朱金成 楊洋 婁慧 張薇

（石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點實驗室，石河子 832003）

海島棉（Gossypium barbadense）因其具有優(yōu)良的纖維品質(zhì)，是全球高檔新型紡織品和特種紡織品不可缺少的重要原料。新疆因充足的光熱資源，成為中國海島棉唯一種植區(qū)域，在海島棉生產(chǎn)中起著關(guān)鍵作用［1-2］。尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）是一種土傳性真菌，可感染120 多種植物，并給棉花、番茄、香蕉和甜瓜等許多重要作物種植帶來巨大的經(jīng)濟損失［3］。棉花枯萎病是由尖孢鐮刀菌萎蔫?；驼婢‵usarium oxysporumf.sp.vasinfectum，F(xiàn)ov）引起，該病主要危害棉花的維管束等部位，輕者發(fā)育遲緩，纖維品質(zhì)和產(chǎn)量下降，重者則于苗期或蕾鈴期枯死，給棉花生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失［4］。由于海島棉相對陸地棉更易感枯萎病，一旦發(fā)生很難根治，使得枯萎病逐漸成為威脅新疆海島棉產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要病害［5］。目前棉花枯萎病防治主要有兩種，一是生物防治，即培育抗性品種及輪作；二是化學(xué)防治。然而，生物防治存在品種培育周期長、輪作受限于種植面積及輪作時間等問題，化學(xué)防治存在殘留及環(huán)境污染等問題［6-7］，因此亟需尋找一種無毒、高效且對環(huán)境無污染的防治辦法。

褪黑素（N-acetyl-5-methoxytryptamine,MT）廣泛存在于植物體內(nèi)，具有多重作用［8］。褪黑素不僅可以促進(jìn)種子萌發(fā)、幼苗生長以及影響植物衰老，而且還參與緩解高溫、低溫、鹽堿、干旱等非生物脅迫［9-10］。研究發(fā)現(xiàn)，外源褪黑素的處理能夠增強香蕉的抗氧化防御能力，并誘導(dǎo)冷響應(yīng)基因的表達(dá)，從而提高香蕉的抗寒性［11］。外源褪黑素處理可以有效地改善干旱脅迫下番茄幼苗的生長、根系特征、葉片光合作用和抗氧化能力，從而提高番茄幼苗對干旱脅迫的耐受性［12］。在鹽脅迫下，不同濃度褪黑素預(yù)處理后，棉花種子中可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)、脯氨酸和K+/ Na+含量高于對照，表明外源褪黑素可以通過增強滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和調(diào)節(jié)鹽脅迫下的離子穩(wěn)態(tài)來有效提高棉花種子對鹽脅迫的耐受性［13］。外源施用褪黑素還可以通過上調(diào)內(nèi)源褪黑素和赤霉素（GA）含量來延長高溫脅迫下番茄幼苗葉片衰老，同時抑制脫落酸（ABA）形成和減少葉綠素降解［14］。近年來，褪黑素在植物抵御各種生物脅迫方面的研究引起了人們的廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，外源褪黑素通過調(diào)節(jié)過氧化氫（H2O2）的產(chǎn)生和茉莉酸（JA）的信號機制，在番茄對灰霉病菌的抗性中起到促進(jìn)作用［15］。外源噴施褪黑素可提高抗氧化酶活性及抗氧化基因的表達(dá)，從而提高黃瓜對霜霉病的抗性［16］。褪黑素可以通過調(diào)節(jié)苯丙烷和磷酸戊糖途徑及能量代謝來提高荔枝對霜霉病的抗性［17］。外源褪黑素還可與一氧化氮（NO）協(xié)同作用，增強OsPR1b和OsWEKY45的表達(dá)水平，提高水稻對條紋病的抗性［18］。此外，研究還發(fā)現(xiàn)褪黑素的同系物5-甲氧基吲哚（5-methoxyindole）同樣能夠提高小麥對赤霉病的抗病性［19］。

本研究以海島棉品種新海14 號為材料，研究不同濃度外源褪黑素預(yù)處理對接菌后棉花枯萎病抗性的影響，探究外源褪黑素調(diào)控棉花對枯萎病抗性的作用機制，為棉花枯萎病防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

棉花品種新海14 號和枯萎病菌株F327 均由石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院棉花分子育種實驗室保存。褪黑素標(biāo)準(zhǔn)品購于Sigma-Aldrich 公司。幾丁質(zhì)酶（CHT）、β-1,3 葡聚糖酶（GLU）、多酚氧化酶（PPO）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性及過氧化氫（H2O2）含量、超氧陰離子產(chǎn)生速率檢測試劑盒購于蘇州科銘生物公司，植物RNA 快速提取試劑盒（EasyPure Plant RNA Kit）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix）、熒光定量PCR 試劑盒（PerfectStart Green qPCR Super Mix）購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 外源褪黑素噴施處理 挑選顆粒飽滿的種子，用75%酒精浸泡10 min 進(jìn)行消毒，超純水沖洗3-4次，種子用50-60℃的溫水浸泡20 min 后，置于有滅菌紗布的發(fā)芽盒中。在25℃、黑暗條件下催芽48 h 后（保持紗布一直濕潤），將發(fā)芽的種子清理好種植于營養(yǎng)缽中（營養(yǎng)缽直徑6 cm，高度6 cm），基質(zhì)為泥炭∶蛭石=3∶1。隨后將營養(yǎng)缽放置于人工氣候箱中，氣候箱條件設(shè)置為溫度28℃/25℃（日/夜），相對濕度60%，光照強度32 000 lx，光周期16 h/8 h（日/夜）。待棉花長到“兩葉一心”期后，進(jìn)行外源褪黑素濃度噴施處理。具體為噴施0、10、25、50、75、100 μmol/L 褪黑素于棉花幼苗地上部分（以噴至葉面滴水為標(biāo)準(zhǔn)），早晚各處理一次，連續(xù)噴施3 d。噴施處理結(jié)束靜置24 h，準(zhǔn)備接種枯萎菌。每個處理45 株棉花幼苗，3 個生物學(xué)重復(fù)。

1.2.2 外源褪黑素對枯萎病菌生長的影響 將枯萎病菌（-80℃保存）解凍后，在超凈工作臺下取200 μL 菌液用涂布器均勻涂布到PDA 培養(yǎng)基上，25℃暗培養(yǎng)7 d 后，用打孔器取大小一致的菌塊，放置于含不同濃度褪黑素（0、10、25、50、75、100 μmol/L）的PDA 培養(yǎng)基上，25℃暗培養(yǎng)，在第7 天觀察菌落生長情況，用十字交叉法計算菌絲直徑。

1.2.3 枯萎病菌的活化及接菌處理 挑取在PDA 培養(yǎng)基上25℃暗培養(yǎng)活化3 d 的單菌落，于1 L 液體查氏（Czapek's）培養(yǎng)基中28℃、200 r/min 的恒溫?fù)u床上暗培養(yǎng)5-7 d。待菌液培養(yǎng)到合適濃度后，用6 層滅菌紗布緩慢過濾，用血球計數(shù)板計算過濾后孢子濃度，用無菌水將孢子濃度稀釋為1×107個/mL，用于接菌試驗。

取褪黑素預(yù)處理植株和對照組植株進(jìn)行傷根接菌處理，具體方法為用滅菌手術(shù)刀均勻的在營養(yǎng)缽上劃4 道傷口，每道傷口注射2.5 mL 的1×107個/mL的孢子懸浮液（共注射10 mL）。接菌結(jié)束后棉苗仍置于人工氣候箱中，期間定量澆灌蒸餾水。

1.2.4 抗病性鑒定

1.2.4.1 病情指數(shù) 接菌6 d 后，每隔8 d 對褪黑素預(yù)處理組和對照組棉花發(fā)病情況進(jìn)行調(diào)查并統(tǒng)計病情指數(shù)，苗期棉花枯萎病分級標(biāo)準(zhǔn)參考陳磊［20］方法。每個處理調(diào)查20 株棉花幼苗，3 個生物學(xué)重復(fù)。

1.2.4.2 剖莖觀察 隨機選取接種枯萎病菌后22 d的褪黑素預(yù)處理組和對照組棉花幼苗子葉節(jié)上部莖稈，用雙面刀片縱切后，置于體式顯微鏡（SteREO Discovery.V20；ZEISS）下觀察莖稈褐化程度并拍照。

1.2.5 生理指標(biāo)測定 取50 μmol/L 褪黑素預(yù)處理植株和對照植株葉片，于接菌0、1、3、7 d 進(jìn)行抗氧化系統(tǒng)及防御酶活性測定。過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性測定參照Yin 等［21］方法。幾丁質(zhì)酶（CHT）、β-1,3 葡聚糖酶（GLU）、多酚氧化酶（PPO）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性及過氧化氫（H2O2）含量、超氧陰離子產(chǎn)生速率測定按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.6 基因相對表達(dá)量測定 取接菌0、6、12、24和48 h 的50 μmol/L 褪黑素預(yù)處理植株和對照植株根部組織，采用EasyPure Plant RNA Kit 試劑盒提取RNA，EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)體系（20 μL）：3 μL RNA、1 μL Anchored Oligo（dT）18Prime、10 μL 2×ES Reaction Mix、1 μLEasyScript?RT/RI Enzyme Mix、1 μL gDNA Remover 和4 μL RNase-free Water，42℃反應(yīng)15 min，85℃加熱5 s。使用PerfectStart Green qPCR Super Mix 試劑盒在羅氏LightCycler 480II 進(jìn)行熒光定量PCR 分析。反應(yīng)體系（10 μL）：1 μL 稀釋10 倍的cDNA、5μL 2×SYBR Green Mix、10 μmol/L 正反向引物各0.2 μL 和ddH2O 3.6 μL，95℃ 3 min；然后95℃變性10 s，60℃退火15 s，72℃延伸15 s，40 個循環(huán)。以GhUBQ7為內(nèi)參基因，按照2-ΔΔCt方法計算相對表達(dá)量。生物學(xué)重復(fù)3 次，用primer 5 軟件設(shè)計相關(guān)引物（表1），引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表1 熒光定量PCR 引物序列Table 1 Primer sequences for quantitative PCR

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 使用Excel 2010 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，SPSS 22 進(jìn)行差異顯著分析，GraphPad Prism 8 繪圖。

2 結(jié)果

2.1 外源褪黑素對棉花抗病性的影響

用不同濃度褪黑素（0、10、25、50、75、100 μmol/L）預(yù)處理棉花幼苗后，進(jìn)行棉花枯萎病菌接種處理，觀察發(fā)病情況，并統(tǒng)計各處理病情指數(shù)。結(jié)果表明，接菌后22 d，對照組和褪黑素預(yù)處理組出現(xiàn)不同的病征。與褪黑素預(yù)處理組相比，對照組植株發(fā)病更為嚴(yán)重，葉片出現(xiàn)明顯萎蔫、黃化和脫落（圖1-A），莖稈褐化程度也明顯較褪黑素預(yù)處理組高（圖1-B）。各處理病情指數(shù)統(tǒng)計結(jié)果表明，隨著接種時間的延長，病情指數(shù)隨之升高，但處理組病情指數(shù)升高的趨勢明顯低于對照組（圖1-C）。在接種后22 d，對照組病情指數(shù)為55，10、25、50、75、100 μmol/L 褪黑素預(yù)處理植株病情指數(shù)分別為47、35、23、31、32。其中，50 μmol/L 褪黑素預(yù)處理植株的病情指數(shù)顯著低于對照組和其他濃度預(yù)處理組，莖稈褐化程度也更輕，表明50 μmol/L 褪黑素預(yù)處理顯著提高了棉花對枯萎病的抗性，延緩病害的發(fā)生，因此選擇50 μmol/L 褪黑素進(jìn)行后續(xù)試驗。

圖1 不同濃度外源褪黑素預(yù)處理對棉花枯萎病抗性的影響Fig.1 Effects of exogenous melatonin pretreatment at different concentration on the cotton resistance to Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum（Fov）

2.2 外源褪黑素對枯萎病菌生長的影響

為了解外源褪黑素是否直接影響枯萎菌的生長，在含有不同褪黑素濃度（0、10、25、50、75、100 μmol/L）的PDA 培養(yǎng)基上放置同等大小的枯萎病菌餅，黑暗生長7 d 后，觀察菌絲生長情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)枯萎菌菌絲的生長并未受到褪黑素處理的影響（圖2-A），與對照（0 μmol/L）相比，各處理菌落直徑無顯著差異（圖2-B），說明褪黑素是一種對枯萎菌生長無明顯抑制的小分子物質(zhì)。

圖2 不同濃度外源褪黑素對枯萎菌生長的影響Fig.2 Effects of exogenous melatonin at different concentration on the growth of Fov

2.3 褪黑素預(yù)處理對接菌后棉花抗氧化系統(tǒng)的影響

在接種枯萎病菌后，葉片中的H2O2含量和O2·-產(chǎn)生速率均隨著接菌時間的延長呈持續(xù)上升的趨勢，但褪黑素預(yù)處理組低于對照組。預(yù)處理組中H2O2含量在第3、5、7 天顯著低于對照組，分別降低了28.49%、15.98%、17.61%。O2·-產(chǎn)生速率在第3 天顯著低于對照組，降低了24.64%（圖3-A,B）。隨著接菌時間的延長，褪黑素預(yù)處理組和對照組葉片中POD 和CAT 活性變化呈現(xiàn)相同的趨勢，均為先升高后降低，在第5 天達(dá)到峰值，然后開始逐漸降低。褪黑素預(yù)處理組POD、CAT 活性均在第5 天和第7 天顯著高于對照組，較對照分別提高45.02%、33.77% 和47.82%、30.04%（圖3-C,D）。SOD 和APX 活性也表現(xiàn)為先升高后下降的變化趨勢，褪黑素預(yù)處理組中SOD 活性在接菌后第1 天顯著上升，在第3 天達(dá)到峰值后一直保持較高水平且極顯著高于對照組，較對照分別提高32.58%、50.08%、54.52%、79.34%。APX 活性則在第5 天和第7 天極顯著高于對照組，較對照分別提高70.07%、127.44%（圖3-E,F）。由上述結(jié)果可知，隨著接種時間的延長，H2O2大量積累、O2·-產(chǎn)生速率顯著升高，但經(jīng)褪黑素預(yù)處理后，接種枯萎病菌的棉花植株能夠大幅提高POD、CAT、SOD 和APX 的活性，減少H2O2的積累和O2·-產(chǎn)生速率，從而減輕了棉花因枯萎病菌的侵染帶來的氧化損傷。

圖3 褪黑素預(yù)處理對接菌后棉花抗氧化系統(tǒng)的影響Fig.3 Effects of melatonin pretreatment on cotton antioxidant system after Fov inoculated

2.4 褪黑素預(yù)處理對接菌后棉花防御酶活性的影響

接菌后對照組和褪黑素預(yù)處理組中PAL 活性變化趨勢為先升高后下降，在接菌后3 d 達(dá)到最大值，且褪黑素預(yù)處理組中，PAL 活性在各時間點均顯著高于對照組（圖4-A）。對照組和褪黑素預(yù)處理組中PPO 活性變化呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，單對照組葉片中PPO 活性在第1 天達(dá)到峰值，而后一直呈現(xiàn)下降趨勢。褪黑素誘導(dǎo)組葉片中，PPO 活性則在第5 天達(dá)到峰值，其活性在第3、5、7 天極顯著高于對照組，分別比對照提高61.66%、89.68%、70.10%（圖4-B）。對照組中GLU 活性隨著接菌時間的延長緩慢升高，在接種5 d 達(dá)到最大值，然后呈現(xiàn)下降的趨勢。褪黑素預(yù)處理組GLU 活性變化趨勢與對照組相似，峰值也出現(xiàn)在接種后第5 天，在接種后第1、3、5 天褪黑素誘導(dǎo)組酶活性顯著高于對照組，分別比對照增加49.03%、67.27%、47.49%（圖4-C）。CHT活性在對照組中表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，其峰值出現(xiàn)在接種后的第5 天。褪黑素預(yù)處理組中則呈現(xiàn)持續(xù)升高的變化趨勢，在第3、5、7 天顯著高于對照組，分別比對照提高32.58%、36.16%、68.87%（圖4-D）。以上結(jié)果表明，褪黑素預(yù)處理能夠有效提高接菌后棉花植株P(guān)AL、PPO、CHT 和GLU 活性，從而抵御病原菌的侵染和抑制病原菌的繁殖。

圖4 褪黑素預(yù)處理對接菌后棉花防御酶活性的影響Fig.4 Effects of melatonin pretreatment on the cotton defense enzyme activity after Fov inoculated

2.5 褪黑素預(yù)處理對接菌后棉花木質(zhì)素、類黃酮代謝通路相關(guān)基因表達(dá)的影響

GbPAL、Gb4CL、GbCAD和GbCHI、GbDFR、GbTT7分別是苯丙烷代謝中木質(zhì)素合成和類黃酮合成途徑的關(guān)鍵基因，為探索苯丙烷代謝途徑中關(guān)鍵基因是否受褪黑素誘導(dǎo)表達(dá)，本研究采用實時熒光定量PCR 技術(shù)檢測了接菌0、6、12、24、48 h 后對照組和褪黑素預(yù)處理組根部組織中上述6 個基因的表達(dá)情況。在接菌后，對照組和褪黑素預(yù)處理組中GbPAL基因的相對表達(dá)量變化均為先升后降，但對照組中GbPAL基因的相對表達(dá)量在6 h 達(dá)到峰值，而后逐漸下降，而褪黑素預(yù)處理組中該基因的相對表達(dá)量則在24 h 達(dá)到峰值且顯著高于對照，表達(dá)量是對照的6.78 倍（圖5-A）。褪黑素預(yù)處理組中Gb4CL基因的相對表達(dá)量均顯著高于對照組，在接菌后6、12、24、48 h 分別是對照的6.93、9.07、1.65、2.88 倍（圖5-B）。褪黑素預(yù)處理組中，GbCAD表達(dá)量在未接菌時與對照相比已有極顯著提高，隨后呈現(xiàn)先降后升再降的變化趨勢（圖5-C）。褪黑素預(yù)處理組中，GbCHI基因表達(dá)量在接菌后呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢，在接菌后12 h 達(dá)到峰值，其相對表達(dá)量在各個時間點均顯著高于對照組，在接菌后6、12、24、48 h 分別是對照的3.12、5.31、3.15、2.10 倍，而對照組中該基因的相對表達(dá)量在接菌后變化不明顯（圖5-D）。GbDFR基因的相對表達(dá)量在褪黑素預(yù)處理組中呈現(xiàn)持續(xù)上升的變化趨勢，接菌后其表達(dá)量均極顯著高于對照組，在接菌后6、12、24、48 h分別是對照的5.03、7.01、23.30、7.21 倍（圖5-E）。GbTT7相對表達(dá)量在褪黑素預(yù)處理組中表現(xiàn)出先升高后下降的變化趨勢，在接菌后12 h 其相對表達(dá)量達(dá)到峰值，是同時期對照的6.38 倍，但在接菌24 h后顯著低于對照組（圖5-F）。結(jié)果表明，褪黑素能夠顯著誘導(dǎo)苯丙烷代謝途徑中關(guān)鍵基因的表達(dá)進(jìn)而提高對枯萎病的抗性。

圖5 褪黑素預(yù)處理對接菌后棉花木質(zhì)素、類黃酮代謝通路相關(guān)基因表達(dá)水平的影響Fig.5 Effects of melatonin pretreatment on the cotton expressions of genes related to phenylpropane metabolic pathway related genes after Fov inoculated

3 討論

3.1 外源褪黑素提高棉花對枯萎病抗性

近年來，褪黑素已作為一種普遍存在的多功能信號分子，在植物受到生物脅迫和非生物脅迫時發(fā)揮作用［22］，但目前未見施用褪黑素提高棉花對枯萎病抗性的報道。在本研究中，用不同濃度（0、10、25、50、75、100 μmol/L）褪黑素誘導(dǎo)棉花后接種枯萎病菌，病情指數(shù)隨褪黑素濃度升高呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，其中50 μmol/L 濃度預(yù)處理后的效果最佳，而100 μmol/L 濃度預(yù)處理組病情指數(shù)則顯著高于其他預(yù)處理組，說明褪黑素對提高棉花枯萎病抗性存在明顯劑量依賴效應(yīng)。夏銘［23］研究發(fā)現(xiàn)不同濃度褪黑素處理的蘿卜幼苗接種鏈格孢菌后，低濃度褪黑素可顯著誘導(dǎo)植株對病菌免疫，而高濃度褪黑素則無顯著性影響，這與本研究結(jié)果一致，但高濃度褪黑素為何作為逆境因素降低棉花對枯萎病抗性的機制還需進(jìn)一步研究。抑菌試驗表明，褪黑素并不會直接影響枯萎菌的生長，但褪黑素預(yù)處理后的棉花幼苗與對照相比卻出現(xiàn)了對枯萎病不同程度的抗性，說明褪黑素通過調(diào)控其他途徑來增強棉花對枯萎病的抗性，這與褪黑素提高對棉花黃萎?。?4］、香蕉果皮炭疽?。?5］、櫻桃番茄灰霉?。?6］的抗病性結(jié)果一致。

3.2 外源褪黑素通過提高抗氧化酶活性來增強棉花對枯萎病抗性

當(dāng)植物受到病原菌脅迫后，會產(chǎn)生大量的活性氧（ROS）來殺死病原菌，但過多的ROS 會造成植物DNA、RNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜嚴(yán)重的氧化損傷［27］。本研究發(fā)現(xiàn)，在接菌后對照組和誘導(dǎo)組中超氧陰離子產(chǎn)生速率和H2O2含量隨著侵染時間的延長而增加，但褪黑素誘導(dǎo)后在一定程度上抑制了侵染后期葉片中超氧陰離子產(chǎn)生速率和H2O2含量。POD、SOD、CAT、APX 是主要的ROS 清除劑，在植物受到病原菌脅迫時能夠迅速的做出響應(yīng)，有效地避免或減少細(xì)胞的氧化損傷，維持一個相對穩(wěn)態(tài)。在本研究中，外源施用褪黑素能夠通過增強這4 種抗氧化酶的活性來提高棉花對活性氧的清除效率，緩解過氧化損傷。Sun 等［16］研究發(fā)現(xiàn)外源褪黑素增強了抗氧化酶活性和抗氧化基因表達(dá)，從而提高了黃瓜對霜霉病的抗性，這與本研究結(jié)果一致。因此外源褪黑素預(yù)處理可以提高POD、SOD、CAT 和APX 活性來維持侵染后期棉花葉片中相對較低的ROS水平，從而減輕接種枯萎病菌后ROS 對棉花造成的傷害。

3.3 外源褪黑素通過提高防御酶活性來增強棉花對枯萎病抗性

PAL 催化苯丙氨酸合成肉桂酸，進(jìn)而產(chǎn)生木質(zhì)素、黃酮、多酚等防御類物質(zhì)，有效的阻礙病原菌的生長和繁殖。PPO 能夠氧化木質(zhì)素前體物質(zhì)，形成有毒性的醌類化合物來抑制病原菌的生長［28］。研究表明，PPO 通過氧化多酚形成奎寧參與植物的防御反應(yīng)［29］。病程相關(guān)蛋白共分為17 個家族，在對病原菌的識別及抗病信號通路的起始上起著極其重要的作用，CHT 和GLU 是其中兩個重要蛋白酶［30］。這兩種酶可以降解病原真菌細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)和葡聚糖，抑制病原菌的生長和孢子的萌發(fā)。本研究發(fā)現(xiàn)，接種枯萎病菌后棉花葉片中PAL、PPO、CHT、GLU活性呈現(xiàn)不同程度的增加，但褪黑素預(yù)處理組棉花受到枯萎病菌脅迫的后期，這4 種酶活性依舊維持在高于對照的水平，有助于提高棉花對枯萎病抗性。Yin 等［21］在研究蘋果抗褐斑病的過程中也發(fā)現(xiàn)外源褪黑素的施用能夠提高這4 種酶活性，在一定程度上提高紅冬果對蘋果褐斑病的抗性。

3.4 外源褪黑素通過激活木質(zhì)素、類黃酮代謝通路相關(guān)基因來增強棉花對枯萎病抗性

苯丙烷代謝途徑是植物三大代謝途徑之一，木質(zhì)素代謝通路及類黃酮代謝通路是其中兩個重要支路［31］。Hou 等［32］通過轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，木質(zhì)素合成相關(guān)基因通過正向調(diào)節(jié)木質(zhì)素合成和提高木質(zhì)素含量來提高棉花對枯萎病的抗性。黃啟秀等［2］研究發(fā)現(xiàn)，在接種枯萎病菌40 h 后，類黃酮代謝通路上的多數(shù)基因在抗病材料中表達(dá)量均顯著高于感病材料，表明類黃酮代謝途徑在棉花抗枯萎病中具有重要作用。Gao 等［33］通過分析對照和褪黑素處理的葡萄DNA 甲基組和轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)，褪黑素在增強類黃酮生物合成和葡萄抗病性中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Li 等［24］研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素通過調(diào)控苯丙烷代謝通路及棉酚合成通路相關(guān)基因的表達(dá)，來提高棉花對黃萎病的抗性。在本研究中，對照組中木質(zhì)素代謝通路GbPAL基因表達(dá)量在枯萎病菌侵染后，略微升高后逐漸下降，但褪黑素預(yù)處理組中該基因的表達(dá)量則保持在一個較高的水平。褪黑素預(yù)處理組中Gb4CL、GbCAD則在接菌前期就表現(xiàn)出較高表達(dá)，推測外源褪黑素可以通過調(diào)控GbPAL、Gb4CL、GbCAD的表達(dá)促進(jìn)木質(zhì)素合成，有效阻止病原菌的侵入。在枯萎病菌整個侵染期間，類黃酮代謝通路GbCHI、GbDFR表達(dá)量在褪黑素誘導(dǎo)組中顯著高于對照組，而GbCAD表達(dá)量在侵染前期高于對照組，后期低于對照組，推測外源褪黑素的施用能夠提高GbCHI、GbDFR、GbTT7的表達(dá)量，增加類黃酮化合物的積累，進(jìn)而提高棉花對枯萎病的抗性。

4 結(jié)論

褪黑素對棉花枯萎病菌的生長沒有明顯抑制作用，外源褪黑素能不同程度提高棉花對枯萎病的抗性，其中50 μmol/L 褪黑素預(yù)處理的棉花抗病性最強。棉花受到枯萎病菌脅迫后，能夠顯著提高抗氧化酶活性清除過量積累的活性氧。此外，外源施用褪黑素還上調(diào)了木質(zhì)素代謝通路及類黃酮代謝通路中關(guān)鍵基因的表達(dá)，提高防御酶活性，從而提高棉花對枯萎病的抗性。