王祥錕 宋學宏 劉金龍 郭培紅 莊曉峰 韋良孟 周凡 張樹宇 高攀攀 魏凱

（1.山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，泰安 271018；2.蘇州大學基礎(chǔ)醫(yī)學與生物科學學院，蘇州 215123；3.山東貝瑞康生物科技有限公司，濰坊 261061；4.昆山貝瑞康生物科技有限公司，昆山215345）

2019年12月，科研人員從肺炎患者中發(fā)現(xiàn)了一種新型冠狀病毒（2019-nCoV），并于2020年1月7日成功分離到毒株，該病毒引起的疾病被命名為“新型冠狀病毒感染肺炎”，其完整的基因組也已經(jīng)向全球公布［1］。系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析顯示，2019-nCoV 是一種從未見過的乙型冠狀病毒，將其列為可以感染人類的冠狀病毒科中的第7 個成員［2-4］。盡管我國新冠肺炎疫情得到了有效控制，但是目前該病毒仍在世界上幾十個國家范圍內(nèi)持續(xù)傳播，嚴重威脅著我國乃至世界人民的生命安全，對世界經(jīng)濟發(fā)展造成了嚴重的影響。

全面防控新型冠狀病毒的感染是當前工作的重中之重，而作為持續(xù)性防控的關(guān)鍵，疫苗、抗體和治療藥物的研發(fā)至關(guān)重要［5］。其中，疫苗的研發(fā)不僅具有重要的現(xiàn)實意義，更具有戰(zhàn)略儲備意義。目前2019-nCoV 的全基因組序列早已經(jīng)公布，我們可以根據(jù)其基因序列預測其保護性抗原表位基因，用以研制基因工程亞單位疫苗。與傳統(tǒng)的滅活疫苗及減毒疫苗相比，基因工程亞單位疫苗更高的抗原含量和純度，且具有特異性強、無感染性、成本低、受限少等多方面的優(yōu)越性，對于烈性傳染病疫苗的研發(fā)是最佳的選擇［6-7］。

為了提高亞單位疫苗的免疫效果，免疫增強劑的篩選和配比也十分重要。免疫增強劑是一種能夠顯著增強抗原的免疫原性，能夠加快抗體產(chǎn)生的速度，提高免疫應答的物質(zhì)。本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)一種從松樹的花粉中提取的天然多糖，能夠顯著增強動物疫苗（如禽流感滅活疫苗、新城疫弱毒疫苗以及多種細菌或病毒的亞單位疫苗）的免疫效果［8-12］。鑒于其優(yōu)良的免疫增強效果，松花粉多糖（PPPS）在人類疫苗和藥物上開發(fā)應用具有較大的潛力。本團隊前期開展了大量的工作，確切了PPPS作為佐劑的免疫增強功效［13］，但是對2019-nCoV 疫苗的免疫增強效果評價還需要進行科學的驗證。本研究成果旨在為新型冠狀病毒肺炎疫苗的研發(fā)提供技術(shù)參考和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 本動物研究由山東農(nóng)業(yè)大學動物Q8 保護利用委員會審定（許可證號：20010510）；6周齡雌性SPF 級BALB/c 小鼠購自于濟南朋悅實驗動物中心。

1.1.2 試劑與設(shè)備 克隆用大腸桿菌DH5α 株、原核表達載體pET28a（+）、表達用大腸桿菌BL21 株均購自上海生工生物有限公司；克隆載體pMD19-T、限制性內(nèi)切酶Ncol/HidIII和EcoR I/XhoI 購自TaKaRa 公司。2019-nCoV-Spike（2019-nCoV- S）的基因序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；2019-nCoV-Nucleocapsid（2019-nCoV- N）的基因序列由廣東省實驗動物監(jiān)測所的叢鋒博士無償提供。泰山松花粉，每年四月采集自泰山山區(qū)，過260 目篩，并進行超微粉碎破壁，黃芪粉購自于藥店。羊抗鼠二抗購自美國earthox 公司；伴刀豆素球蛋白（ConA）、胃蛋白酶、小鼠抗雞CD4-FITC 抗體和小鼠抗雞CD8-RPE 抗體購自Amresco 公司；RPMI-1640 培養(yǎng)液和胎牛血清（FBS）購自Gibco 公司；小鼠外周血淋巴細胞分離液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、CCK-8 購自索萊寶公司；ELISA 試劑盒購自于上海朗頓生物科技公司。

高壓細胞破碎儀（北京迪索）；蛋白質(zhì)高壓制備色譜儀（法國SPOT）；Milipore 超濾系統(tǒng)（Milipore，美國）；流式細胞儀（美國BD 公司）；酶標儀（美國Bio-Tek 公司）。

1.2 方法

1.2.1 pET28a（+）-2019-nCoV- S 和pET28a（+）-2019-nCoV- N 表達載體的構(gòu)建 合成后的2019-nCoV- S 和2019-nCoV- N 基因序列，經(jīng)TA 克隆法連接至pMD19-T 載體，送蘇州金唯智生物科技有限公司測序鑒定。將測序鑒定正確的2019-nCoV- S和2019-nCoV- N 目的片段，分別經(jīng)Ncol/HidIII和EcoR I/XhoI 雙酶切后，插入表達載體pET28a（+）質(zhì)粒，分別獲得重組表達質(zhì)粒pET28a（+）-2019-nCoV- S 和pET28a（+）-2019-nCoV- N。

1.2.2 2019-nCoV- S 和2019-nCoV- N 重組蛋白的誘導表達及純化 將表達載體pET28a（+）-2019-nCoVS 和pET28a（+）-2019-nCoV- N 分別轉(zhuǎn)化E.coliBL21 感受態(tài)細胞，在含卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基中振蕩過夜培養(yǎng)，取培養(yǎng)物按1∶100 的比例接種到2YT 誘導培養(yǎng)基（卡那霉素終濃度100 μg/mL）中，37℃條件下，220 r/min 振蕩培養(yǎng)2 h 后，在培養(yǎng)物中加入IPTG 至終濃度1 mmol/L，28℃，100 r/min培養(yǎng)4 h；離心收集細胞，進行12% SDS-PAGE 分析。

誘導表達的pET28a（+）-2019-nCoV- S/ BL21和pET28a（+）-2019-nCoV- N/ BL21 經(jīng)高壓細胞破碎儀破碎，4℃條件下12 000 r/min 離心10 min，收集沉淀；將沉淀分別用含7 mol/L 尿素的變性緩沖液充分溶解；4℃條件下12 000 r/min 離心20 min，得上清液；親和層析柱進行純化；用Milipore 超濾系統(tǒng)將洗脫液進行超濾濃縮和脫鹽處理，直至洗脫液中不含咪唑及尿素；整個操作在4℃條件下進行。最終獲得純化2019-nCoV- S 和2019-nCoV- N 重組蛋白，采用BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。

1.2.3 PPPS 的制備 按照Wei 等［11］優(yōu)化的步驟進行PPPS 的提取。將破壁的松花粉用濾紙分裝成數(shù)包（50 g/包）并放入索氏提取器中，用乙醚抽提脂肪。將去除脂肪的花粉與去離子水混合（1∶15）放置于水浴鍋中，使其在85℃浸提8 h。將反應后的松花粉懸液冷卻后放置于4℃冰箱中沉淀過夜，棄去沉淀，用濾網(wǎng)過濾上清，再離心上清（10 000 r/min,10 min），用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀加壓濃縮。將濃縮液用Sevag試劑除蛋白，重復2 次，最后用4 倍體積的無水乙醇沉淀多糖，冷凍干燥后得到PPPS。黃芪粉從藥店購買，遵循相同的方法提取黃芪多糖（APS），跳過除脂步驟。

1.2.4 疫苗的制備 重組表達2019-nCoV- S 和2019-nCoV- N 蛋白分別與不同濃度的PPPS 按照相應的體積比混合后加入到組織搗碎機進行混勻，多糖終濃度分別為200、400、800 mg/mL。本試驗免疫程序計劃分3 次免疫，每次免疫時各組疫苗中多糖含量不變，重組蛋白含量梯度增加，分別為50、100 和150 μg/mL。對照組按照終濃度400 mg/mL 的APS 劑量分別與2019-nCoV- S 和2019-nCoV- N 蛋白調(diào)配后用組織搗碎機進行混合均勻，3 次免疫的蛋白濃度也為50、100 和150 μg/mL。

1.2.5 免疫程序 將100 只小鼠分為兩大組：A 組為2019-nCov-S 組，然后再分為5 個小組（I-V 組），每個小組10 只小鼠。I 組：低劑量松花粉多糖組（LPPPS 組）免疫200 mg/mL PPPS-2019-nCoV-S 疫苗，II 組：中劑量松花粉多糖組（MPPPS 組）免疫400 mg/mL PPPS-2019-nCoV-S 疫苗，III 組：高劑量松花粉多糖組（HPPPS 組）免疫800 mg/mL PPPS-2019-nCoV-S 疫苗，IV 組免疫APS-2019-nCoV- S 疫苗，V 組僅免疫純化的加PBS 的2019-nCoV- S 疫苗。B 組為2019-nCoV- N 組，5 個小組分組設(shè)置與2019-nCoV- S 組相同。各組分別免疫3 次，每次間隔兩周；第一次免疫2019-nCoV-S 和2019-nCoV-N 蛋白含量為50 μg/mL，第二次免疫蛋白劑量為100 μg/mL，第三次蛋白劑量為150 μg/mL。免疫方式均為腿部肌肉注射。在第一次免疫后的3、7、14、21、28、35 d采集血液，分離血清，檢測相應指標。

1.2.6 PPPS 佐劑2019-nCoV 亞單位疫苗免疫后特異性IgG 抗體的測定 用間接ELISA 試驗檢測免疫小鼠血清中2019-nCoV- S 和2019-nCoV- N 特異性IgG的抗體滴度，步驟如下：包被：每孔分別100 μL 0.5 μg/mL 2019-nCoV- S 和2019-nCoV- N 蛋白，4℃包被12 h 后PBST 清洗3 次，間隔5 min。封閉：每孔加入200 μL 封閉液（含1% BSA 的PBST），37℃水浴2 h，PBST 清洗3 次。一抗孵育：使用2019-nCoV- S 和2019-nCoV- N 多抗小鼠血清作為一抗，使用封閉液稀釋免疫疫苗后的各組血清，每孔100 μL，37℃水浴2 h，PBST 清洗5 次；二抗孵育：每孔加入100 μL 羊抗鼠酶標二抗（IgG，1∶10 000 稀釋），37℃水浴1 h，PBST 清洗6 次；顯色：每孔加入100 μL TMB 顯色液，37℃水浴避光顯色5 min；終止：每孔加入50 μL 終止液（2 mol/L H2SO4）；讀數(shù)：樣品吸光度（OD490nm）使用酶標儀進行檢測。

1.2.7 PPPS 佐劑2019-nCoV 亞單位疫苗免疫后對小鼠體內(nèi)細胞免疫的影響

1.2.7.1 血清IL-2 含量的檢測 血清IL-2 含量的檢測按照小鼠IL-2 檢測試劑盒說明書進行操作。

1.2.7.2 淋巴細胞轉(zhuǎn)化率測定 小鼠尾根靜脈采集肝素鈉抗凝血0.5 mL，加入等體積的全血稀釋液。取無菌的2 mL 離心管，向其中加入1 mL 淋巴細胞分離液，用巴氏德吸管將血液稀釋液平鋪到分離液液面上方，保持兩液界面清晰。將離心管放置于水平轉(zhuǎn)子離心機中，3 000 r/min，25 min。離心后，用微量加樣器吸取中間層乳白色霧狀的淋巴細胞于無菌的10 mL 離心管中，加入5 mL 細胞洗滌液，1 500 r/min，10 min。傾斜緩慢倒掉上清，加入5 mL PBS 緩沖液，1 500 r/min，10 min，此過程重復2 次。倒掉上清，用含10% FBS、1%青鏈霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)液重懸細胞。取96 孔細胞培養(yǎng)板，每孔加入100 μL 細胞懸液，每組6 孔，周圍加入RPMI-1640 邊緣對照孔。6 孔中3 孔加入25 μL ConA，并放置37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36-48 h，到時向每孔中加入10 μL CCK-8，繼續(xù)放置于細胞培養(yǎng)箱孵育2-4 h，通過酶標儀測定其在490 nm 處的吸光值。根據(jù)公式計算淋巴細胞轉(zhuǎn)換率：LTR=（ConA刺激OD490nm均值-無ConA 刺激OD490nm均值）/對照組OD490nm均值。

1.2.8 PPPS 佐劑2019-nCoV 亞單位疫苗免疫后外周血CD4+T 細胞、CD8+T 細胞的測定 采集新鮮肝素鈉抗凝血1 mL，加入等體積的全血稀釋液得到2 mL的稀釋血液。小心的將上述稀釋血液加到2 mL 淋巴細胞分離液的液面上，要求同1.2.7.2 步驟。取乳白色霧狀的淋巴細胞層，取2 mL 分別置于兩個管中。加PBS 至2 mL 刻度，1 500 r/min，10 min。棄上清，重復兩次。500 μL PBS 重懸沉淀，取50 μL。每樣加20 μL 染料（小鼠抗雞CD4-FITC 和小鼠抗雞CD8-RPE 各10 μL）。4℃避光孵育20 min，上樣，用流式細胞儀測定。

2 結(jié)果

2.1 2019-nCoV- S和2019-nCoV- N重組蛋白的誘導表達

圖1-A 顯示，構(gòu)建成功的pET28a（+）-2019-nCoVS/BL21 克隆株經(jīng)誘導表達后，蛋白電泳圖在53 kD與70 kD 之間顯示出較粗的條帶（泳道2 和泳道4），與預測大小55.68 kD 吻合；pET28a（+）-2019-nCoVN/BL21 經(jīng)誘導表達的蛋白在40-53 kD 顯示出較粗的條帶（泳道6 和泳道8），與預測大小45.64 kD吻合。

圖1-B 和圖1-C 顯示，經(jīng)Ni-NTA 親和層析柱純化后的pET28a（+）-2019-nCoV-S/BL21 和pET28a（+）-2019-nCoV-N/BL21 重組蛋白純度可達90%以上。

圖1 2019-nCoV- S 和2019-nCoV- N 重組蛋白的誘導表達及純化Fig.1 Induced expressions and purifications of recombinant protein 2019-nCoV-S and 2019-nCoV-N

純化蛋白濃度測定：按照BCA 蛋白濃度測定試劑盒說明書測定，以吸光度OD562nm為橫坐標，以標準蛋白BSA 含量為縱坐標繪制標準曲線，見圖2。經(jīng)計算，Ni-NTA 純化后的2019-nCoV- S 重組蛋白濃度為1.12 mg/mL，共得到重組蛋白17.2 mg；2019-nCoV- N 重組蛋白濃度為0.66 mg/mL，共得到重組蛋白10 mg。

圖2 BSA 蛋白濃度測定標準曲線Fig.2 BSA protein concentration determination standard curve

2.2 PPPS佐劑2019-nCoV亞單位疫苗免疫后對特異性IgG抗體的測定結(jié)果

制備的2019-nCoV- S 和2019-nCoV- N 亞單位疫苗免疫后小鼠血清中抗體效價的變化示于圖3。單純的兩種重組蛋白（PBS 組）免疫后抗體效價從14 d 開始升高，但總體上升緩慢，而LPPPS 組、MPPPS 組、HPPPS 組的抗體滴度均快速升高，顯著高于PBS 組（P< 0.05）；在免疫后14-35 d，MPPPS組的抗體效價極顯著高于PBS 組（P< 0.01）；在第35 天，所有組的抗體效價達到峰值。其中，MPPPS組的抗體效價從14-35 d 均為最高，表明400 mg/mL PPPS 作為佐劑增強了2019-nCoV- S 和2019-nCoV- N誘導的IgG 抗體應答。

圖3 疫苗免疫后特異性IgG 抗體的測定結(jié)果Fig.3 Determination of specific IgG antibody after immunization with vaccine

2.3 PPPS佐劑2019-nCoV亞單位疫苗免疫后血清IL-2檢測結(jié)果

如圖4所示，于第一次免疫后的第28-35 天，細胞因子IL-2 的變化趨勢基本與抗體變化保持規(guī)律一致，其中MPPPS 組的IL-2 含量顯著（P< 0.05）高于APS 組、LPPPS 組、HPPPS 組和PBS 組，說明400 mg/mL 的PPPS 有效地提高了兩種亞單位疫苗免疫后小鼠的血清中IL-2 含量。

圖4 疫苗免疫后血清中IL-2 的含量變化Fig.4 Changes of IL-2 content in serum after immunization with vaccine

2.4 PPPS佐劑2019-nCoV亞單位疫苗免疫后淋巴細胞轉(zhuǎn)換率測定結(jié)果

各組淋巴細胞轉(zhuǎn)換率變化結(jié)果見圖5。淋巴細胞轉(zhuǎn)換率反映了小鼠細胞免疫應答水平。在第一次疫苗接種3-35 d 后，無論是2019-nCoV- S 還是2019-nCoV- N 亞單位疫苗，MPPPS 佐劑組T 淋巴細胞轉(zhuǎn)換率均高于APS 組、LPPPS 組、HPPPS 組和PBS 組。第28 天，T 淋巴細胞轉(zhuǎn)換率所有組達到高峰值。結(jié)果表明，400 mg/mL 的PPPS 有效地提高了兩種亞單位疫苗免疫后小鼠的T 淋巴細胞轉(zhuǎn)換率。

圖5 疫苗免疫后外周血淋巴細胞轉(zhuǎn)換率的變化Fig.5 Changes of peripheral blood lymphocyte conversion rate after immunization with vaccine

2.5 PPPS佐劑2019-nCoV亞單位疫苗免疫后CD4+T細胞和CD8+T細胞的測定結(jié)果

各免疫組外周血CD4+T 細胞和CD8+T 細胞含量變化示于圖6。無論是2019-nCoV- S 還是2019-nCoV- N 亞單位疫苗免疫，MPPPS 佐劑組外周血CD4+T 細胞和CD8+T 細胞含量高于APS 組、LPPPS組、HPPPS 組和PBS 組。在免疫后3-28 d，外周血CD4+T 細胞和CD8+T 細胞含量逐漸升高，并在第28 天達到峰值，28-35 d 有所下降。以上結(jié)果表明，400 mg/mL 的PPPS 有效地提高了兩種亞單位疫苗免疫后小鼠的外周血CD4+T 細胞和CD8+T 細胞含量。

圖6 疫苗免疫后外周血CD4+T 和CD8+T 細胞含量的測定結(jié)果Fig.6 Determination of CD4+T and CD8+T cell content in peripheral blood after immunization with vaccine

3 討論

2019年底全球爆發(fā)新型冠狀病毒肺炎疫情，世界衛(wèi)生組織迅速將其定為國際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件［14］，全球疫情防控壓力巨大，因此迫切需要新的預防與治療方法，以有效遏制2019-nCoV 的快速傳播。亞單位疫苗是以合成肽或重組蛋白為基礎(chǔ)制備的疫苗，與滅活或減毒病毒和一些活病毒載體疫苗不同，這種疫苗包含了高濃度的病毒保護性抗原片段，但不包括傳染性病毒粒子，既能夠產(chǎn)生高度特異性的抗體，又消除了滅活不完全、毒力恢復或前期免疫抗體存在干擾的風險［15-16］。亞單位疫苗通常是安全的，不會引起潛在的負面免疫反應，然而，這些亞單位疫苗可能會面臨一些重要的挑戰(zhàn)，主要是因為它們的免疫原性相對較低，必須與適當?shù)淖魟┡浜?，因此高效免疫佐劑的篩選十分重要。

多糖是一種高分子量的碳水化合物，代表著一類主要來源于微生物、動物或植物的生物活性分子，具有多種生理功能，增強和激活巨噬細胞的免疫反應，促進細胞因子和趨化因子的分泌［17］。作為疫苗佐劑，多糖不僅可以促進抗原特異性免疫系統(tǒng)，還可以增強機體的天然免疫功能［18-19］。許多植物多糖，特別是從中草藥中提取的多糖，已經(jīng)成為取代傳統(tǒng)佐劑的極佳候選物質(zhì)，因為植物多糖可以刺激免疫系統(tǒng)從而增強免疫力，比細菌多糖和合成化合物毒性小，副作用少［20-21］。目前，商品化的APS已被添加到口蹄疫病毒、傳染性法氏囊病毒、禽流感病毒等疫苗中，且顯示出良好的佐劑能力［22-23］。本實驗室一直從事PPPS 佐劑的研究，前期研究表明，PPPS 對多種動物疫苗具有顯著的免疫增強作用［24-26］，但是對于新型冠狀病毒疫苗的效果尚未驗證。本研究結(jié)果顯示，PPPS 不論作為2019-nCoV-S還是2019-nCoV- N 重組蛋白的佐劑，均能夠顯著提高二者誘導的免疫應答反應，且效果優(yōu)于同劑量的APS。盡管PPPS 的提取總成本高于APS，但是人用疫苗優(yōu)先考慮效果，因此PPPS 具有成為新型疫苗佐劑的較大潛力。

接種疫苗后誘導產(chǎn)生的抗體效價高低是評價疫苗保護效果的主要標準。從本研究結(jié)果來看，APS佐劑雖然可以促進機體對2019-nCoV 的免疫反應，但同劑量的PPPS 效果優(yōu)于APS，并且400 mg/mL 劑量的PPPS 能夠刺激機體產(chǎn)生更高效價的抗體，因此，PPPS 佐劑會產(chǎn)生更強的保護效果。IL-2 是效應淋巴細胞增殖或分化和調(diào)節(jié)性T 細胞增殖或分化所必需的多效性細胞因子，有抗感染活性［27］。相比APS 佐劑和PBS 對照組，400 mg/mL 劑量的PPPS 顯著提高了血清中IL-2 的含量，因此PPPS 佐劑具有更強的抗感染促進作用。T 淋巴細胞是獲得性免疫的主要效應細胞，廣泛參與從信號識別、抗原提呈，到炎癥因子的釋放、其他免疫細胞的激活和趨化等多個免疫反應過程［28］。淋巴細胞體外轉(zhuǎn)化率和T 細胞亞群（CD4+、CD8+）數(shù)量是反映T 細胞免疫功能的重要指標［29］。在本研究中，400 mg/mL 劑量的PPPS 能夠顯著提高機體的淋巴細胞轉(zhuǎn)化率和CD4+、CD8+T 細胞含量，且效果均優(yōu)于其他各組，表明PPPS 能夠顯著提高機體的細胞免疫功能，這一點對于疫苗佐劑來講非常重要，這是因為很多疫苗良好的免疫保護需要較強的細胞免疫，尤其是殺傷性T細胞（CD8+T 細胞）介導來實現(xiàn)。

綜上所述，本試驗重組表達了兩種2019-nCoV抗原蛋白用于制作亞單位疫苗，并評價了不同濃度PPPS對兩種2019-nCoV亞單位疫苗的免疫增強作用。通過測定各組小鼠的相關(guān)免疫指標，證明了PPPS能夠顯著提高兩種亞單位疫苗的免疫效果，改善機體的免疫功能。因此，PPPS 的優(yōu)良特性使其可以作為2019-nCoV 亞單位疫苗的候選佐劑，從而為新型2019-nCoV 亞單位疫苗的研發(fā)提供理論和技術(shù)支持。

4 結(jié)論

本試驗成功構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒pET28a（+）-2019-nCoV-S 和pET28a（+）-2019-nCoV- N，轉(zhuǎn)入E.coliBL21 之后誘導表達出了大小分別約為55.68 kD 和45.64 kD 的重組蛋白2019-nCoV- S 和2019-nCoV- N。分別制備了含不同濃度PPPS 佐劑的重組蛋白2019-nCoV- S 和2019-nCoV- N 亞單位疫苗，結(jié)果顯示，疫苗免疫小鼠后TPPS 佐劑可以提高抗體效價、血清中IL-2 含量、外周血CD4+T 與CD8+T含量以及T 淋巴細胞轉(zhuǎn)化率，證明PPPS 對疫苗的免疫效果有顯著的提升效果，可以作為2019-nCoV亞單位疫苗佐劑的候選。