酸、脂蛋白、維生素D、激素和氧化甾醇等重要調(diào)節(jié)劑的前體物質(zhì)[4]，也滿足了嬰兒的生長發(fā)育需要。此外有研究表明，嬰兒從母乳中獲得的膽固醇將會影響其成年后血液中的膽固醇濃度，減少成年后患高膽固醇血癥的概率[5]。

母乳中含有以棕櫚酸為主的飽和脂肪酸、以油酸為主的單不飽和脂肪酸和以亞油酸和亞麻酸為主的多不飽和脂肪酸[6-7]，部分母乳膽固醇則會與這些脂肪酸結(jié)合形成膽固醇酯。雖然母乳脂中膽固醇含量和膽固醇酯含量占比較少(分別僅占0.34%和0.02%)[8]，但是對于嬰兒營養(yǎng)吸收及代謝十分重要。母乳是嬰兒膽固醇的豐富來源，含量遠(yuǎn)高于嬰兒配方奶粉[4]。目前，我國對不同泌乳期母乳膽固醇和膽固醇酯的定性定量分析研究還較少。

我國和世界衛(wèi)生組織(World Health Organization, WHO)均推薦0～6個月嬰兒采用純母乳喂養(yǎng)，嬰幼兒配方奶粉是不能純母乳喂養(yǎng)時的無奈選擇。母乳可以滿足初生嬰兒健康生長發(fā)育的全部需要，與嬰兒配方奶粉喂養(yǎng)的嬰兒相比，母乳喂養(yǎng)會帶來更好的健康結(jié)果。但是在世界范圍內(nèi)，純母乳喂養(yǎng)率不到40%[9]，可見大部分母親還是會選擇購買嬰幼兒配方奶粉，而嬰幼兒配方奶粉也總是在竭盡全力模仿母乳成分。

據(jù)此，本研究利用超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜(ultra-performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry, UPLC-HRMS)技術(shù)對母乳中膽固醇和膽固醇酯進(jìn)行系統(tǒng)性定性定量分析，分析不同泌乳階段(初乳1～7 d、過渡乳8～15 d、成熟乳16 d以后)膽固醇及膽固醇酯組成和含量差異。膽固醇作為母乳中不可或缺的成分，了解和掌握母乳中膽固醇及其衍生的膽固醇酯的構(gòu)成和分布規(guī)律，對于相關(guān)嬰幼兒配方奶粉的生產(chǎn)和配方改良具有重要意義。除膽固醇外，本研究還對膽固醇酯進(jìn)行分析，掌握膽固醇酯的分布規(guī)律，可以為相關(guān)脂類代謝和生產(chǎn)添加提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 母乳

母乳樣品，重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院產(chǎn)科(倫理審查批號：2020-548)，共收集150位年齡在22～43歲的乳母乳汁，分別是50份初乳樣品(1～7 d)、50份過渡乳樣品(8～15 d)和50份成熟乳樣品(16 d以后)，每份樣品約20 mL，收集后立即分裝(2 mL)貯于-80 ℃條件下備用。

1.1.2 試劑

膽固醇(CAS:57-88-5)、棕櫚酸膽固醇酯(CAS:601-34-3)、硬脂酸膽固醇酯(CAS:35602-69-8)、乙酸銨、高效液相色譜純丙酮和甲醇，Sigma-Aldrich(中國，上海)；甲醇(分析純)，上海麥克林生化有限公司；氯仿(分析純)，重慶萬盛川東化工有限公司；氯化鈉、無水硫酸鈉，成都市科隆化學(xué)品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1290 infinity Ⅱ超高效液相色譜儀，美國Agilent公司；Bruker Impact Ⅱ四級桿-飛行時間質(zhì)譜儀，德國Bruker公司；Vortex-2渦旋混勻儀，上海滬析實業(yè)有限公司；離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；BSA124S分析天平，德國Sartorious公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 母乳膽固醇提取

采用改良的Folch法[7]：取1 mL母乳于50 mL離心管中，向其中加入5 mL甲醇，混合溶液經(jīng)過5 min超聲處理后冷卻至室溫，再用渦旋混勻儀旋混5 min。之后向混合體系中加入10 mL氯仿，超聲處理10 min后冷卻至室溫，旋混10 min。繼續(xù)向混合體系中加入3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的氯化鈉溶液，超聲處理5 min后冷卻至室溫，旋混5 min。

經(jīng)過4 ℃條件下放置過夜的混合體系在8 000 r/min條件下離心5 min，靜置，分層后將下層有機相留置離心管中待用，上層水相轉(zhuǎn)移至另一50 mL離心管中進(jìn)行復(fù)提。之后再向水相中加入5 mL氯仿，超聲處理5 min后冷卻至室溫，旋混5 min，在8 000 r/min條件下離心5 min，棄上層水相。合并兩次提取的下層有機相，利用無水硫酸鈉過濾，再減壓旋轉(zhuǎn)除去有機溶劑后在-20 ℃條件下保存?zhèn)溆?。?00 μLV(氯仿)∶V(甲醇)=2∶1的混合溶劑復(fù)溶，過濾膜(0.22 μm)后上機檢測。

1.3.2 超高效液相色譜質(zhì)譜條件

膽固醇及其酯類的檢測采用UPLC-HRMS進(jìn)行，UPLC型號為Agilent 1290，配有自動進(jìn)樣系統(tǒng)和二極管陣列檢測器(diode array detector，DAD)。分析柱為C18柱(Poroshell 120, 1.9 μm)，2.1 mm×100 mm，并配有同等材質(zhì)的保護(hù)柱。超高效液相分析方法參考實驗室脂溶性化合物分析方法[10]。UPLC流速為0.2 mL/min，流動相A為V(甲醇)∶V(水)=8∶2，流動相B為V(甲醇)∶V(丙酮)=1∶1，流動相中均加入10 mmol/L乙酸銨。采用梯度洗脫程序：0～15 min，25%～100% B；15～20 min，100% B；20～25 min，25% B。HRMS采用大氣壓化學(xué)電離源(atmospheric pressure chemical ionization, APCI)分析膽固醇及其酯類，正離子模式(APCI+)，質(zhì)量范圍 150～3 000m/z，APCI加熱溫度450 ℃，霧化氣流速為3 Bar，干燥氣流速為5 L/min，干燥氣溫度為200 ℃，霧化氣和干燥氣均為高純氮氣。毛細(xì)管電壓為4 000 V，末端平板電壓為500 V，裂解能量10 eV，質(zhì)譜數(shù)據(jù)在Bruker Compass Data Analysis 4.4軟件上分析處理。

1.3.3 定性測定方法

采用UPLC-HRMS定性測定膽固醇及膽固醇酯，即在UPLC方法下，分離樣品中各物質(zhì)并獲得相應(yīng)的色譜峰，然后根據(jù)HRMS測定未知物質(zhì)的分子質(zhì)量，再對比標(biāo)準(zhǔn)品的相應(yīng)信息對相關(guān)色譜峰物質(zhì)定性。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液：取膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用V(氯仿)∶V(甲醇)=2∶1混合溶劑溶解并定容于10 mL容量瓶中，配制成1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，將此溶液連續(xù)稀釋配成質(zhì)量濃度為10～1 000 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

混合膽固醇酯標(biāo)準(zhǔn)溶液[11]：采用已經(jīng)定性確定的、可以購買到的商用高純度棕櫚酸膽固醇酯、硬脂酸膽固醇酯2種標(biāo)準(zhǔn)品，以質(zhì)量比1∶1混合，該混和膽固醇酯作為各種膽固醇酯定量所用的標(biāo)準(zhǔn)品。分別稱取棕櫚酸膽固醇酯、硬脂酸膽固醇酯2種標(biāo)準(zhǔn)品各5 mg，用V(氯仿)∶V(甲醇)=2∶1混合溶劑溶解并共同定容于10 mL容量瓶中，配制成1 000 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，將此溶液連續(xù)稀釋配成質(zhì)量濃度為10～1 000 mg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在色譜條件下，將1.3.4中的一系列不同濃度的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液和混合膽固醇酯標(biāo)準(zhǔn)溶液UPLC進(jìn)樣分析。以膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品峰面積為橫坐標(biāo)，對應(yīng)質(zhì)量濃度(mg/L)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程和相關(guān)系數(shù)；以2種膽固醇酯標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積之和為橫坐標(biāo)，對應(yīng)質(zhì)量濃度(mg/L)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到混和膽固醇酯標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.3.6 定量測定方法

每個母乳樣品分析2次，膽固醇根據(jù)所獲標(biāo)準(zhǔn)曲線對其進(jìn)行定量測定，而對膽固醇酯的定量測定則為相對定量測定，各種膽固醇酯統(tǒng)一采用混合膽固醇酯標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

本研究利用Bruker Compass Data Analysis 4.4軟件對膽固醇和膽固醇酯進(jìn)行定性，膽固醇化學(xué)結(jié)構(gòu)式運用ChemDraw 19.0軟件繪圖。實驗數(shù)據(jù)采用Origin 2018軟件繪圖，采用SPSS 26.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行單因素方差分析[Duncan法和least-significant difference(LSD)法檢驗]、主成分分析和相關(guān)性分析，P<0.05表示具有顯著性差異，結(jié)合OmicShare平臺進(jìn)行相關(guān)性分析和聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 膽固醇及膽固醇酯的定性分析

膽固醇結(jié)構(gòu)如圖1所示，其分子含有一個羥基，可與脂肪酸酯化形成各種膽固醇酯。本實驗采用UPLC-HRMS在APCI+模式下對采集的150份母乳樣品中的膽固醇和膽固醇酯進(jìn)行檢測分析。本研究對母乳中膽固醇和膽固醇酯的檢測結(jié)果見表1，根據(jù)各種物質(zhì)在色譜柱中的保留時間不同，除檢測到豐富的膽固醇外，還檢測到13種膽固醇酯。其中只檢測到丁酸膽固醇酯(C4∶0)這一種短鏈脂肪酸膽固醇酯，其余均為與長鏈脂肪酸結(jié)合的膽固醇酯。檢測到初乳中膽固醇酯種類最多，達(dá)到13種，過渡乳中含有11種，成熟乳中只有7種，3個泌乳期均檢測到α-亞麻酸膽固醇酯(C18∶3)、丁酸膽固醇酯(C4∶0)、二十二酸膽固醇酯(C22∶0)、二十四碳烯酸膽固醇酯(C24∶1)、二十四酸膽固醇酯(C24∶0)、十七酸膽固醇酯(C17∶0)和硬脂酸膽固醇酯(C18∶0)。

目前國內(nèi)外對母乳中膽固醇酯的組成和分布的研究較少，人體血清中膽固醇酯研究較多[11]。并且，EMKEN等[12]發(fā)現(xiàn)母乳中棕櫚酸膽固醇酯(C18∶1)的含量明顯高于血漿。值得注意的是，我們還在母乳中額外檢測到丁酸膽固醇酯(C4∶0)和二十二酸膽固醇酯(C22∶0)。

圖1 膽固醇化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of cholesterol

表1 母乳中膽固醇及膽固醇酯組成Table 1 Composition of cholesterol and cholesteryl esters in breast milk

2.2 膽固醇及膽固醇酯的定量分析

2.2.1 不同泌乳期的膽固醇及膽固醇酯

根據(jù)信噪比(S/N)為3確定檢出限(limits of detection, LOD)以及信噪比(S/N)為10確定定量限(limits of quantification, LOQ)。膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.000 05x-8.935 2[y為膽固醇質(zhì)量濃度(mg/L)，x為峰面積]，在10～650 mg/L線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 7，LOD為0.01 mg/L，LOQ為0.03 mg/L；混合膽固醇酯標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.000 036x-0.056 73[y為膽固醇酯濃度(mg/L)，x為峰面積]，在0.07～8.0 mg/L線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2，LOD為0.017 mg/L，LOQ為0.055 mg/L。不同泌乳期中的膽固醇及膽固醇酯含量分析結(jié)果見圖2。

由圖2可知，初乳中膽固醇含量最高，平均含量高達(dá)176.33 mg/L；過渡乳中膽固醇平均含量為115.44 mg/L；成熟乳中膽固醇含量僅為97.12 mg/L。運用SPSS 26.0進(jìn)行單因素方差分析，在95%的置信度下不同泌乳期的膽固醇含量有顯著差異(P<0.05)。并采用Duncan法和LSD法多重比較檢驗結(jié)果，其中過渡乳和成熟乳間的膽固醇平均含量差異并不顯著，而膽固醇含量在初乳與過渡乳、初乳與成熟乳間存在顯著差異。由初乳到過渡乳和成熟乳，隨著泌乳期的延長，母乳中膽固醇含量逐漸降低，這與曹宇彤[13]的研究結(jié)果是一致的。初乳中膽固醇含量最高，可能表明剛出生的嬰兒需要較高的膽固醇水平以加快器官的形成，特別是腦部發(fā)育中腦細(xì)胞的構(gòu)成。

研究發(fā)現(xiàn)，母乳中的膽固醇酯含量甚微，在一部分母乳樣品中甚至未檢測到膽固醇酯，且不同個體中膽固醇酯含量差異較大。初乳中膽固醇酯平均含量可達(dá)0.59 mg/L；過渡乳中膽固醇酯平均含量為0.51 mg/L；成熟乳中膽固醇酯平均含量僅為0.16 mg/L。由膽固醇酯在不同泌乳期的平均含量可初步判斷，初乳中膽固醇酯含量最高，從初乳和過渡乳到成熟乳，膽固醇酯含量也逐漸降低，這與VILLASEOR等[14]的研究結(jié)果也是一致的。在母乳脂中，甘油三酯含量達(dá)到脂肪總量的98%左右[8]，由此可見母乳中的脂肪酸大多以游離形式或甘油三酯形式存在，僅少量脂肪酸與膽固醇結(jié)合而成膽固醇酯。

母乳的主要特點就是其獨特性，母乳脂存在著巨大的個體內(nèi)差異和個體間差異。即使是同一位乳母，其母乳成分也會隨泌乳期不斷改變，并且在一日中乳脂的含量變異最大，左右乳也顯著不同[15]。由圖2可知，不同個體中的膽固醇及膽固醇酯含量均存在較大差異，可能與乳母間的飲食情況、健康狀態(tài)以及生活方式等因素的差異和嬰兒需求差異有關(guān)。但也有研究表明，乳膽固醇含量不受乳母膳食的影響，而與乳脂含量有關(guān)，可能原因是乳膽固醇因參與甘油三酯的運輸而與乳甘油三酯的分泌有聯(lián)系[16]。膽固醇酯的形成是防止游離膽固醇積累的重要方式，所以母乳中膽固醇酯含量可能會因個體間膽固醇的差異而有所不同[17]。并且不同個體的母乳中膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(acyl-coenzyme A∶cholesterol acyltransferase, ACAT)和膽鹽刺激性脂酶(bile salt-stimulated lipase, BSSL)的含量也存在一定差異[18-19]，使得母乳中膽固醇酯在各種因素的疊加影響下而呈現(xiàn)出較大的個體差異。

圖2 三個泌乳期母乳中的膽固醇及膽固醇酯含量Fig.2 Contents of cholesterol and cholesteryl esters in breast milk during three lactation periods

2.2.2 母乳中的膽固醇酯類型分布

不同泌乳期中主要的膽固醇酯組成和含量也不同，如圖3所示。初乳中檢測到的13種膽固醇酯中，α-亞麻酸膽固醇酯(C18∶3)、二十二酸膽固醇酯(C22∶0)、二十四酸膽固醇酯(C24∶0)、二十碳烯酸膽固醇酯(C20∶1)和十七酸膽固醇酯(C17∶0)含量相對較高。過渡乳中檢測到的11種膽固醇酯中，二十四酸膽固醇酯(C24∶0)和棕櫚酸膽固醇酯(C16∶0)含量相對較高，同時也是整個泌乳期含量最高的2種膽固醇酯。成熟乳中檢測到的7種膽固醇酯中，二十四酸膽固醇酯(C24∶0)和十七酸膽固醇酯(C17∶0)含量相對較高。

母乳中70%的棕櫚酸、油酸、亞油酸會選擇性地結(jié)合甘油sn-2位的羥基[20]，這種分布可促進(jìn)人體對脂肪、礦物質(zhì)的吸收和利用。所以即使母乳中這幾種脂肪酸含量較高，但本次實驗并未檢出亞油酸膽固醇酯(C18∶2)，油酸膽固醇酯(C18∶1)也僅在初乳中檢出且含量較少。此外，硬脂酸膽固醇酯(C18∶0)在3個泌乳期的含量也普遍較低。雖然棕櫚酸膽固醇酯(C16∶0)是母乳中濃度最高的膽固醇酯，但本次實驗僅在個別過渡乳樣品中檢出。楊廣花等[21]在催化膽固醇合成膽固醇棕櫚酸酯(C16∶0)的研究中也發(fā)現(xiàn)，膽固醇的最終酯化率并沒有因為棕櫚酸含量的增加而提高。所以，母乳中含量較高的棕櫚酸、油酸、亞油酸和硬脂酸其對應(yīng)的膽固醇酯含量不一定高。

雖然母乳中常見的短鏈脂肪酸有丁酸、己酸和辛酸[22]，但丁酸膽固醇酯是(C4∶0)母乳中檢測到的唯一一個短鏈脂肪酸膽固醇酯。由于乳脂幾乎是人類飲食中丁酸的唯一來源，所以丁酸仍會以游離或丁酸酯的形式存在于母乳中[23]?？赡転榱死趮雰焊玫叵斩替溨舅?，母乳脂中短鏈脂肪酸更傾向于分布在甘油sn-1位和sn-3位[24]。母乳中的丁酸含量隨泌乳期延長而逐漸增加[22]，而丁酸膽固醇酯(C4∶0)的含量逐漸減少，以適應(yīng)嬰兒對短鏈脂肪酸的需要和提高短鏈脂肪酸的吸收率。

膽固醇酯以及甘油酯的脂肪酸組成在很大程度上決定了母乳脂的營養(yǎng)和物理化學(xué)性質(zhì)。α-亞麻酸可促進(jìn)嬰兒視力發(fā)育、增強智力和預(yù)防過敏性反應(yīng)，花生四烯酸對嬰兒的大腦、神經(jīng)系統(tǒng)以及視力的發(fā)育至關(guān)重要[20]。這類必需脂肪酸所對應(yīng)的α-亞麻酸膽固醇酯(C18∶3)和花生四烯酸膽固醇酯(C20∶4)均在初乳中含量最高，可見此類膽固醇酯在初乳中尤為重要，可能表明剛出生的嬰兒需要較高水平α-亞麻酸膽固醇酯(C18∶3)和花生四烯酸膽固醇酯(C20∶4)以滿足其視力、大腦以及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的需求。二十二碳烯酸膽固醇酯(C20∶1)和花生酸膽固醇酯(C20∶0)都是僅在初乳和過渡乳中少量存在，在成熟乳中未檢出，這可能與母乳中二十二碳烯酸和花生酸本身含量較低有關(guān)[22]。

圖3 三個泌乳期母乳中的各種膽固醇酯含量Fig.3 Contents of cholesteryl esters in breast milk in three lactation periods

2.3 主成分分析

將3段泌乳期的13種膽固醇酯指標(biāo)轉(zhuǎn)換為13個成分，進(jìn)行主成分分析，在KMO和巴特利特檢驗中，KMO=0.645>0.5、球形度檢驗P=0.000<0.05，因此適合主成分分析。如表2所示，根據(jù)各主成分的特征值和貢獻(xiàn)率進(jìn)行主成分提取，最終提取6個主成分，6個主成分的方差貢獻(xiàn)率累計達(dá)到76.32%，能夠代表所有指標(biāo)的絕大部分信息，從原來的13個指標(biāo)減少為6個新指標(biāo)，從而起到了降維的作用。

因子載荷值反映母乳中各種膽固醇酯對主成分載荷的相對大小和影響的方向，載荷值分析結(jié)果見表3，由表3可知PC1主要綜合了硬脂酸膽固醇酯(C18∶0)、二十二碳烯酸膽固醇酯(C22∶1)、花生酸膽固醇酯(C20∶0)、丁酸膽固醇酯(C4∶0)、二十四碳烯酸膽固醇酯(C24∶1)、二十二酸膽固醇酯(C22∶0)，方差累積貢獻(xiàn)率為31.137%，是最主要的主成分；PC2綜合了二十四酸膽固醇酯(C24∶0)、棕櫚酸膽固醇酯(C16∶0)；PC4綜合了花生四烯酸膽固醇酯(C20∶4)、十七酸膽固醇酯(C17∶0)；PC3、PC5 和PC6分別與二十碳烯酸膽固醇酯(C20∶1)、α-亞麻酸膽固醇酯(C18∶3)、油酸膽固醇酯(C18∶1)相關(guān)。

表2 總方差解釋Table 2 Total variance explanation

表3 主成分載荷矩陣Table 3 Principal component load matrix

2.4 相關(guān)性分析

2.4.1 膽固醇與總膽固醇酯的相關(guān)性分析

由于母乳中膽固醇酯是由膽固醇與脂肪酸酯化形成，推測膽固醇酯含量可能與膽固醇含量具有一定相關(guān)性，對此利用SPSS 26.0軟件對150份母乳中的膽固醇含量與膽固醇酯含量的相關(guān)性進(jìn)行分析，其分析數(shù)據(jù)如表4所示，顯著性概率值P<0.01，表示在0.01的顯著性水平上(99.0%的置信度)極顯著。膽固醇與膽固醇酯含量之間的皮爾遜相關(guān)系數(shù)為0.357，可見兩者之間僅存在較弱的正相關(guān)性，說明母乳中膽固醇酯的調(diào)節(jié)機制不是簡單的濃度依賴關(guān)系。形成膽固醇酯部分的特定的脂肪酸要么由乳腺內(nèi)源性合成，要么從母體血漿中攝取，這2種脂肪酸來源都受母體飲食的影響[25]，所以母乳中膽固醇酯的含量可能不僅受膽固醇含量的影響，還可能間接受母親飲食情況的影響，該方面還有待進(jìn)一步研究。

表4 相關(guān)性分析結(jié)果Table 4 Correlation analysis results

2.4.2 各種膽固醇酯之間的相關(guān)性分析

采用皮爾遜相關(guān)系數(shù)分析母乳中各種膽固醇酯之間的相關(guān)性，可了解膽固醇酯差異中潛在的代謝關(guān)聯(lián)性，為更為深入的代謝組的研究提供分析依據(jù)。分析結(jié)果見圖4，可將母乳中的13種膽固醇酯聚為兩類。

一類以飽和脂肪酸膽固醇酯為主，且該類中的6種膽固醇酯與前面主成分分析所得PC1中的6種膽固醇酯是一致的。丁酸膽固醇酯(C4∶0)、二十四碳烯酸膽固醇酯(C24∶1)、二十二碳烯酸膽固醇酯(C22∶1)、硬脂酸膽固醇酯(C18∶0)、花生酸膽固醇酯(C20∶0)和二十二酸膽固醇酯(C22∶0)這6種膽固醇酯兩兩之間均呈十分顯著正相關(guān)(P≤0.001)，尤其是二十二碳烯酸膽固醇酯(C22∶1)與硬脂酸膽固醇酯(C18∶0)具有極強的相關(guān)性(皮爾遜相關(guān)系數(shù)為0.88)，這表明母乳中二十二碳烯酸膽固醇酯(C22∶1)含量高的，其硬脂酸膽固醇酯(C18∶0)含量也相對較高，二者關(guān)聯(lián)性依據(jù)還需要進(jìn)一步研究。另一類以不飽和脂肪酸膽固醇酯為主，而這7種膽固醇酯與母乳中其他膽固醇酯大多呈極弱的相關(guān)性或無相關(guān)性。

圖4 十三種膽固醇酯的相關(guān)性熱圖分析Fig.4 Correlation thermogram analysis of 13 cholesteryl esters

3 結(jié)論與討論

本研究利用UPLC-HRMS同時檢測母乳中的膽固醇及膽固醇酯，其中初乳、過渡乳和成熟乳中除膽固醇外分別檢出13、11、7種微量膽固醇酯，母乳中的脂肪酸大多以游離形式或甘油三酯形式存在，僅少量脂肪酸與膽固醇結(jié)合而成膽固醇酯。母乳中膽固醇及膽固醇酯含量存在較大的個體差異，但總體上膽固醇及膽固醇酯含量均在初乳中含量最高，其含量隨泌乳期延長而逐漸降低。在整個泌乳期中，過渡乳中的二十四酸膽固醇酯(C24∶0)和棕櫚酸膽固醇酯(C16∶0)含量最高。母乳中含量較高的脂肪酸如油酸、亞油酸和硬脂酸所對應(yīng)的亞油酸膽固醇酯(C18∶2)，油酸膽固醇酯(C18∶1)和硬脂酸膽固醇酯(C18∶0)在3個泌乳階段里的含量普遍較低甚至沒有，母乳中的必需脂肪酸如α-亞麻酸和花生四烯酸所對應(yīng)的α-亞麻酸膽固醇酯(C18∶3)和花生四烯酸膽固醇酯(C20∶4)在初乳中的含量最高，以滿足剛出生嬰兒的視力、大腦以及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的需求，而丁酸膽固醇酯是(C4∶0)是母乳中唯一一個短鏈脂肪酸膽固醇酯。

可能母乳中膽固醇酯含量與母體的飲食情況等因素也有關(guān)，所以母乳中的膽固醇含量與總膽固醇酯含量僅具有較弱的正相關(guān)性(皮爾遜相關(guān)系數(shù)為0.357)，但不同的膽固醇酯之間表現(xiàn)出一定的相關(guān)性，尤其是二十二碳烯酸膽固醇酯(C22∶1)與硬脂酸膽固醇酯(C18∶0)具有極強的相關(guān)性(皮爾遜相關(guān)系數(shù)為0.88)，二者關(guān)聯(lián)性依據(jù)還需要進(jìn)一步研究。通過聚類分析可將13種膽固醇酯劃分為兩類，一類以飽和脂肪酸膽固醇酯為主，且與PC1中的6種膽固醇酯一致，另一類以不飽和脂肪酸膽固醇酯為主。