王麗 張瑞

鄭州市第六人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，鄭州 450015

肝硬化系由飲酒、乙型或丙型肝炎及自身免疫性疾病等一種或多種病因引發(fā)的慢性彌漫性肝臟病變，隨疾病進(jìn)行性發(fā)展可誘發(fā)肝性腦病、消化道出血或自發(fā)性腹膜炎等并發(fā)癥，可對患者健康造成嚴(yán)重威脅［1-4］。據(jù)全球疾病負(fù)擔(dān)（GBD）調(diào)查研究指出，全球肝硬化患者年齡標(biāo)化發(fā)病率為132.5/10萬［5］。而基于我國調(diào)查研究顯示肝硬化發(fā)病率為424.4/10萬，呈逐年上升趨勢，且以15～49歲男性高發(fā)［6］。故現(xiàn)今防治重點(diǎn)在于早期發(fā)現(xiàn)及有效治療。自Marshall學(xué)者于1988年首次提出“腸-肝軸”概念以來，陸續(xù)有研究顯示腸道微生態(tài)改變可一定程度反映肝硬化發(fā)生、發(fā)展［7-10］。鑒于目前研究多采用傳統(tǒng)技術(shù)（糞便細(xì)菌培養(yǎng)）及分子生物學(xué)技術(shù)［實(shí)時熒光定量PCR（RT-PCR）、宏基因組測序等］，但存在相應(yīng)局限，譬如糞便細(xì)菌培養(yǎng)耗時耗力，且易受外界因素影響，分子生物學(xué)技術(shù)費(fèi)用高昂，操作復(fù)雜，且結(jié)果準(zhǔn)確性依賴數(shù)據(jù)庫及算法，故難以于臨床廣泛應(yīng)用［11-12］?？紤]腸道微生態(tài)改變不僅包括菌群變化，還與腸黏膜通透性密切相關(guān)。茲本文旨在尋求腸黏膜通透性特異性指標(biāo)，并進(jìn)一步分析其與肝硬化及肝功能分級的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

資料與方法

1.一般資料

以2020年11月至2022年4月經(jīng)鄭州市第六人民醫(yī)院收治肝硬化患者96例為觀察組，按Child-Pugh肝功能分級分為A、B、C 3個亞組；同期選擇無肝硬化的健康體檢者40例為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合《肝硬化診治指南》中有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)［13］；（2）臨床資料完備；（3）經(jīng)招募受試者自愿參與研究，并簽訂同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）伴發(fā)惡性腫瘤；（2）妊娠哺乳期女性；（3）合并嚴(yán)重心、腦、腎等器質(zhì)性病變；（4）患有自身免疫性疾患；（5）近期（＜4周）抗生素、胃腸動力藥或生物制劑服用史；（6）罹患炎癥性腸病、功能性消化不良等胃腸道疾病。

本研究經(jīng)鄭州市第六人民醫(yī)院倫理委員會審批通過（20200616）。

2.亞組分組依據(jù)

觀察組依據(jù)Child-Pugh肝功能分級劃分亞組，若分級評分5～6分，計(jì)為A級，歸入A組（35例）；若分級評分7～9分，計(jì)為B級，歸入B組（43例）；若分級評分≥10分，計(jì)作C級，歸入C組（18例）。

3.方法

（1）腸道主要菌群變化測定方法：入組患者于排便后2 h收集糞便標(biāo)本并儲放于密閉盒內(nèi)備用。用天平稱取0.5 g用生理鹽水作定量稀釋，并于選擇培養(yǎng)基進(jìn)行接種作細(xì)菌培養(yǎng)，培養(yǎng)細(xì)菌種類包括腸桿菌、腸球菌、乳桿菌、雙歧桿菌等。使用VTTEK-AMS型全自動微生物鑒定分析系統(tǒng)（法國梅里埃公司）用以細(xì)菌鑒定及數(shù)目定量。公式：數(shù)目≈lg菌落形成單位（CFU）/g。（2）腸黏膜通透性指標(biāo)測定方法：入組患者于翌日清晨空腹?fàn)顟B(tài)下行5 ml肘靜脈血收集，作離心處理（轉(zhuǎn)速3 000 r/min，時間10 min，離心半徑13.5 cm），分離血清后采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定D-乳酸（D-LAC）、內(nèi)毒素（ETX）及二胺氧化酶（DAO）等腸黏膜通透性指標(biāo)，試劑盒均購自上海晶抗生物工程有限公司，嚴(yán)格按說明書規(guī)范操作。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 22.0軟件對收集匯總數(shù)據(jù)作統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料經(jīng)Kolomgorov-Smirnov檢驗(yàn)均符合正態(tài)分布，以（）表示，多組間比較行F檢驗(yàn)，兩組間行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，行χ2檢驗(yàn)，行Pearson相關(guān)性分析分析腸黏膜通透性指標(biāo)之間的相關(guān)性，行Spearman相關(guān)性分析分析腸黏膜通透性指標(biāo)與Child-Pugh肝功能分級的相關(guān)性，并使用受試者工作特征曲線（ROC）分析腸黏膜通透性指標(biāo)的預(yù)測價值，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.基線資料比較

4組性別、年齡及A、B、C組病因比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表1。

表1 肝硬化患者與健康體檢者基線資料比較

2.腸道主要菌群變化比較

A、B、C組腸桿菌、腸球菌數(shù)目高于對照組，乳桿菌、雙歧桿菌數(shù)目低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；隨Child-Pugh肝功能分級提高，腸桿菌、腸球菌數(shù)目呈上升趨勢，乳桿菌、雙歧桿菌數(shù)目呈下降趨勢，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見表2。

表2 肝硬化患者與健康體檢者腸道主要菌群變化比較（lgCFU/g，）

表2 肝硬化患者與健康體檢者腸道主要菌群變化比較（lgCFU/g，）

注：對照組為無肝硬化的健康體檢者，A組為Child-Pugh分級A級肝硬化患者，B組為Child-Pugh分級B級肝硬化患者，C組為Child-Pugh分級C級肝硬化患者；與對照組比較，aP＜0.05；與A組比較，bP＜0.05；與B組比較，cP＜0.05

乳桿菌9.85±1.01 9.08±0.63a 8.60±0.48ab 8.04±0.76abc 22.325＜0.001組別對照組A組B組C組F值P值例數(shù)40 35 43 18腸桿菌8.12±0.68 8.61±0.42a 8.95±0.39ab 9.22±0.56abc 20.126＜0.001腸球菌7.18±0.71 7.75±0.46a 8.42±0.87ab 9.28±0.63abc 30.248＜0.001雙歧桿菌9.97±0.96 9.15±0.58a 8.54±0.61ab 7.96±0.82abc 28.936＜0.001

3.腸黏膜通透性指標(biāo)比較

A、B、C組D-LAC、ETX、DAO水平均高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；隨著Child-Pugh肝功能分級提高，B、C組D-LAC、DAO水平均高于A組（均P＜0.05），但B、C組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；C組ETX水平均高于A、B組（均P＜0.05），但A、B組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 肝硬化患者與健康體檢者腸黏膜通透性指標(biāo)比較（）

表3 肝硬化患者與健康體檢者腸黏膜通透性指標(biāo)比較（）

注：對照組為無肝硬化的健康體檢者，A組為Child-Pugh分級A級肝硬化患者，B組為Child-Pugh分級B級肝硬化患者，C組為Child-Pugh分級C級肝硬化患者；D-LAC為D-乳酸，ETX為內(nèi)毒素，DAO為二胺氧化酶；與對照組比較，aP＜0.05；與A組比較，bP＜0.05；與B組比較，cP＜0.05

DAO（U/L）3.65±1.63 34.06±10.36a 40.12±11.72ab 43.07±14.20ab 61.254＜0.001組別對照組A組B組C組F值P值例數(shù)40 35 43 18 D-LAC（mg/L）3.92±2.27 5.83±2.63a 8.75±3.27ab 10.16±3.58ab 24.642＜0.001 ETX（U/L）3.72±2.51 10.53±4.36a 12.67±5.12a 23.08±9.37abc 38.718＜0.001

4.腸黏膜通透性指標(biāo)與Child-Pugh肝功能分級的相關(guān)性分析

經(jīng)Pearson相關(guān)性分析顯示，D-LAC與ETX、DAO呈正相關(guān)（r=0.595、0.489，均P＜0.05）；ETX與DAO呈正相關(guān)（r=0.353，P＜0.05）；經(jīng)Spearman相關(guān)性分析顯示，D-LAC、ETX、DAO與Child-Pugh肝功能分級呈正相關(guān)性（r=0.468、0.470、0.236，均P＜0.05）。見表4、表5。

表4 96例肝硬化患者腸黏膜通透性指標(biāo)之間的相關(guān)性

表5 96例肝硬化患者腸黏膜通透性指標(biāo)與Child-Pugh肝功能分級的相關(guān)性

5.腸黏膜通透性指標(biāo)預(yù)測Child-Pugh肝功能分級的診斷價值分析

經(jīng)ROC分析顯示，D-LAC預(yù)測Child-Pugh肝功能分級的診斷價值最高，曲線下面積（AUC）為0.772，最佳截?cái)嘀禐?.60 mg/L，此時靈敏度、特異度分別為78.69%、65.71%。見表6、圖1。

表6 腸黏膜通透性指標(biāo)預(yù)測96例肝硬化患者Child-Pugh肝功能分級的診斷價值分析

圖1 腸黏膜通透性指標(biāo)預(yù)測96例肝硬化患者Child-Pugh肝功能分級的ROC

討 論

“腸-肝軸”概念提示肝臟與腸道及其微生物菌群存在雙向關(guān)系，肝臟合成膽汁酸、磷脂、膽固醇及代謝物等物質(zhì)以膽汁形式流經(jīng)小腸上部-空腸-回腸-結(jié)腸通路，腸道及其微生物菌群發(fā)揮物質(zhì)代謝作用并以血液形式經(jīng)門靜脈吸收再次流回肝臟［14-16］。當(dāng)肝硬化發(fā)生后，受損肝臟功能毒素清除能力減弱使機(jī)體免疫功能下降，進(jìn)而破壞腸-肝屏障導(dǎo)致腸道及其微生物菌群失調(diào)，而腸道及其微生物菌群失調(diào)可進(jìn)一步加重肝臟代謝負(fù)擔(dān)損傷肝功能進(jìn)一步促進(jìn)肝硬化進(jìn)展［17］。故明確肝硬化患者肝功能與腸道微生態(tài)變化的關(guān)系對于肝病防治具有重要意義。就腸道微生態(tài)分析，腸道內(nèi)微生物逾100萬億，微生物群1 000～1 150種，按功能可分為益生菌（乳酸菌、雙歧桿菌等腸道優(yōu)勢菌）、共生菌（腸桿菌、腸球菌等條件致病菌）、過路菌（變形菌門、綠膿桿菌等致病菌）。于正常情況下，過路菌含量較少不致病，共生菌一定數(shù)目下可發(fā)揮一定生理功能，益生菌可調(diào)節(jié)機(jī)體免疫，并可增加機(jī)體抗炎及抗感染能力［18-19］。限于醫(yī)院尚不具備分子生物學(xué)技術(shù)條件，本文基于糞便細(xì)菌培養(yǎng)用以評估腸道菌群變化，結(jié)果顯示，A、B、C組腸桿菌、腸球菌數(shù)目均高于對照組，乳桿菌、雙歧桿菌數(shù)目均低于對照組。這表明肝硬化患者腸道菌群數(shù)目發(fā)生改變，且隨Child-Pugh肝功能分級提高，乳桿菌、雙歧桿菌數(shù)目明顯降低，腸桿菌、腸球菌數(shù)目明顯升高。究其原因在于，肝硬化發(fā)生后因膽汁酸分泌減少，可促進(jìn)腸桿菌、腸球菌等條件致病菌過度生長，數(shù)目超過限定閾值后可變?yōu)橹虏【?，并對乳桿菌、雙歧桿菌等優(yōu)勢菌產(chǎn)生抑制，進(jìn)而破壞胃腸屏障進(jìn)一步損害免疫防御功能，由此致病菌通過釋放細(xì)胞炎癥因子可加劇肝硬化發(fā)展［20］。這與Dubinkina等［21］研究證實(shí)酒精性肝硬化中梭菌目與擬桿菌目中多個菌種有明顯降低有一定類似。而本文納入對象包括但不局限于酒精性肝硬化，并排除特殊性自身免疫性肝硬化，雖整體體現(xiàn)出一致性趨勢，但關(guān)于不同病因肝硬化腸道菌群變化有待研究作進(jìn)一步細(xì)分。

鑒于上述傳統(tǒng)培養(yǎng)方法存在耗時耗力，培養(yǎng)要求高，影響因素雜等缺陷，將其用于臨床肝硬化診療存在不足，亟待尋求實(shí)時、可靠特異性指標(biāo)用以準(zhǔn)確反映肝硬化發(fā)生、進(jìn)展。考慮到肝硬化所致腸道菌群變化表現(xiàn)為腸黏膜通透性增加，故尋找可靠腸黏膜通透性特異性指標(biāo)可一定程度反映肝硬化嚴(yán)重程度。于正常情況下，機(jī)體門靜脈中存在少量ETX用以激活肝臟內(nèi)皮系統(tǒng)提高機(jī)體免疫力，因肝硬化可誘使腸道致病菌大量繁殖破壞腸黏膜屏障功能，腸黏膜通透性上升，ETX可進(jìn)入血循環(huán)導(dǎo)致濃度升高，并形成內(nèi)毒素血癥進(jìn)一步加重腸黏膜損傷形成惡性循環(huán)。故測定血清ETX水平可一定程度反映腸黏膜通透性。D-LAC作為腸道細(xì)菌酵解產(chǎn)物，正常情況下于血液中含量較低，但腸黏膜通透性升高時，腸道細(xì)菌合成大量D-LAC通過腸黏膜屏障進(jìn)入門靜脈循環(huán)，且肝臟無法吸收D-LAC，故監(jiān)測血清D-LAC水平可有效反映腸黏膜通透性。而作為多胺物質(zhì)分解代謝酶的DAO廣泛存在于小腸黏膜或絨毛上皮細(xì)胞，當(dāng)腸黏膜屏障損傷后，腸黏膜細(xì)胞脫落進(jìn)而腸腔進(jìn)入血循環(huán)，由此導(dǎo)致血中DAO含量上升。故DAO亦可對腸黏膜通透性有一定反映［22-24］。本文結(jié)果顯示，A、B、C 組 D-LAC、ETX、DAO水平均高于對照組。這提示肝硬化患者腸黏膜通透性提高表現(xiàn)為D-LAC、ETX、DAO上升。而依據(jù)Child-Pugh肝功能分級進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，B、C組D-LAC、DAO水平均高于A組，但B、C組間比較無明顯差異，C組ETX水平高于A、B組，但A、B組間比較無明顯差異。據(jù)此表明腸黏膜通透性改變與Child-Pugh肝功能分級存在一定相關(guān)性。而不同分級間部分指標(biāo)差異不明顯，究其原因有以下：（1）Child-Pugh肝功能分級使用了腹水、肝性腦病等主觀性指標(biāo)，且僅分為3個級別，可能導(dǎo)致分值不同患者均歸為一組，由而導(dǎo)致病情嚴(yán)重程度與腸黏膜通透性指標(biāo)水平存在一定波動；（2）所納入C組患者病例僅18例，且評分與B組相近。而由相關(guān)性分析顯示，D-LAC、ETX、DAO與Child-Pugh肝功能分級呈正相關(guān)，且D-LAC、ETX、DAO之間易呈正相關(guān)。這提示D-LAC、ETX、DAO可作為腸黏膜通透性可靠指標(biāo)。這與相關(guān)研究有一定類似［25］。且通過ROC作進(jìn)一步分析結(jié)果顯示，D-LAC用于預(yù)測肝硬化肝功能嚴(yán)重程度的診斷價值最高，其次為ETX、DAO。這表明通過D-LAC、ETX、DAO可對肝硬化患者肝功能嚴(yán)重程度進(jìn)行評估，且上述指標(biāo)均可快速、實(shí)時獲得，臨床應(yīng)用具有可行性。

綜上所述，肝硬化患者因腸道菌群紊亂、腸黏膜通透性改變導(dǎo)致腸道微生態(tài)失調(diào)可使疾病病情加重，不利于預(yù)后。通過無創(chuàng)、可靠且實(shí)用腸黏膜通透性指標(biāo)監(jiān)測有助于為肝硬化患者診療提供重要指導(dǎo)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突