章晨昕,于曉明,侯立婷,張元鵬,喬緒穩(wěn),侯繼波,黃克和,鄭其升,陳瑾*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院,江蘇 南京,210095;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院動物免疫工程研究所/國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心,江蘇 南京,210014;3.江蘇省食品質(zhì)量安全重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地,江蘇 南京,210014)

偽狂犬病是由偽狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus,PRV)感染引起的一種急性傳染病,可感染豬、鼠、犬、牛、羊和兔等多種哺乳動物[1]。偽狂犬病多宿主傳播及高致病性給各國養(yǎng)殖業(yè)帶來很大威脅,其作為重要的繁殖障礙類疾病,已被列入國家疫病凈化中長期規(guī)劃[2]。

疫苗免疫是防控偽狂犬病最有效的方式之一,目前商品化偽狂犬病滅活疫苗和活疫苗在國內(nèi)外廣泛應(yīng)用,為豬場提供了強有力保護。與滅活疫苗相比,活疫苗可刺激機體產(chǎn)生更強勁的免疫應(yīng)答,促進機體更早地產(chǎn)生抗體,且抗體持續(xù)時間長,能夠為機體提供更有效的免疫保護[3]。但活疫苗普遍存在散毒及毒力返強等安全隱患,且偽狂犬病毒具有嗜神經(jīng)性,活疫苗免疫后,疫苗毒會在免疫動物的三叉神經(jīng)處潛伏感染,導(dǎo)致利用活疫苗免疫的豬場一直處于隱性感染的狀態(tài),影響豬群健康,也不利于該病的凈化[4]。滅活疫苗安全性高,不會引發(fā)散毒,也不會帶來潛伏感染的問題。但其免疫原性差,不能誘導(dǎo)細胞毒性 T淋巴細胞(CTL)反應(yīng),一般需要高劑量、多次免疫,且有致敏風險[5]。因此,研究改進滅活疫苗的免疫效力,使其能激發(fā)機體產(chǎn)生更強勁免疫應(yīng)答,甚至達到活疫苗免疫保護效力水平,將有利于疫病的安全防控。

2018年8月非洲豬瘟首次傳入我國,疫情迅速大范圍蔓延,對我國養(yǎng)豬業(yè)造成極大的威脅,防控形勢異常嚴峻[6]。利用豬作為實驗動物開展相關(guān)試驗難度較大,利用小鼠作為實驗動物可以更好控制外源病毒干擾,且組內(nèi)和組間差異較小可以更好控制變量[7]。Egawa等[8]利用Miyazaki-Bali/2007(PRV-MB)和PRV-Samal-24E兩種毒株滴鼻感染9周齡的BALB/c小鼠,通過測定病毒載量以及監(jiān)測肺部感染情況,以組織病理學和免疫組化學成功建立小鼠PRV感染模型;臧素芳等[9]利用1×105TCID50PRV疫苗經(jīng)皮下注射免疫小鼠建立偽狂犬人工感染模型,為進一步研究PRV感染小鼠后的天然免疫機制提供試驗依據(jù)。因此,本研究利用PRV Bratha-K61株,建立PRV人工感染小鼠模型;通過評估不同滴度PRV活病毒感染小鼠后的存活率,探究活/滅活病毒接種小鼠后其體內(nèi)抗體水平差異及差異顯著的細胞因子,從而確定PRV感染安全劑量以及篩選最佳感染方式,建立體內(nèi)評價動物模型,為后續(xù)免疫增強劑的篩選和增強機制研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

PRV Bratha-K61株由國家獸用生物制品工程技術(shù)中心保存。6～8周齡SPF級BALB/c小鼠購自揚州大學比較醫(yī)學中心。Angle Gene PRV gB、IL-6、IL-1β、TNF-α試劑盒和IFN-β ELISA 試劑盒均購自南京奧青生物公司。噻唑藍(MTT)、植物血凝素(PHA)購自北京索萊寶生物科技有限公司;二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 PRV Bartha-K61疫苗株滅活

實驗室保存的PRV Bartha-K61株經(jīng)豬睪丸細胞(ST)擴增后收獲,于96孔培養(yǎng)板中測定病毒滴度。分別用甲醛和二乙烯亞胺(BEI)滅活病毒。將適量甲醛加入待滅活病毒EP管中,使甲醛終含量為0.2%(體積分數(shù)),充分混勻后放入振蕩培養(yǎng)箱中,37 ℃、180 r·min-1孵育24 h;將環(huán)化BEI加入待滅活病毒EP管中,調(diào)整其含量到0.05%(體積分數(shù)),充分混勻后放入振蕩培養(yǎng)箱中,30 ℃、100 r·min-1孵育48 h[10]。滅活病毒后進行滅活效果檢測,ST細胞連續(xù)盲傳2代,觀察細胞不出現(xiàn)病變,即滅活成功。

1.3 小鼠感染模型安全劑量及最佳感染方式篩選

不同滴度的PRV Bratha-K61株活病毒(1×106、5×105、1×105、5×104和2.5×104TCID50·mL-1)經(jīng)皮下注射、肌肉注射和腹腔注射(1 mL)感染小鼠;連續(xù)觀察7 d,統(tǒng)計各組小鼠存活率,確定活病毒的感染安全劑量;用安全劑量的活病毒/滅活病毒接種小鼠7 d后檢測各組小鼠血清抗體及細胞因子水平,篩選最佳感染途徑。

1.4 活病毒和滅活病毒接種小鼠早期免疫差異因子的檢測

將最佳感染劑量(5×104TCID50)的PRV Bartha-K61活病毒和滅活病毒(分別用甲醛和BEI滅活)按照最佳感染途徑(皮下)接種小鼠,并設(shè)空白對照組,每組8只。小鼠接種病毒7 d后,從眼球靜脈叢采血,分離血清,冷凍保存,待測。

1.4.1 抗體水平檢測在抗體檢測酶標板中先加入100 μL待測樣品稀釋液,再加入4 μL待檢血清,振蕩混勻,放入25 ℃溫箱孵育30 min;配制的新鮮洗滌液(PBST)并洗滌酶標板4次;配制含30 g·L-1BSA的PBST,加入0.2%山羊抗鼠HRP-IgG,充分混勻,每孔加入100 μL混合液,放入37 ℃溫箱孵育40 min;用洗滌液重復(fù)洗版4次;每孔依次加入50 μL顯色液A和顯色液B,輕輕振蕩混勻,放入37 ℃溫箱避光顯色 10 min,再加入50 μL終止液后,以空白孔調(diào)零,450 nm波長測定各個孔吸光值(D450)。

1.4.2 免疫相關(guān)細胞因子水平的檢測取待檢血清樣本,按照Angle Gene檢測試劑盒說明書測定血清中相關(guān)細胞因子(IL-6、IL-1β、TNF-α和IFN-β)水平。

1.4.3 淋巴細胞增殖試驗小鼠接種病毒7 d后,各試驗組隨機選取3只,分離脾臟,研磨過濾去除紅細胞后,利用含10%胎牛血清、100 IU·min-1青霉素和100 μg·mL-1鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基制備脾細胞懸液。將脾細胞懸液加入96孔板中,用100 μL滅活PRV抗原刺激(滅活前滴度為5×105TCID50·mL-1,PRV加0.2%甲醛在37 ℃溫箱搖床滅活48 h);設(shè)PHA刺激的陽性對照組和細胞對照組。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)44 h后,每孔加入20 μL 5 mg·mL-1MTT,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,離心,加入DMSO避光振蕩,測量D570值。

淋巴細胞刺激指數(shù)(SI)=(刺激孔D570值-細胞對照D570值)/(未刺激孔D570值-細胞對照D570值)。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

利用SPSS 20.0軟件的two-ways ANOVA進行方差分析,用t測驗法檢驗各試驗組間細胞因子濃度差異。采用GraphPad Prism 5繪圖。

圖1 PRV活病毒皮下注射感染小鼠的存活率Fig.1 Survival rate of mice infected with PRV Bratha-K61 by subcutaneous infection

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選最佳感染劑量和感染途徑

將不同滴度的PRV Bratha-K61活病毒分別通過皮下、肌肉和腹腔注射的方式感染小鼠,每天觀察小鼠感染情況,7 d后計算小鼠存活率。結(jié)果顯示(圖1),感染劑量為1×106TCID50組小鼠感染后4 d開始出現(xiàn)死亡;感染劑量為5×105和 1×105TCID50組小鼠感染后4 d開始出現(xiàn)脫毛、瘙癢等癥狀,5 d開始出現(xiàn)死亡;免疫后 7 d,感染劑量為1×106TCID50組小鼠存活率為20%;5×105TCID50組小鼠存活率為50%;1×105TCID50組小鼠存活率為75%;5×104TCID50組小鼠和2.5×104TCID50組小鼠存活率均為100%。

從表1可知:皮下注射時,2.5×104和5×104TCID50病毒滴度為小鼠感染的安全劑量;而腹腔注射和肌肉注射組小鼠在病毒劑量為2.5×104TCID50時存活率僅0和25%。選擇感染劑量為2.5×104TCID50分別經(jīng)皮下注射活病毒和甲醛滅活、BEI滅活PRV Bratha-K61。7 d后,3組存活率均為100%,但激活機體血清抗體水平較低,活/滅活病毒組間抗體水平差異不顯著,如繼續(xù)降低病毒濃度無法激活機體足夠抗體水平,不利于后續(xù)試驗開展。為建立小鼠偽狂犬人工感染模型,探究活/滅活病毒接種小鼠早期免疫相關(guān)因子差異,需要存活率達到100%,故確定5×105TCID50·mL-1為最佳感染劑量,皮下注射為最佳感染方式。

表1 PRV活病毒不同注射方式免疫后小鼠的存活率Table 1 Survival rate of mice infected by different immunization methods of live PRV %

2.2 活/滅活病毒接種7 d后小鼠血清細胞因子和抗體水平比較

2.2.1 血清細胞因子水平比較利用Angle Gene ELISA試劑盒檢測各組血清TNF-α、IL-1β、IFN-β和IL-6水平(圖2)。甲醛滅活組、BEI滅活組、活病毒組和空白對照組TNF-α平均水平分別為57.7、56.4、75.9和47.5 pg·L-1。統(tǒng)計分析表明,甲醛滅活組與BEI滅活組組間血清TNF-α差異不顯著(P>0.05),活病毒組與甲醛/BEI滅活組間血清TNF-α水平差異極顯著(P<0.001);甲醛/BEI滅活組組間血清IL-1β水平差異不顯著(P>0.05),活病毒組與甲醛/BEI滅活組間血清IL-1β水平均差異顯著(P<0.05)。甲醛滅活組、BEI滅活組、活病毒組和空白對照組血清IFN-β平均水平分別為263.9、283.4、296.6和236.6 pg·L-1。統(tǒng)計分析表明,甲醛/BEI滅活組組間血清IFN-β水平差異不顯著(P>0.05),活病毒組與甲醛/BEI滅活組間血清IFN-β水平差異極顯著(P<0.01)。以上結(jié)果表明,活病毒/滅活病毒接種后,小鼠血清中TNF-α、IL-1β 和IFN-β水平差異顯著,IL-6水平差異不顯著,但不同滅活方式對抗體水平和細胞因子水平無顯著影響(P>0.05)。

圖2 PRV活病毒與滅活病毒接種后(7 d)小鼠血清細胞因子水平比較Fig.2 Comparison of serum cytokine levels in mice inoculated with live and inactivated PRV(7 d) F-inactivated:甲醛滅活組Formaldehyde inactivated inoculated;BEI inactivated:二乙酰亞胺滅活組BEI inactivated inoculated;Live virus:Bratha-K61活病毒接種組Bratha-K61 live virus inoculated;Control:空白對照組Blank control. *P<0.05,**P<0.01,***P<0.001. 下同The same below.

2.2.2 血清抗體水平比較從圖3可知:甲醛滅活組、BEI滅活組、活病毒組和空白對照組D450平均值分別為0.24、0.29、0.42和0.10。統(tǒng)計學分析表明,甲醛滅活組與BEI滅活組抗體效價差異不顯著(P>0.05),活病毒組與BEI滅活組抗體效價差異顯著(P<0.05),活病毒組與甲醛滅活組抗體效價差異極顯著(P<0.01)。結(jié)果表明,活病毒和滅活病毒接種小鼠后的血清PRV 特異性 gB抗體(IgG)水平存在顯著差異,且活病毒組抗體水平顯著高于滅活病毒組。

圖4 病毒接種7 d后小鼠脾臟淋巴細胞 刺激指數(shù)(SI)的比較Fig.4 Comparison of spleen lymphocyte stimulation index(SI)in mice inoculated with live and inactivated PRV

圖3 PRV活病毒/滅活病毒接種7 d后小鼠血清 PRV gB抗體(IgG)水平比較Fig.3 Comparison of serum PRV gB antibody(IgG)levels in mice inoculated with live and inactivated PRV

2.3 活/滅活病毒接種7 d后小鼠脾臟淋巴細胞增殖刺激指數(shù)(SI)比較

淋巴細胞刺激指數(shù)(SI)可以初步反映細胞免疫活化情況。各組SI值結(jié)果見圖4。對照組SI值設(shè)為1,甲醛滅活組、BEI滅活組、活病毒組SI平均值分別為1.75、2.08和5.75。統(tǒng)計學分析表明,甲醛滅活組與BEI滅活組SI值差異不顯著(P>0.05),活病毒組與甲醛/BEI滅活組組間SI值均差異極顯著(P<0.001)。結(jié)果表明活病毒感染與滅活病毒接種小鼠相比能夠更好地激活小鼠細胞免疫,且不同滅活方式之間差異不顯著。

3 討論

為了更好地改進偽狂犬滅活疫苗的免疫效力,提高滅活疫苗保護效力。本試驗利用小鼠建立偽狂犬病毒的人工感染模型,為偽狂犬滅活病毒免疫增強劑的篩選和效力評價建立高效平臺,為后續(xù)偽狂犬滅活疫苗效力的改進和其他滅活疫苗免疫增強劑的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

不同劑量病毒經(jīng)不同途徑進入機體后,在激活免疫應(yīng)答方面有極大差異[11]。本研究顯示,同等劑量下不同免疫途徑對小鼠存活率的影響較大,與皮下注射5×104TCID50PRV(存活率100%)相比,肌肉注射(存活率為12.5%和25%)和腹腔注射(存活率均為0)小鼠存活率顯著下降。范克偉等[12]利用皮下腹股溝注射不同劑量PRV病毒感染小鼠,發(fā)現(xiàn)接種高劑量病毒的小鼠體重下降更快,更早出現(xiàn)臨床癥狀且癥狀更明顯,死亡率更高,偽狂犬病毒具有典型的神經(jīng)嗜性,腹腔、肌肉組織中以及免疫細胞、神經(jīng)和血管都非常豐富,有利于抗原的擴散,導(dǎo)致發(fā)病和死亡。本試驗在保證免疫源性足夠,且小鼠存活率達到較高水平下,成功建立了活/滅活抗原的感染和差異評價模型?；畈《?滅活病毒進入機體后,在激活免疫應(yīng)答方面有極大差異[13]。Sander等[14]發(fā)現(xiàn)滅活菌與活菌感染小鼠后,檢測小鼠血清相關(guān)細胞因子水平,其中TNF-α、IL-1β和IFN-β水平差異顯著,并得出差異因子與生存能力相關(guān)模式識別受體相關(guān)的結(jié)論。本試驗中,活病毒與滅活病毒免疫小鼠7 d后,檢測小鼠血清中與先天免疫相關(guān)細胞因子水平,其中活病毒組小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IFN-β水平顯著高于滅活病毒組(P<0.05)。這3類細胞因子均與vita-PAMP引起的差異因子一致,而與vita-PAMP 無關(guān)的炎性細胞因子 IL-6 的水平差異不顯著。甲醛通過破壞病毒蛋白及核酸達到滅活病毒目的;BEI只破壞病毒核酸而不破壞蛋白質(zhì)。BEI滅活與甲醛滅活相比可更好保持病毒免疫原性,但試驗結(jié)果顯示不同滅活方式間細胞因子水平差異不顯著。vita-PAMP作為一種僅存在于活性微生物中的危險信號,進入機體后使得先天免疫細胞能夠區(qū)分活的和死的微生物,并僅對活微生物動員產(chǎn)生高效免疫反應(yīng)[15]。本試驗中,當活病毒進入機體后能夠高效激活機體天然免疫應(yīng)答,這與vita-PAMP的存在密切相關(guān)[15-16]。這為后續(xù)在偽狂犬滅活苗中免疫增強劑研制中提供了研究方向。

PRV gB蛋白是PRV最保守的蛋白之一,可產(chǎn)生有效保護易感動物感染的中和抗體,具有較高的特異性和敏感性,也是國際貿(mào)易檢測PRV的指定方法[17-18]。本試驗比較活病毒和滅活病毒免疫小鼠后其體內(nèi)短期血清gB抗體水平的結(jié)果顯示,活病毒組小鼠產(chǎn)生抗體水平顯著高于滅活病毒組(P<0.01)。試驗結(jié)果為后續(xù)評價免疫增強劑對偽狂犬滅活疫苗抗體水平的影響提供了有的效評價方法。

淋巴細胞增殖和分化是機體免疫應(yīng)答過程的一個重要階段,檢測淋巴細胞增殖水平是反映細胞免疫應(yīng)答的常用方法之一。淋巴細胞刺激指數(shù)(SI)升高提示機體產(chǎn)生更強勁的細胞免疫反應(yīng)[19]。本研究證明活病毒組SI極顯著高于滅活病毒組。免疫增強劑發(fā)揮作用可通過SI值顯著增加來反映細胞免疫水平的提升。這說明活病毒和滅活病毒進入機體后,活病毒能夠更高效的激活細胞免疫應(yīng)答。類似活病毒免疫后產(chǎn)生的細胞免疫應(yīng)答,是更有效和期待的免疫應(yīng)答方向。

綜上,本研究成功建立了安全的活/滅活病毒小鼠感染模型,并確定了活/滅活病毒進入機體后,活病毒會刺激機體產(chǎn)生的更高水平抗體和相關(guān)免疫因子,并且與vita-PAMPs分子所引起的免疫差異一致。這為后續(xù)偽狂犬滅活疫苗免疫效力的改進提供了指導(dǎo)方向。