安玉川，成 榮，孫 蕾，桑勝波

(1.太原理工大學(xué) a.微納傳感與人工智能感知山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，b.新型傳感器與智能控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030024；2.山西省六維人工智能生物醫(yī)學(xué)研究院，太原 030031)

時至今日，神經(jīng)損傷引發(fā)的神經(jīng)功能障礙仍嚴(yán)重影響人類的健康與生活[1]。在過去的幾十年中，許多天然聚合物(如膠原[2]、絲素蛋白[3])及合成聚合物[4]被開發(fā)并成功用于周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)。但效果仍然不如自體移植物，這是由于未達(dá)到周圍神經(jīng)修復(fù)的黃金標(biāo)準(zhǔn)[4-5]。因此，開發(fā)用于神經(jīng)再生的組織工程構(gòu)建物仍具有很大的研究和臨床價值[6]。

在20世紀(jì)80年代，有研究者將硅膠管成功應(yīng)用于臨床修復(fù)，但是它不可降解的特性，降低了神經(jīng)修復(fù)效果，不利于神經(jīng)組織的生長。因此，人們開始使用可降解的生物材料來制造神經(jīng)組織工程構(gòu)建物，如明膠、殼聚糖和海藻酸鈉等，這類材料被廣泛應(yīng)用，但是其在機(jī)械性能方面仍有缺失。近年來，SOUCY et al[7]使用光固化明膠(GelMA)和甲基丙烯酰胺取代的彈性蛋白原(MeTro)的合成制備可調(diào)節(jié)的機(jī)械性能神經(jīng)組織工程構(gòu)建物，具有良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但該材料制作成本高，機(jī)械性能調(diào)節(jié)范圍較小，仍具有一定的局限性。因此，研究可調(diào)節(jié)機(jī)械性能的復(fù)合生物材料仍有價值。

GelMA是一種以明膠為基底，通過接枝反應(yīng)使得甲基丙烯酸酐基團(tuán)接入，進(jìn)而生成可由藍(lán)光引發(fā)聚合凝膠的生物合成材料[8]，具有良好的生物相容性和生物降解性，被廣泛應(yīng)用于生物組織再生，包括關(guān)節(jié)組織[9]、心肌組織[10]等。但是，這種水凝膠在體內(nèi)降解速率過快[11]，且機(jī)械性能較弱[12]，不利于神經(jīng)組織細(xì)胞長期的黏附。

聚丙烯酰胺(PAM)是一種親水性好且柔韌強(qiáng)的生物合成材料[13]，具有良好的機(jī)械性能和可控的降解性能[14]，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)及醫(yī)藥[15-18]領(lǐng)域。通過添加催化劑可激發(fā)PAM本身的光固化特性，提高復(fù)合水凝膠的可塑性，并且改變PAM的比例，可實(shí)現(xiàn)復(fù)合水凝膠的彈性調(diào)節(jié)[19-21]。然而，純PAM水凝膠材料生物相容性較差，不適合作為組織工程神經(jīng)構(gòu)建物。

綜上所述，本文根據(jù)兩種材料的特點(diǎn)，制備了 GelMA-PAM復(fù)合水凝膠作為雪旺細(xì)胞的體外三維生長環(huán)境，并表征了不同比例GelMA-PAM復(fù)合水凝膠的形貌、理化性能和機(jī)械性能，同時測試了雪旺細(xì)胞在復(fù)合水凝膠上的體外生長狀況，評估了支架對雪旺細(xì)胞生長、分化的影響，優(yōu)化了復(fù)合水凝膠的混合比例，制備出機(jī)械性能強(qiáng)且生物相容性好的組織工程神經(jīng)構(gòu)建物。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料制備

1.1.1GelMA制備

由文獻(xiàn)[22]可知，明膠與甲基丙烯酸酐(MA)能夠發(fā)生接枝反應(yīng)，將甲基丙烯基團(tuán)引入到明膠上，得到可由紫光引發(fā)聚合的GelMA.具體操作方法如下：稱取5 g明膠加入到50 mL磷酸緩沖鹽溶液(PBS溶液)中；將溶液整體移至50 ℃水浴鍋中使明膠完全溶解，配成10%的明膠溶液；將8 mL的MA以1 mL/min的速度加入到10%的明膠溶液中，并且將上述溶液在50 ℃水浴鍋中攪拌反應(yīng)3 h；隨后加入200 mL的PBS溶液(預(yù)熱至50 ℃)，用于稀釋MA與明膠的反應(yīng)溶液；4 h后將反應(yīng)液裝入12～14 ku的透析袋中；6 d后將反應(yīng)液離心，取上清液冷凍干燥得到GelMA.

1.1.2GelMA-PAM復(fù)合水凝膠制備

首先將5 mg藍(lán)光引發(fā)劑溶于超純水1 mL中配置成質(zhì)量濃度為0.5%的溶液；加入100 mg GelMA配置成10%的光交聯(lián)明膠溶液。然后向溶液加入預(yù)定比例的丙烯酰胺(AM)單體，攪拌均勻后，倒入直徑為100 mm的圓形模具中，在紫外燈下照射1 min，固化聚合成GelMA-PAM復(fù)合水凝膠支架。GelMA-PAM混合比例如表1所示。

表1 GelMA和PAM的混合比例Table 1 Ratio of PAM and GelMA

1.2 GelMA-PAM復(fù)合水凝膠的性能測試

1.2.1傅里葉變換紅外光譜

使用紅外光譜儀(德國，布魯克光譜，Tensor 27)分析水凝膠的紅外光譜。通過KBr壓片法得到樣品的傅里葉變換紅外光譜(FTIR).在4 cm-1分辨率下對每個樣品在400～4 000 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，每個樣品總共掃描了64次。

1.2.2溶脹率測試

先將GelMA-PAM復(fù)合水凝膠支架用天平稱重(記為w0)，再浸入37 ℃的PBS溶液中浸泡。分別在浸泡1，3，6，12 h后，將支架取出，吸出表面多余水分，測定此時的支架重量為w1，根據(jù)如下公式(1)

wS=[(w1-w0)/w0]×100% .

(1)

計算出不同時間間隔的溶脹率以及溶脹平衡狀態(tài)下的溶脹率。

1.2.3機(jī)械性能測試

通過電子材料試驗(yàn)機(jī)(美國，Instron公司，Instron 3343)測定GelMA-PAM復(fù)合支架的應(yīng)力-應(yīng)變曲線。在室溫下，以0.5 mm/min的恒定速率壓縮樣品，采用變形5%～20%時的應(yīng)力-應(yīng)變曲線斜率來計算楊氏模量，每個樣品測量3次取平均值。

1.2.4支架形貌分析

用掃描電子顯微鏡(日本，高新公司，SU8000)分析不同混合濃度比例的復(fù)合水凝膠支架形貌。首先將復(fù)合材料支架冷凍干燥，再將支架進(jìn)行噴金處理，最后在12～15 kV加速電壓下觀察支架的微觀形態(tài)。

1.2.5孔隙率表征

首先制作不同比例的水凝膠支架各3個，測量其體積V；放入PBS溶液中浸泡至完全溶脹后測量重量記為w3；將水凝膠放入無水乙醇中，完全析出水分后，測量重量為w2；根據(jù)公式(2)計算出孔隙率并取平均值，其中ρ為酒精的密度[23]。

wp=[(w3-w2)/(ρ×V)]×100% .

(2)

1.2.6細(xì)胞活性檢驗(yàn)

在制作水凝膠支架時，將PBS溶液替換為Gibco高糖培養(yǎng)基DMEM，同時通過培養(yǎng)液中的酚紅指示劑來調(diào)節(jié)溶液的pH值，增加材料支架富含的營養(yǎng)；將溶液經(jīng)過濾頭做除菌處理，制備成無菌的水凝膠支架；將水凝膠支架放入24孔板中用培養(yǎng)液浸泡24 h，去除未交聯(lián)的丙烯酰胺單體和催化劑；將第三代大鼠雪旺細(xì)胞以105 cm-2的密度接種在GelMA-PAM混合支架上，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；分別在1，3，5 d進(jìn)行細(xì)胞活性檢測。細(xì)胞活性檢測實(shí)驗(yàn)步驟如下：首先將支架用PBS沖洗兩次，加入活細(xì)胞染色試劑(Calcein-AM)染色孵育1 h；用PBS清洗3次，加入死細(xì)胞染料試劑(PI)染色0.5 h；將支架用PBS溶液清洗3次，放置于細(xì)胞成像多功能微孔板檢測系統(tǒng)(美國，伯騰儀器有限公司，Cytation 5)中觀察。

1.2.7細(xì)胞增殖檢驗(yàn)

細(xì)胞接種過程與細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)相同。在1，3，5 d分別檢測了CCK-8的光度值，觀察細(xì)胞增殖的情況。具體操作過程如下：首先將24孔板內(nèi)的培養(yǎng)液吸出，同時用PBS溶液將細(xì)胞清洗3次；將配置好的CCK-8染色劑加入24孔板中；將孔板重新放入培養(yǎng)箱中孵育3 h；將孵育后的100 μL染色劑移入96孔板內(nèi)并除去氣泡；放入細(xì)胞成像多功能微孔板檢測系統(tǒng)中測量其吸光度。

1.2.8細(xì)胞形態(tài)檢測

將接種到支架上的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞骨架染色實(shí)驗(yàn)，觀察不同比例支架上的細(xì)胞形態(tài)，統(tǒng)計細(xì)胞的伸長情況。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：將培養(yǎng)3 d的水凝膠支架與細(xì)胞用PBS清洗預(yù)處理后待用；在24孔板中加入體積分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛將支架固定20 min；加入TritonX-100通透液通透20 min；在避光條件下加入鬼閉環(huán)太染色試劑，并在室溫條件下孵育40 min；用PBS清洗后加入細(xì)胞核DAPI染劑避光孵育10 min；最后用PBS清洗干凈，置于細(xì)胞成像多功能微孔板檢測系統(tǒng)中拍照觀察。

1.2.9細(xì)胞免疫檢測

將接種到支架上的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞免疫檢測，觀察不同比例支架上的細(xì)胞分化的形態(tài)。將培養(yǎng)3 d后的復(fù)合材料支架進(jìn)行預(yù)處理，過程如下：先用PBS清洗，再加入4%的多聚甲醛固定20 min，最后加入TritonX-100通透20 min.細(xì)胞免疫檢測實(shí)驗(yàn)過程如下：首先在室溫條件下加入體積分?jǐn)?shù)5%山羊血清封閉1 h；在4 ℃條件下加入S100B Rabbit pAb一抗溶液過夜；第二天在室溫條件下加入羊抗兔二抗溶液孵育1 h；用PBS清洗并加入DAPI染劑避光孵育10 min；最后用PBS清洗干凈，置于細(xì)胞成像多功能微孔板檢測系統(tǒng)中拍照觀察。

2 結(jié)果與討論

2.1 GelMA-PAM水凝膠支架成分分析

圖1 GelMA-PAM、AM、GelMA的紅外光譜圖Fig.1 Infrared spectra of GelMA-PAM, AM, and GelMA

2.2 GelMA-PAM復(fù)合水凝膠形貌分析

通過掃描電子顯微鏡測試，觀察復(fù)合水凝膠支架的內(nèi)部結(jié)構(gòu)以及孔隙的大小。如圖2所示，純GelMA與3種不同比例的復(fù)合水凝膠都具有良好的通孔結(jié)構(gòu)，這種通孔結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞的黏附以及營養(yǎng)的交換，且孔徑的大小隨著PAM比例的增加而減小。純GelMA水凝膠的平均孔徑約為100～200 μm；而GelMA與PAM比例為1∶0.25時，水凝膠的平均孔徑略有減??；當(dāng)兩者比例為1∶0.5時，水凝膠的平均孔徑減小為80 μm左右；當(dāng)比例為1∶1時，水凝膠的平均孔徑只有50 μm左右。該現(xiàn)象是因?yàn)樵贕elMA-PAM水凝膠交聯(lián)的過程中，GelMA與AM單體、GelMA自身以及AM單體分別交聯(lián)成孔，形成雙網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，且該結(jié)構(gòu)會隨AM質(zhì)量濃度的增加而加強(qiáng)，從而減小復(fù)合水凝膠的平均孔徑。

圖2 GelMA-PAM復(fù)合水凝膠支架不同比例的SEM圖Fig.2 SEM images of different scales of GelMA-PAM composite hydrogel scaffolds

2.3 GelMA-PAM水凝膠支架理化特性

檢測復(fù)合水凝膠的溶脹性和孔隙率，分析復(fù)合水凝膠的理化特性。圖3(a)展示了不同時間段內(nèi)水凝膠的溶脹率，在1～3 h內(nèi)，PAM濃度比例越高的支架，溶脹的速率越快。從整個時間段來看，GelMA-PAM復(fù)合水凝膠的溶脹率一直高于純GelMA水凝膠的溶脹率。當(dāng)浸泡至12 h，所有水凝膠達(dá)到溶脹平衡保持不變。這表明了復(fù)合水凝膠支架對細(xì)胞營養(yǎng)液有較好的吸收作用。圖3(b)記錄了水凝膠在溶脹平衡時的溶脹率，純GelMA水凝膠的平衡溶脹比為5.6，而GelMA-PAM復(fù)合水凝膠的平衡溶脹比可達(dá)到11.1，接近于純GelMA水凝膠的兩倍，說明復(fù)合水凝膠具有更好的親水性。這是因?yàn)镻AM鏈具有良好的親水性，而復(fù)合水凝膠中具有大量PAM鏈網(wǎng)絡(luò)，從而提高了水凝膠的保水性，可以更好地儲存細(xì)胞所需的培養(yǎng)液。

不同濃度比例的復(fù)合水凝膠孔隙率如圖4所示。從圖中可知純GelMA水凝膠的孔隙率為50%左右，且隨著PAM濃度的增加，水凝膠的孔隙率下降。這是因?yàn)镻AM中AM交聯(lián)產(chǎn)生了PAM鏈網(wǎng)格，因此，水凝膠的交聯(lián)密度隨PAM濃度的增加而上升，從而導(dǎo)致孔隙直徑的縮小以及孔隙率的減小，這與支架的微觀內(nèi)部結(jié)構(gòu)分析結(jié)果相同。

2.4 GelMA-PAM復(fù)合水凝膠機(jī)械性能

純GelMA水凝膠與GelMA-PAM復(fù)合水凝膠的壓縮應(yīng)力-應(yīng)變曲線如圖5所示。圖5(a)為應(yīng)力-應(yīng)變曲線，在應(yīng)變5%～20%范圍內(nèi)應(yīng)力曲線的斜率代表了復(fù)合水凝膠的韌性，斜率越大韌性越高。由此可以看出，混合比例為1∶1的GelMA-PAM混合水凝膠韌性最強(qiáng)，且隨著PAM比例下降，應(yīng)力-應(yīng)變曲線斜率下降，證明了PAM的引入提高了復(fù)合水凝膠的韌性。圖5(b)為水凝膠的楊氏模量，通過對比，1∶1的GelMA-PAM混合水凝膠表現(xiàn)了出了極高的強(qiáng)度，是純GelMA水凝膠的10倍以上。這是因?yàn)橐环矫鍼AM本身就具有良好的韌性與楊氏模量，它的加入使復(fù)合水凝膠機(jī)械性能提高；另一方面，根據(jù)2.2的討論可知，PAM質(zhì)量濃度增加，水凝膠孔徑減小、孔壁增厚，從而提高了水凝膠的抗壓能力。這為神經(jīng)細(xì)胞的黏附提供了良好的支撐環(huán)境。

圖中*表達(dá)p<0.01有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異圖3 GelMA-PAM復(fù)合水凝膠支架不同比例濃度0～12 h溶脹率及最終溶脹率Fig.3 Swelling rate and final swelling ratios of GelMA-PAM composite hydrogel scaffolds at different proportions and concentrations from 0 to 12 h

圖中**表達(dá)p<0.01有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異圖4 GelMA-PAM復(fù)合水凝膠支架不同濃度比例的孔隙率Fig.4 Porosity of GelMA-PAM composite hydrogel scaffolds with different concentration ratios

圖中***表達(dá)p<0.01有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異圖5 GelMA-PAM復(fù)合水凝膠支架不同濃度比例的應(yīng)力-應(yīng)變曲線及楊氏模量Fig.5 Stress-strain curves and Young’s modulus of GelMA-PAM composite hydrogel scaffolds at different concentration ratios

2.5 GelMA-PAM水凝膠支架生物相容性

為了研究復(fù)合水凝膠支架的生物相容性，筆者對復(fù)合水凝膠進(jìn)行了生物活性檢測。圖6為細(xì)胞的活死染色圖，綠色代表活性細(xì)胞，紅色代表死細(xì)胞。筆者發(fā)現(xiàn)隨著復(fù)合水凝膠中PAM濃度增加，細(xì)胞的總體數(shù)量與密度均下降。但當(dāng)PAM質(zhì)量濃度為2.5%時，支架的細(xì)胞活性檢測與純GelMA水凝膠差距較小，這兩組支架上的細(xì)胞分布均勻，細(xì)胞族群呈分散性分布。而GelMA-PAM(1∶0.5)和GelMA-PAM(1∶1)的支架都呈現(xiàn)出了雪旺細(xì)胞的聚集。通常均勻分散的細(xì)胞群有利于細(xì)胞生存功能的表達(dá)。因此，上述結(jié)果表明，適宜的PAM濃度并不會影響復(fù)合水凝膠的生物相容性，對雪旺細(xì)胞的生長行為無不良影響。

細(xì)胞的活性圖如圖7所示，這是通過測量CCK-8吸光度量化細(xì)胞的數(shù)目。通過對比發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時間的增加，除了PAM質(zhì)量濃度10%的復(fù)合水凝膠在第5 d時細(xì)胞數(shù)量減少，其余比例水凝膠中細(xì)胞數(shù)量均增加。這一結(jié)果與細(xì)胞活性檢測結(jié)果基本一致。綜上，兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明在當(dāng)PAM的質(zhì)量濃度為2.5%時，GelMA-PAM復(fù)合水凝膠支架生物兼容性良好，可以促進(jìn)雪旺細(xì)胞的附著與生長。對GelMA-PAM復(fù)合水凝膠支架上的細(xì)胞進(jìn)行了細(xì)胞骨架染色，如圖8所示，綠色熒光代表了細(xì)胞骨架形態(tài)，藍(lán)色熒光代表了細(xì)胞核的形態(tài)。由圖8可以看出，所有水凝膠支架上的細(xì)胞均有不同程度的伸展，大部分細(xì)胞的形態(tài)由圓形變成梭形，這是雪旺細(xì)胞分裂期生長的典型特征。尤其在GelMA-PAM(1∶0.25)的支架上細(xì)胞的長度伸展到平均80 μm左右，證明了該復(fù)合材料支架對雪旺細(xì)胞有很好的黏附和支撐作用。

圖6 GelMA-PAM復(fù)合水凝膠上細(xì)胞活死染色圖Fig.6 Staining of live and dead cells on GelMA-PAM composite hydrogels

細(xì)胞的免疫熒光染色如圖9所示，通過S100B特定蛋白的染色表達(dá)，反映了雪旺細(xì)胞的分化蛋白表達(dá)情況。綠色熒光代表特定蛋白在細(xì)胞中的分布情況，藍(lán)色為細(xì)胞核的位置。圖中各比例支架上的細(xì)胞均有特定分化蛋白的表達(dá)，證明了復(fù)合材料支架能夠支撐雪旺細(xì)胞的分化。對比不同比例的復(fù)合水凝膠支架， GelMA-PAM(1∶0.25)支架比其他支架的雪旺細(xì)胞輪廓清楚，蛋白染色表達(dá)清晰，說明該支架具有更好的雪旺細(xì)胞相容性。

圖7 GelMA-PAM復(fù)合水凝膠上細(xì)胞活性Fig.7 Graph of cell viability on GelMA-PAM composite hydrogels

綜上所述，GelMA與PAM比例為1∶0.25的復(fù)合水凝膠在機(jī)械性能上優(yōu)于純GelMA水凝膠，同時具有良好的細(xì)胞相容性，且雪旺細(xì)胞在該支架上的增殖和分化效果良好。因此，GelMA-PAM(1∶0.25)復(fù)合水凝膠可作為支撐雪旺神經(jīng)細(xì)胞存活、生長、發(fā)育的基底材料。

3 結(jié)論

通過制備不同比例的GelMA-PAM復(fù)合水凝膠支架，并對其形貌、理化特性、機(jī)械性能及體外的生物相容性、神經(jīng)細(xì)胞軸突的分化情況進(jìn)行了測試。結(jié)果表明當(dāng)GelMA與PAM比例為1∶0.25時，復(fù)合水凝膠支架具有良好的理化性能和機(jī)械性能，同時支架上的雪旺細(xì)胞可以進(jìn)行良好的生長與分化。因此，本文構(gòu)建的GelMA-PAM復(fù)合水凝膠材料兼顧了支架的機(jī)械性能和生物相容性，可作為一種理想的組織工程神經(jīng)構(gòu)建物。

圖8 GelMA-PAM復(fù)合水凝膠上細(xì)胞骨架染色圖Fig.8 Cytoskeleton staining on GelMA-PAM composite hydrogels

圖9 GelMA-PAM復(fù)合水凝膠上細(xì)胞的免疫熒光染色圖Fig.9 Immunofluorescence staining of cells on GelMA-PAM composite hydrogels