劉曉光, 徐夢(mèng)超, 王青鴿, 蘇健誠(chéng), 魏紀(jì)珍, 安世恒

(小麥玉米作物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 河南省害蟲綠色防控國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室, 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 鄭州 450002)

昆蟲體外信息交流和體內(nèi)信號(hào)傳遞均離不開神經(jīng)肽的參與[1-7]。神經(jīng)肽是一類小分子活性多肽,主要由神經(jīng)元(neurons)、神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞(neuroendocrine cells)或腸內(nèi)分泌細(xì)胞(endocrine cells)分泌,其生成過程具有較高的相似性(圖1),即神經(jīng)肽基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、翻譯后首先形成前體蛋白(precursor proteins,pro-proteins),前體蛋白在其N端具疏水結(jié)構(gòu)的信號(hào)肽的引導(dǎo)下進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum,ER)[8]。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,前體蛋白N端信號(hào)肽首先被切除,切除信號(hào)肽的其余肽段經(jīng)歷一系列翻譯后修飾(糖基化、羥基化、N端?；投蜴I的形成)進(jìn)入高爾基體,其序列中某些單個(gè)或者相鄰兩個(gè)位點(diǎn)氨基酸殘基被特異性蛋白酶識(shí)別并切割(C端堿性殘基由羧肽酶轉(zhuǎn)化酶切除形成C端酰胺化或N端焦谷氨酰殘基發(fā)生谷氨酰胺?；h(huán)化)[9],最終形成具有生物活性的成熟多肽,這些活性多肽通過各種途徑分泌到細(xì)胞外,最終達(dá)到靶位點(diǎn),與G 蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合(G protein-coupled receptor, GPCR),激活下游信號(hào)通路[8,10]。隨著基因組、轉(zhuǎn)錄組和多肽質(zhì)譜等技術(shù)的快速發(fā)展,諸多神經(jīng)肽得以發(fā)現(xiàn)。僅昆蟲中就有30余種、數(shù)百個(gè)成熟肽得到鑒定[11-15]。其中tachykinin(TK)為眾多神經(jīng)肽中的一類,也稱速激肽。TK 在進(jìn)化上屬于較為保守的腦-腸多肽(brain-gut peptide),參與生物的生長(zhǎng)發(fā)育和生理行為活動(dòng)[16-18]。TK含量雖少,但在昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育過程中卻起著異常重要的作用,對(duì)于以TK為代表的神經(jīng)肽的深入研究,有助于人們更全面地了解昆蟲生理功能及內(nèi)分泌機(jī)制,為探索害蟲治理提供科學(xué)依據(jù)。

圖1 昆蟲速激肽成熟肽合成釋放過程

1 昆蟲速激肽的發(fā)現(xiàn)

無脊椎動(dòng)物中,TK最早發(fā)現(xiàn)于昆蟲,Schoofs等收集并解剖9 000多頭飛蝗Locustamigratoria腦-心側(cè)體-咽側(cè)體-咽下神經(jīng)節(jié)復(fù)合體,通過分離純化,首次獲得TK的多肽序列[19-20]。利用類似方法,Muren等從1 000頭馬德拉蜚蠊Leucophaeamaderae的腦組織中成功分離純化出7個(gè)TK多肽[21]。此后,研究者又陸續(xù)從黑腹果蠅Drosophilamelanogaster[22]、家蠶Bombyxmori[23]、赤擬谷盜Triboliumcastaneum[12]、豌豆蚜Acyrthosiphonpisum[24]、褐飛虱Nilaparvatalugens[25]、吸血蝽Rhodniusprolixus[26]、意大利蜜蜂Apismellifera[13]、二化螟Chilosuppressalis[14]、麥蛾繭蜂Habrobraconhebetor[15]和稻綠蝽Nezaraviridula[27]等其他昆蟲中發(fā)現(xiàn)。

2 速激肽的命名與分類

分類命名上,在脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的速激肽稱為典型的P物質(zhì)(substance P,SP),主要包括神經(jīng)激肽A(neurokinin A,NKA)和神經(jīng)激肽B(neurokinin B, NKB)[28];在無脊椎動(dòng)物包括昆蟲中發(fā)現(xiàn)的稱為TK或速激肽相關(guān)肽(tachykinin-related peptide, TKP),它們共同構(gòu)成了速激肽超基因家族[29]。

3 速激肽的一般特征

目前研究結(jié)果表明,在編碼昆蟲TK蛋白的序列中一般含有多個(gè)TK成熟多肽,而單個(gè)成熟多肽通常由8～14個(gè)氨基酸殘基組成,且C末端均發(fā)生酰胺化。如利用分離純化方法，結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)研究者從飛蝗中鑒定出4種TK成熟肽[19-20],果蠅中有5種[30],家蠶和小地老虎Agrotisipsilon中有6種[23,31-32],意大利蜜蜂中鑒定出7種[13,33-34],赤擬谷盜中預(yù)測(cè)出8個(gè)[12]，褐飛虱中預(yù)測(cè)出8個(gè)[25]。不同昆蟲體內(nèi)TK成熟肽數(shù)量不盡相同,但它們均由一個(gè)基因開放閱讀框(open reading frame,ORF)編碼的前體蛋白產(chǎn)生。大多數(shù)昆蟲TK前體蛋白中,編碼其成熟肽的氨基酸序列有一定的差異,但也有一些昆蟲中存在一個(gè)前體蛋白所產(chǎn)生的若干個(gè)TK成熟肽氨基酸序列完全一致的現(xiàn)象(如意大利蜜蜂TK前體蛋白序列中有兩個(gè)位點(diǎn)同時(shí)產(chǎn)生APMGFQGMR-amide成熟肽),不同昆蟲產(chǎn)生的TK成熟肽也有個(gè)別序列完全一致,如馬德拉蜚蠊與赤擬谷盜中均存在APSGFMGMR-amide成熟肽。這些多肽的鑒定和預(yù)測(cè)也為發(fā)現(xiàn)和研究相關(guān)受體提供了很好的基礎(chǔ)。其次,除酰胺化外,這類成熟肽在 C端也相對(duì)保守,具有典型的FX1GX2R氨基酸基序(圖2)。

圖2 昆蟲速激肽成熟肽C端典型FX1GX2R基序

4 速激肽分離、鑒定和預(yù)測(cè)方法

昆蟲神經(jīng)肽的分離與鑒定歷經(jīng)了較為漫長(zhǎng)的發(fā)展過程。自Stone等從飛蝗和沙漠蝗Schistocercagregaria心側(cè)體(corpus cardiacum)中分離并首次測(cè)序了神經(jīng)肽脂動(dòng)激素(adipokinetic hormone,AKH)開始[35],至Schoofs等成功分離并測(cè)定出TK部分序列,開啟了有關(guān)昆蟲TK研究的新征程,這也是在節(jié)肢動(dòng)物中最早發(fā)現(xiàn)TK的正式報(bào)道,該傳統(tǒng)研究方法沿用至今[19-20]。

在利用傳統(tǒng)方法研究TK等神經(jīng)肽過程中,樣品前處理、活性組分的收集與分離等是獲取活性神經(jīng)肽的關(guān)鍵和難點(diǎn)。前處理過程需要兩步,首先,組織解剖后樣品需要盡快進(jìn)行熱變性或立即采用有機(jī)溶劑(如冰凍的色譜級(jí)甲醇)進(jìn)行變性穩(wěn)定處理,或液氮迅速冷凍后暫時(shí)存放于-80℃,防止成熟肽的快速降解[36];其次是樣品除雜,樣品組織需經(jīng)超聲破碎、離心后取上清液,上清液經(jīng)超濾柱(膜)初步去除大分子蛋白。以上預(yù)處理樣品再借助填充不同材料的色譜柱分離,根據(jù)單一峰或若干組合峰對(duì)應(yīng)的液相分離液,準(zhǔn)確收集并進(jìn)一步將其冷凍濃縮獲得活性組分。此步是獲得活性神經(jīng)肽的關(guān)鍵,技術(shù)上有一定的難度。因此,利用色譜柱分離是多肽分離技術(shù)的核心,其在實(shí)際應(yīng)用中經(jīng)歷了較大改進(jìn)與發(fā)展。該技術(shù)最初采用可控孔徑玻璃珠(controlled-pore glass,CPG)作為吸附載體,先將小分子多肽過柱分離、濃縮,再經(jīng)過硅膠薄層層析板(silica gel thin-layer plate)分離獲得微量(μg)、純度較高且具有活性的神經(jīng)肽[35];隨后又發(fā)展到利用高效液相色譜(highly performance liquid chromatography,HPLC)系統(tǒng),與不同非極性反相(reversed-phase)色譜柱組合,充分利用色譜柱極性差異,不斷更換色譜柱,依次反復(fù)純化洗脫。洗脫粗組分經(jīng)生物活性測(cè)定初步確定多肽分離的保留時(shí)間(每種多肽具有特殊的生理功能,可通過生物活性測(cè)定初步鑒定多肽種類)[37];進(jìn)一步地,學(xué)者們又將免疫學(xué)與色譜技術(shù)結(jié)合,用神經(jīng)肽(TK等)多克隆抗體結(jié)合放射免疫(radioimmunoassay,RIA)[2]或酶聯(lián)免疫(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)等技術(shù)[4]快速確定陽(yáng)性組分,同時(shí)記錄具有陽(yáng)性組分所對(duì)應(yīng)的更準(zhǔn)確的保留時(shí)間,利用同樣分離條件可在短時(shí)間內(nèi)獲得大量分離液,將收集到的分離液進(jìn)一步冷凍濃縮,提高天然神經(jīng)肽的獲得率與產(chǎn)量,完善了TK神經(jīng)肽等分離和鑒定技術(shù)[36]。由于該技術(shù)操作繁瑣,對(duì)儀器及操作過程要求較高,目前國(guó)際上僅有少數(shù)實(shí)驗(yàn)室仍保留著以上傳統(tǒng)的分離鑒定方法。此外,還可借助簡(jiǎn)單的反相色譜技術(shù),前處理樣品經(jīng)過一次反相色譜分離得到粗產(chǎn)物,該粗產(chǎn)物在快速冷凍濃縮后無需經(jīng)過其他色譜填料的反相色譜柱組合進(jìn)行反復(fù)地分離,即可直接上質(zhì)譜系統(tǒng)檢測(cè)[32],還有將神經(jīng)組織或腦組織切片直接上質(zhì)譜獲得TK精確分子量的報(bào)道[33-34]。此外,隨著生物信息學(xué)和質(zhì)譜技術(shù)的飛速發(fā)展,首先利用以上質(zhì)譜技術(shù),獲得多肽的精確分子量,或者利用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(isobaric tags for relative and absolute quantification, iTraq)技術(shù)獲得序列確定的多肽片段,再結(jié)合基因組、轉(zhuǎn)錄組,將收集到的組織樣品與相應(yīng)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)與氨基酸序列自動(dòng)匹配,預(yù)測(cè)出神經(jīng)肽成熟肽序列[32]。

5 速激肽的表達(dá)與分布

昆蟲TK與其他神經(jīng)肽類似[1],最早從腦組織(腦-咽側(cè)體-心側(cè)體-咽下神經(jīng)節(jié))中分離[19-20],后來也在中腸發(fā)現(xiàn),因此又稱腦-腸肽[2]。有關(guān)TK的研究當(dāng)數(shù)黑腹果蠅中最為詳細(xì),Veenstra等利用埃及伊蚊AedesaegyptiTK多肽制備的抗體,在黑腹果蠅成蟲不同組織中進(jìn)行了TK神經(jīng)元定量分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)腦部最多,約700個(gè),中腸中次之,約360個(gè),其次是后腸,約140個(gè),胸腹神經(jīng)約110個(gè),馬氏管約10個(gè),嗉囊最少,約4個(gè)[38]。類似地,有關(guān)TK神經(jīng)元在煙草天蛾Manducasexta中的分布也有報(bào)道。在煙草天蛾成蟲期,檢測(cè)到TK神經(jīng)元主要集中在中腦(midbrain),約有100個(gè),其中視神經(jīng)葉(optic lobe)中僅發(fā)現(xiàn)1個(gè)。而在5齡幼蟲中,TK神經(jīng)元主要集中在腦神經(jīng)細(xì)胞,約有60個(gè);其次是腹神經(jīng)索(ventral nerve cord),其中咽下神經(jīng)(suboesophageal ganglion)5對(duì),胸神經(jīng)(thoracic ganglia)2對(duì),第5未融合的腹神經(jīng)(fifth unfused abdominal ganglia)各1對(duì),融合末端神經(jīng)(fused terminal ganglion)3對(duì),與黑腹果蠅成蟲不同,在煙草天蛾成蟲與幼蟲的前腸和后腸中并未檢測(cè)到TK神經(jīng)元[39]。此外,借助新興的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù),Guo等首次研究了黑腹果蠅中腸腸內(nèi)分泌細(xì)胞各類神經(jīng)肽的分布特點(diǎn),其中重點(diǎn)關(guān)注了TK神經(jīng)元。結(jié)果表明,在中腸共富集并分離鑒定出10類腸內(nèi)分泌神經(jīng)元類群, 其中TK集中表達(dá)于4個(gè)主要細(xì)胞類群(即所分屬的1、3、4和7腸內(nèi)分泌細(xì)胞類群)。同時(shí)發(fā)現(xiàn),TK成熟多肽具有與不同神經(jīng)肽共表達(dá)的偏好性,即TK偏好在某些內(nèi)分泌細(xì)胞中單獨(dú)存在,或與DH31、CCAP、CCH、ITP、Gbp5、sNPF、NPF、Mip、Nplp2等單個(gè)或多個(gè)神經(jīng)肽共表達(dá),而極少或決不與神經(jīng)肽AstC共表達(dá)[40]。

6 速激肽受體研究

盡管昆蟲TK不斷被發(fā)現(xiàn),但有關(guān)其受體的發(fā)掘和研究較少,目前已發(fā)現(xiàn)的潛在受體可歸為3類。Li等利用哺乳動(dòng)物同源TK受體(tachykinin receptor,TKR)基因作為探針,從黑腹果蠅cDNA文庫(kù)中篩選并首次發(fā)現(xiàn)了第一類無脊椎動(dòng)物TK受體,該受體由CG7887基因編碼,也稱為DTKR(Drosophilatachykinin receptor)或TKR99D[41]。第二類TK受體由CG6515基因編碼,起初命名為果蠅神經(jīng)激肽受體(neurokinin receptor fromDrosophila),簡(jiǎn)稱NKD或TKR86C。這兩類與哺乳動(dòng)物神經(jīng)激肽受體(mammalian neurokinin receptor)跨膜區(qū)序列有32%～48%的相似度[42]。第三類速激肽受體是從廄螯蠅Stomoxyscalcitrans中克隆獲得,稱為STKR,它與前兩類受體在跨膜區(qū)相似度高達(dá)80%[43]。早期,由于試驗(yàn)方法和技術(shù)的限制,這些TK及其受體的研究一直是孤立的,無法建立聯(lián)系,甚至受體基因的克隆早于TK的發(fā)現(xiàn)。直到2000年之后,遺傳學(xué)家以果蠅為材料,利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建了大量基因缺失或過表達(dá)品系[22],才開始基因功能研究,但有關(guān)TK的研究在果蠅中尚未開展廣泛研究,進(jìn)展較為緩慢,其具體生理功能也尚不清楚。

配體/受體基因的獲得為研究TK/TKR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)打開了一扇大門。目前,相關(guān)研究主要集中于基因組草圖已經(jīng)完成的模式昆蟲。對(duì)于DTKR,Birse等利用不同體外細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng),在人腎源細(xì)胞HEK293和果蠅S2細(xì)胞系中均成功表達(dá)了DTKR,隨后用人工合成的DTK1～DTK6等多肽分別處理以上兩種細(xì)胞,結(jié)果均能在短時(shí)間內(nèi)提升細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度及環(huán)磷酸腺苷(cAMP)水平,并且,這些信號(hào)隨多肽濃度的增大而顯著上升[44]。而對(duì)于果蠅NKD,研究者分別利用中國(guó)倉(cāng)鼠Cricetulusbarabensis卵巢細(xì)胞CHO-PAM28和果蠅S2細(xì)胞系表達(dá)了該受體。同樣,分別加入人工合成的DTK1～DTK6、N端增加不同氨基酸殘基而仍保留C端基序不變的DTK6和其他昆蟲TK等神經(jīng)肽刺激,結(jié)果除DTK6表現(xiàn)出較低的生物活性外,DTK1～DTK5等神經(jīng)肽均無激活特性[45]。這些結(jié)果暗示了DTKR是DTK的潛在受體,而NKD則不是DTK的受體。在鱗翅目中也有類似研究,根據(jù)基因進(jìn)化分析,發(fā)現(xiàn)家蠶TK受體BNGR-A24(Bombyxmorineuropeptide GPCR A24)與DTKR親緣關(guān)系更近;而BNGR-A32和BNGR-A33與NKD具有較近的親緣關(guān)系[46],這在一定程度上也表明TKR與NKD屬兩類不同的TK受體。此外,He等用2種不同細(xì)胞系即人胚胎腎細(xì)胞HEK293和草地貪夜蛾卵細(xì)胞系Sf21(Spodopterafrugiperdaovarian cell line 21)分別表達(dá)了BNGR-A24,隨后用人工合成的家蠶TK檢測(cè)生理活性,發(fā)現(xiàn)TK1～TK6(BmTK1～BmTK6)也分別能夠快速提升細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度及cAMP水平,cAMP水平隨多肽濃度增加具有一定的濃度依賴性。這些結(jié)果也進(jìn)一步表明了BNGR-A24是BmTK1～BmTK6潛在的受體[47]。

隨后一個(gè)重要試驗(yàn)證明了果蠅、家蠶乃至其他一些模式昆蟲的各種受體與各自配體的生物學(xué)關(guān)系。Jiang等在果蠅、家蠶和赤擬谷盜等模式昆蟲中鑒定出一類C端相對(duì)保守、序列上類似TK的神經(jīng)肽(C端為FxxxRa或YxxxRa motif),將其寓意為拉丁語(yǔ) “出生”(natalisin,NTL)、并用拉丁化的NTL命名[48]。該團(tuán)隊(duì)隨后進(jìn)行了“受體/候選配體”體外細(xì)胞活性驗(yàn)證,結(jié)果顯示果蠅DNTL1～DNTL5分別與受體NKD均有強(qiáng)烈的活性反應(yīng),相比而言,DTK6顯現(xiàn)出的活性反應(yīng)遠(yuǎn)低于DNTL1～DNTL5;而在家蠶中發(fā)現(xiàn)的12個(gè)NTL成熟多肽(BmNTL),其中BmNTL-1, BmNTL-3和 BmNTL-5(FxxxRa motif)可強(qiáng)烈激活BNGR-A33,而BmNTL-10和BmNTL-11(YxxxRa motif)強(qiáng)烈激活BNGR-A32;赤擬谷盜中發(fā)現(xiàn)的2個(gè)NTL對(duì)赤擬谷盜受體都具有生物活性反應(yīng)[48]。自此,困擾了20多年有關(guān)TK與其受體的尋找終于“塵埃落定”,即DTKR(TkR99D)為DTK的受體,NKD(TkR86C)為果蠅NTL的受體;家蠶BNGR-A24為速激肽BmTK的受體,而BNGR-A32和BNGR-A33為BmNTL的受體;赤擬谷盜中也分別找到了TK和NTL及其相應(yīng)受體。另外,在已知膜翅目昆蟲意大利蜜蜂和麗蠅蛹集金小蜂Nasoniavitripennis基因組中,并沒有發(fā)現(xiàn)NTL及其受體,而寄生于蜜蜂等膜翅目的常見螨蟲則存在相應(yīng)的NTL及其受體,可以將螨蟲NTL及其受體作為靶標(biāo)基因,這也為設(shè)計(jì)新的害蟲靶標(biāo)基因提供了很好的思路[48]。

有關(guān)昆蟲TK/TKR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制和功能研究才剛剛開始,在這些工作中,浙江大學(xué)周耐明教授、堪薩斯州立大學(xué)Park和哈佛大學(xué)Song等領(lǐng)銜或所在的研究團(tuán)隊(duì)都做出了重要貢獻(xiàn)[10，17，47-48]。他們分別在家蠶、赤擬谷盜和黑腹果蠅等模式昆蟲中開展了相關(guān)研究,發(fā)現(xiàn)了一些重要的保守信號(hào)通路,即 TK與受體結(jié)合多數(shù)會(huì)引起cAMP、Ca2+等上升,可能通過PLC/Ca2+/PKC 或 AC/cAMP/PKA信號(hào)通路調(diào)控下游關(guān)鍵基因。同時(shí),TK與受體結(jié)合后還可通過GRK5/PKC激酶途徑實(shí)現(xiàn)受體自身磷酸化,通過招募β-arrestin2/Kurtz蛋白復(fù)合體,經(jīng)網(wǎng)格蛋白包被小窩(clathrin-coated pits)快速將受體內(nèi)吞,隨后受體通過去磷酸化并最終恢復(fù)至細(xì)胞膜表面,形成完整信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[10](圖3)。

圖3 PKC，GRK5和β-arrestin2/BmKurtz參與TK/TKR信號(hào)通路中配體依賴的內(nèi)吞過程

7 速激肽生理功能與行為調(diào)節(jié)研究

7.1 參與信息物質(zhì)合成和感受

TK不僅具有促進(jìn)成蟲對(duì)信息化合物的感受,而且在性信息素合成、調(diào)控兩性交配行為等方面具有重要功能。將轉(zhuǎn)基因果蠅腦神經(jīng)和咽下神經(jīng)節(jié)中TK轉(zhuǎn)錄水平調(diào)低后,與對(duì)照品系相比,其對(duì)丁醇(butanol)、醋酸異戊酯(isoamyl acetate)和苯甲醛(benzaldehyde)等揮發(fā)性化合物的趨向選擇性顯著降低[7]。此外,研究還發(fā)現(xiàn)TK也參與昆蟲對(duì)性信息素的感受。位于雄蟲前足的味覺神經(jīng)元受體Gr68a,能夠通過味覺系統(tǒng)參與感知雄性同類射精管球(ejaculatory bulb)釋放的抑性欲信息素成分CH503[(3R,11Z,19Z)-3-acetoxy-11,19-octacosadien-1-ol],該性信息素成分是雄性交配過程中留給雌性的信息物質(zhì),可以降低交配過的雌性對(duì)其他同種雄性的吸引力,從而避免該雌蟲與其他雄蟲發(fā)生重復(fù)交配。這一重要功能的實(shí)現(xiàn),首先是通過配體即性信息素CH503與Gr68a受體結(jié)合后快速激活該信號(hào)通路,進(jìn)一步通過肽能細(xì)胞(peptidergic cell)將該信號(hào)傳導(dǎo)至雄性中央腦(central brain),而咽下區(qū)域(subesophageal zone,SEZ)正是作為感受信息、參與抑制其他雄蟲與該雌蟲重復(fù)交配行為的黑匣子。該黑匣子接收到上游轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)后,其區(qū)域分布的8～10個(gè)能夠分泌TK的特異性神經(jīng)元并快速響應(yīng)，釋放TK成熟多肽,其中TK參與的一條信號(hào)可通過P1神經(jīng)元簇(P1 neuron cluster),最終表現(xiàn)出抑制雄蟲與該雌蟲交配行為。利用RNAi將果蠅雄成蟲的SEZ區(qū)域內(nèi)TK轉(zhuǎn)錄水平定點(diǎn)下調(diào),這些特定區(qū)域TK下調(diào)后的雄蟲在與已交配過的雌蟲接觸后,其感知CH503能力顯著降低,不能有效避免重復(fù)交配[49]。將人工合成的飛蝗TK(Lom-TK-Ⅲ和 Lom-TK-Ⅵ)[19],注射到家蠶體內(nèi)或利用含有TK成熟肽的培養(yǎng)液離體培養(yǎng)雌蛾的性信息素腺體,結(jié)果發(fā)現(xiàn),兩種方式均可促進(jìn)家蠶雌成蟲性信息素的合成,而且隨著TK劑量的增加,雌性性信息素合成量具有顯著的濃度依賴性[50]。此外,研究還發(fā)現(xiàn)由TK祖先進(jìn)化形成的另一分支神經(jīng)肽natalisin,具有促進(jìn)雙翅目黑腹果蠅、橘小實(shí)蠅Bactroceradorsalis和鞘翅目赤擬谷盜交配的功能[18，48，51]。但因物種差異性,鱗翅目蛾類與鞘翅目或雙翅目性信息素合成機(jī)制差異較大。目前研究已證明鞘翅目[51]和蜚蠊目性信息素合成由保幼激素(juvenile hormone,JH)調(diào)控[52-53],雙翅目由蛻皮激素(20-hydroxyecdysone,20E)調(diào)控[54],而鱗翅目蛾類主要由性信息素合成激活肽(pheromone biosynthetic activating neuropeptide,PBAN)調(diào)控[55]。隨著性信息素合成途徑研究的深入,我們總結(jié)發(fā)現(xiàn),自Fónagy首次報(bào)道TK參與性信息素合成之后[50], TK如何參與性信息素合成尚無新的報(bào)道,其作用機(jī)制也依然未知,而TK在參與家蠶等鱗翅目性信息素合成過程中扮演何種角色值得進(jìn)一步探索。

7.2 參與取食及其他生理行為

昆蟲在取食過程中,不僅受JH和20E這兩大重要激素的影響,同時(shí)還受到諸多肽類激素的調(diào)節(jié)。研究表明,饑餓可誘導(dǎo)昆蟲體內(nèi)TK激素水平快速上升[56]。而增加TK量能夠促進(jìn)果蠅幼蟲后腸收縮蠕動(dòng)[57],減少體內(nèi)脂肪含量[17],這可能與其促進(jìn)心側(cè)體內(nèi)AKH的釋放、增加cAMP的水平具有一定的相關(guān)性[6]。同時(shí),TK還可減少體重增加量,顯著縮短幼蟲饑餓后搜尋食物時(shí)間[47],這一現(xiàn)象與其他肽類激素如胰島素(insulin)和 sNPF(short neuropeptide F)類似[58]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),果蠅腦和中腸部分胰島素信號(hào)通路受到TK信號(hào)的嚴(yán)格調(diào)控,而且共同參與了維持體內(nèi)海藻糖水平、抵御蟲體饑餓和氧化應(yīng)激反應(yīng)[56，59]。此外,TK還參與了痛覺敏感信號(hào)通路(hedgehog signaling),該環(huán)路中TK所在的神經(jīng)元發(fā)生突變后可以提升對(duì)熱及紫外線的耐受性[60]。昆蟲在整個(gè)生命階段,時(shí)刻面臨著各種環(huán)境壓力,TK的分泌有助于昆蟲提升抗逆能力。自然界中,昆蟲取食各種寄主植物或其他食物的同時(shí),從環(huán)境中獲得大量有益環(huán)境微生物[61],取食后的食物在腸道微生物的參與下易于蟲體吸收與利用, 更重要的是,某些有益微生物產(chǎn)生的短鏈脂肪酸乙酸鹽可有效激活蟲體先天免疫通路,進(jìn)而通過促進(jìn)TK大量分泌,在維持腸道脂肪穩(wěn)態(tài)乃至機(jī)體健康方面發(fā)揮著重要作用[16]。

8 展望

神經(jīng)肽作為JH和20E之外的重要激素,在昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育及生理行為方面同樣發(fā)揮著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn),TK與其他30多類神經(jīng)肽一樣,均屬于典型的腦-腸多肽。總結(jié)目前國(guó)內(nèi)外已有的神經(jīng)肽功能研究文獻(xiàn),發(fā)現(xiàn)其具有以下顯著特征,有關(guān)腦部神經(jīng)肽的試驗(yàn)側(cè)重于行為功能研究,有關(guān)中腸組織內(nèi)神經(jīng)肽的試驗(yàn)則側(cè)重代謝或免疫研究。因此,基于神經(jīng)肽組織特異性和表達(dá)的時(shí)序性,對(duì)于昆蟲TK的研究,已開始從傳統(tǒng)的分離鑒定及基因克隆研究逐步轉(zhuǎn)入基因功能與演化關(guān)系研究。一方面,可通過研究TK在不同類群昆蟲中的共性特征,如參與脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)[17]與饑餓下食物搜尋[56，59],了解昆蟲的取食與能量代謝機(jī)制。另一方面,發(fā)掘TK在不同類群中的特有功能,如具有聚集習(xí)性的切葉蟻Acromyrmexechinatior工蟻(worker caste)體內(nèi)TK基因轉(zhuǎn)錄水平要顯著高于獨(dú)居型的蟻后(queen),可能與膜翅目特殊的社會(huì)性、或其蛋白序列中TK成熟肽數(shù)量較多具有一定的相關(guān)性[13，62]。此外,對(duì)昆蟲TK現(xiàn)有功能的研究和未知功能的挖掘,有助于探索昆蟲在取食寄主植物及逃避或適應(yīng)天敵寄生過程中適合度權(quán)衡具有重要生態(tài)學(xué)意義,可進(jìn)一步深入地闡釋TK在微生物-昆蟲-植物三級(jí)營(yíng)養(yǎng)關(guān)系層面所扮演的重要角色[61，63]。