劉 博，韓 夏，張少鋒，劉春艷，游 雅，張現(xiàn)廣，國建飛

(邢臺市人民醫(yī)院 胸外科，河北 邢臺 054001)

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，也是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因[1]。其中，非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占所有確診肺癌病例的85%以上[2]。盡管肺癌的診斷和治療策略取得了進(jìn)展，但5年生存率仍較差。探索新的肺癌治療策略并確定新的靶標(biāo)對改善預(yù)后具有重要臨床意義。細(xì)胞色素 P450 1B1 (Cytochrome P450 1B1，CYP1B1)是一種肝外酶，可以通過代謝 PAH、雜環(huán)芳香胺和其他致癌物質(zhì)來激活致癌化合物[3]。已證實，CYP1B1在許多腫瘤中選擇性表達(dá)，而在鄰近的正常細(xì)胞中無法檢測到表達(dá)[4]。在腦部、乳腺、結(jié)腸、卵巢和前列腺等腫瘤中均檢測到CYP1B1蛋白表達(dá)的升高[5]。已證實，CYP1B1在肺癌、乳腺癌等多種腫瘤中通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖發(fā)揮致癌效應(yīng)。既往關(guān)于CYP1B1與肺癌的研究多集中在基因多態(tài)性方面[6-7]。值得注意的是，盡管CYP1B1在肺癌中的致癌效應(yīng)已被研究，但其與肺癌患者臨床預(yù)后的關(guān)系鮮有報道。本研究旨在探討肺癌組織中CYP1B1的表達(dá)與預(yù)后之間的關(guān)系，以期為肺癌的臨床預(yù)后的評估提供新的見解。

1 資料與方法

1.1 一般資料 從本院病理科收集135名NSCLC患者(2016年2月至2017年5月接受手術(shù))的肺癌腫瘤組織和匹配的癌旁正常組織(距離腫瘤病灶≥5 cm)?；颊呓?jīng)病理診斷為NSCLC，術(shù)前未接受任何化療或放療。其中，男性75例，女性60例，年齡34～78歲，平均年齡(59.31±9.20)歲。從病理科收集腫瘤組織和匹配的癌旁正常組織(距離腫瘤病灶≥5 cm)。所有樣本均由兩名獨立的病理醫(yī)生進(jìn)行評估。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理檢查均確診為NSCLC；②未接受藥物、放化療或生物治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴傳染性疾病；②伴有哮喘、心肌梗塞等嚴(yán)重疾??；③合并其他部位原發(fā)腫瘤。作為一項回顧性分析，本研究經(jīng)本院倫理委員會審核批準(zhǔn)。所有參與者均簽署書面知情同意書。

1.2 隨訪 收集患者的年齡、性別、臨床分期、腫瘤分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床信息。根據(jù)AJCC癌癥分期手冊第7版評估腫瘤分期[8]。生存時間從切除之日至死亡，以月為單位計算。所有患者最后1次隨訪日期為2022年7月。在最后1次隨訪或非NSCLC以外原因死亡的日期被作為刪失數(shù)據(jù)。

1.3 免疫組織化學(xué)法檢測CYP1B1的表達(dá) 將病理組織蠟塊切成5 μm厚的切片，分別在二甲苯和分級醇中脫蠟和再水合。切片在檸檬酸緩沖液中進(jìn)行微波加熱，隨后與3 %H2O2在室溫下孵育30 min。隨后，將切片與正常血清在室溫下孵育30 min，然后與抗CYP1B1的一抗以1∶500的稀釋度孵育過夜。次日，將切片用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，然后與生物素標(biāo)記的二抗共同孵育。切片用PBS洗滌3次后，用3,3’二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽(DAB)孵育并用蘇木精復(fù)染。陰性對照用PBS代替一抗孵育。

1.4 結(jié)果判斷 由兩名臨床病理醫(yī)生獨立審查和評分免疫染色的組織切片。評分基于染色強度(0～3)和陽性染色腫瘤細(xì)胞的百分比(0%～100 %)。染色強度定義為陰性(0)、弱(1)、中(2)或強(3)，陽性腫瘤細(xì)胞百分比為0%、1%～25%、26%～50%、51%～75%和76%～100%時則分別記為0、1、2、3、4分。將染色強度和陽性腫瘤細(xì)胞的百分比相乘以得到每個病例的最終評分，范圍為0～12分， 0～4分被認(rèn)為是低表達(dá)， 5～12分被認(rèn)為是高表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 肺癌患者腫瘤組織中CYP1B1表達(dá)情況 免疫組織化學(xué)染色顯示，CYP1B1蛋白在肺癌組織中呈陽性表達(dá)，且主要定位于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，而在鄰近的正常肺組織中表達(dá)較弱或沒有表達(dá)(見圖1A、B)。根據(jù)免疫組織化學(xué)結(jié)果進(jìn)行評分，肺癌組織中CYP1B1的表達(dá)評分明顯高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05；見圖1C，表1)。

A：免疫組織化學(xué)檢測癌旁正常肺組織；B:肺癌組織中CYP1B1的表達(dá)，標(biāo)尺：50 μm；C：CYP1B1表達(dá)的評分比較。圖1 NSCLC患者腫瘤組織和癌旁正常組織中CYP1B1的表達(dá)

表1 CYP1B1的免疫組織化學(xué)評分(n=135)

2.2 CYP1B1與肺癌患者臨床病理特征的關(guān)系 根據(jù)評分標(biāo)準(zhǔn)，NSCLC患者中，CYP1B1高表達(dá)88例，低表達(dá)47例。如表2所示，CYP1B1高表達(dá)與低表達(dá)患者的年齡和性別分布無明顯差異(P>0.05)。吸煙患者肺癌組織中CYP1B1高表達(dá)的比例明顯高于不吸煙者(P=0.015)。此外，腫瘤大小≥4 cm、TNM分期III+IV、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者肺癌組織中CYP1B1高表達(dá)的比例明顯高于腫瘤大小<4 cm(P=0.009)、TNM分期I+II(P=0.031)、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.047)的患者(P<0.05)。

表2 CYP1B1表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 CYP1B1與肺癌患者預(yù)后的關(guān)系 對135名NSCLC患者隨訪至2022年5月。NSCLC患者的中位生存時間為30個月。CYP1B1高表達(dá)患者的中位生存時間(42.16±1.73)個月低于CYP1B1低表達(dá)患者的中位生存時間(51.06±2.63)個月。Kaplan-Meier法顯示，CYP1B1高表達(dá)患者的總生存率明顯低于CYP1B1低表達(dá)患者(log-rankχ2=7.525，P= 0.006；見圖2)。

2.4 總生存期的單變量和多變量 Cox 回歸分析 在單變量分析中，腫瘤分化(P=0.007)、TNM分期(P=0.031)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.001)和CYP1B1表達(dá)(P=0.009)與NSCLC患者的預(yù)后不良有關(guān)(P<0.05)。在多變量分析中，腫瘤分化(P=0.013)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.007)和CYP1B1表達(dá)(P=0.031)是影響肺癌患者預(yù)后的獨立危險因素(見表3)。

圖2 NSCLC患者隨訪5年的生存率曲線

表3 NSCLC患者死亡風(fēng)險的Cox風(fēng)險回歸模型

3 討論

NSCLC被認(rèn)為是肺癌的主要亞型，占所有病例的85%～90%[9]。盡管在手術(shù)、輔助治療、立體定向放射治療方面取得了很大進(jìn)展，但NSCLC患者的5年總生存率仍然很差[10]。因此，尋找與NSCLC發(fā)生發(fā)展相關(guān)的分子標(biāo)志物對改善其預(yù)后具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)，肺癌組織中CYP1B1的高表達(dá)與更大的腫瘤大小、較晚的TNM分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，在NSCLC的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。此外，CYP1B1高表達(dá)與肺癌患者的不良預(yù)后有關(guān)，是總生存率的獨立預(yù)測因子。因此，CYP1B1檢測可能是預(yù)測CRC患者預(yù)后的有效措施。

CYP1B1可以通過代謝PAH、雜環(huán)芳香胺和其他致癌物質(zhì)來激活致癌化合物[3]。CYP1B1蛋白的過表達(dá)已在不同的腫瘤中得到證實。與正常結(jié)直腸組織相比，結(jié)腸癌組織中CYP1B1的過度表達(dá)支持了CYP1B1靶向抗癌療法的發(fā)展[11]。CYP1B1的表達(dá)譜暗示其可作為腎細(xì)胞癌和卵巢癌中抗癌治療的生物標(biāo)志物[12-13]。已有研究證實，CYP1B1基因多態(tài)性是肺癌的危險因素。婁瑋等[14]發(fā)現(xiàn)CYP1B1 C/G+G/G基因型能夠顯著增加吸煙者的肺癌易感性。一項薈萃分析也指出CYP1B1 Leu432Val多態(tài)性與白種人和吸煙者的肺癌風(fēng)險增加有關(guān)[15]。CYP1B1介導(dǎo)的致癌作用可能依賴于CYP1B1的酶活性[16]。然而，目前關(guān)于CYP1B1在肺癌組織中表達(dá)情況的研究較少。本研究采用免疫組織化學(xué)法分析CYP1B1在肺癌組織中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CYP1B1在肺癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁非腫瘤組織，這與徐圓圓[17]的研究結(jié)果相似?；谙惹暗难芯客茰y，CYP1B1可能是肺癌發(fā)展的致癌基因。

本研究進(jìn)一步分析CYP1B1與肺癌患者臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CYP1B1與腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)，提示CYP1B1表達(dá)的升高可能參與NSCLC的發(fā)生進(jìn)展。Androutsopoulos等[18]發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌中CYP1B1的表達(dá)水平與TNM狀態(tài)無關(guān)。然而，也有研究顯示CYP1B1的表達(dá)與疾病的組織學(xué)階段密切相關(guān)。據(jù)報道，CYP1B1在卵巢癌和腎細(xì)胞癌的晚期臨床階段的表達(dá)顯著高于疾病早期患者[12-13]。Al-Saraireh等[19]發(fā)現(xiàn)，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的晚期TNM分期膀胱癌患者中，CYP1B1的高表達(dá)趨勢明顯。同樣，McFadyen等[20]在卵巢癌患者的轉(zhuǎn)移樣本中也證明了CYP1B1高表達(dá)。類似地，本研究也發(fā)現(xiàn)CYP1B1的表達(dá)與TNM分期和淋巴轉(zhuǎn)移之間的顯著相關(guān)性，提示CYP1B1可能參與肺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。然而，其潛在的作用機制仍需深入探究。

有學(xué)者通過免疫組化研究證實，CYP1B1對預(yù)測多種腫瘤的遠(yuǎn)期預(yù)后有較高的價值。在結(jié)腸癌中，CYP1B1表達(dá)的上調(diào)與較差的總生存期和無疾病復(fù)發(fā)生存期密切相關(guān)[21]。此外，在卵巢癌中也觀察到高水平的CYP1B1，這與耐藥性和癌癥患者的預(yù)后不良有關(guān)[22]。這些結(jié)果提示腫瘤組織中CYP1B1的表達(dá)在預(yù)后評估中具有重要意義。值得注意的是，Vasile等[23]指出CYP1B1 4326-GG基因型非小細(xì)胞肺癌患者的無進(jìn)展生存期(PFS)和總生存期(OS)比其他基因型患者短，且CYP1B1 4326C>G基因多態(tài)性是影響OS的獨立危險因素。此外，CYP1B1基因多態(tài)性可能會影響肺癌患者對化療的反應(yīng)[24]。然而，目前尚缺乏關(guān)于CYP1B1表達(dá)與肺癌預(yù)后關(guān)系的研究。本研究顯示，與CYP1B1低表達(dá)的患者相比，CYP1B1高表達(dá)的患者OS明顯較差。此外，多變量Cox回歸分析還表明CYP1B1的表達(dá)水平是OS的獨立預(yù)測因子。這些數(shù)據(jù)表明CYP1B1可作為肺癌患者預(yù)后預(yù)測的生物標(biāo)志物。

然而，本研究仍存在一些局限性。首先，本研究沒有分析轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)和轉(zhuǎn)移灶中CYP1B1的表達(dá)。其次，本研究作為一項回顧性研究，樣本量相對較小。此外，免疫組化檢測方法是半定量的，報告的結(jié)果取決于抗體和病理醫(yī)生的質(zhì)量[25]。因此，仍需要進(jìn)行大規(guī)模的前瞻性調(diào)查和更準(zhǔn)確的評估方法以明確CYP1B1在肺癌預(yù)后中的評估價值。

綜上所述，CYP1B1在肺癌組織中的表達(dá)顯著上調(diào)，且與更大的腫瘤大小、更晚的TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。此外，CYP1B1高表達(dá)是影響肺癌預(yù)后的獨立影響因素之一。CYP1B1的差異表達(dá)可能為開發(fā)肺癌治療新靶點提供新視角。