姜?jiǎng)P，吳雪莉，劉奕君，馬越，宋洋，盧文杰，王增裕

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，山東 青島 266109）

海濱雀稗（Paspalum vaginatum）作為具有較強(qiáng)耐鹽性的暖季型草坪草，在園林綠化、運(yùn)動(dòng)場(chǎng)建植、植物修復(fù)改良鹽堿地中具有極大的應(yīng)用潛力。海濱雀稗是典型的二倍體鹽土植物，可以耐受土壤中高達(dá)3.4%（電導(dǎo)率為54 dS·m-1）的可溶性鹽含量，在海岸的沙丘地帶、咸水池塘或河口能正常生長(zhǎng)，并用部分海水直接灌溉［6］。海濱雀稗對(duì)于土壤環(huán)境和水質(zhì)的適應(yīng)性較強(qiáng)，在鹽堿地土壤、水質(zhì)修復(fù)和沙丘固定等方面具有極大的應(yīng)用潛力［6-9］。通過(guò)建立鹽生植物海濱雀稗的遺傳轉(zhuǎn)化體系，進(jìn)而深入揭示耐鹽基因功能和調(diào)控機(jī)理，以便利用分子設(shè)計(jì)育種提高作物的耐鹽性，可以為農(nóng)作物的耐鹽品種選育提供理論基礎(chǔ)，為提高鹽堿地的利用提供優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源。

近年來(lái)，關(guān)于海濱雀稗耐鹽機(jī)理方面的研究主要集中在鹽脅迫下的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理、生化響應(yīng)等方面，而對(duì)關(guān)鍵耐鹽基因在耐鹽調(diào)控中的作用和通路研究較少。2008年利用海濱雀稗‘Sea Isle 1’的未成熟的花序莖段誘導(dǎo)產(chǎn)生的胚性愈傷組織，建立了再生體系［10］。通過(guò)化學(xué)誘變海濱雀稗離體再生組織，獲得了耐低溫的突變體［11］。2018年建立了海濱雀稗的遺傳轉(zhuǎn)化體系，但遺傳轉(zhuǎn)化效率較低且不穩(wěn)定［12］，且常因種子活力和純度低等問(wèn)題影響后續(xù)研究。因此，進(jìn)一步優(yōu)化海濱雀稗的遺傳轉(zhuǎn)化體系，探索更加高效穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化技術(shù)，是后續(xù)進(jìn)行分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)。本研究比較了兩種不同篩選劑對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響，同時(shí)進(jìn)一步優(yōu)化了轉(zhuǎn)化條件，并獲得了轉(zhuǎn)基因植株。

1 材料與方法

1.1 植物材料的消毒及處理

選取完全成熟且飽滿的海濱雀稗‘Sea Spray’品種的成熟種子為外植體，于2020年3月在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)育種實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展試驗(yàn)。種子用流水沖洗掉包衣、雜質(zhì)和稃皮后，裝入50 mL離心管中，在超凈臺(tái)中進(jìn)行種子的消毒處理。用75%酒精處理30 s后，使用10% NaClO溶液渦旋消毒30 min，然后用無(wú)菌水沖洗4～6次，吸除多余水分后，并用無(wú)菌濾紙吸干表面，每次接種5～10個(gè)培養(yǎng)皿。

1.2 菌株、質(zhì)粒、引物

選用2種質(zhì)粒載體（圖1A，B）：內(nèi)含GUS基因（β-葡萄糖醛酸糖苷酶基因）和hpt基因（潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，具有潮霉素抗性）的pCAMBIA1305.2和內(nèi)含GUS和bar基因（膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因，具有草丁膦抗性）的pCAMBIA3301；轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株AGL1中，作為農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的菌液。

圖1 植物表達(dá)載體圖譜Fig.1 Map of plant expression vector

1.3 不同類(lèi)型的培養(yǎng)基

在再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系中，使用的培養(yǎng)基類(lèi)型及配方見(jiàn)表1。

如圖3所示：隨著接種量的增加，水解度呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，在接種量為4%處達(dá)到最大值。隨著接種量的繼續(xù)增加，水解度反而降低，可能是由于山羊乳中的蛋白難以滿足過(guò)多菌體生長(zhǎng)需求，產(chǎn)酸過(guò)多抑制了蛋白的水解；或菌體釋放的蛋白酶不利于在強(qiáng)酸條件下作用，活性被抑制。

表1 培養(yǎng)基的類(lèi)型和配制方法Table 1 Types and preparation methods of culture medium

1.4 胚性愈傷組織的誘導(dǎo)繼代和再生

將消毒且吸干表面水分的滅菌種子平鋪于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在28℃、黑暗條件下培養(yǎng)5～10 d時(shí)及時(shí)拔除幼芽。根據(jù)愈傷組織的誘導(dǎo)情況，在30～40 d時(shí)將產(chǎn)生的愈傷組織在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中繼代。待顆粒狀的胚性愈傷組織產(chǎn)生后，選擇顏色鮮黃且結(jié)構(gòu)緊實(shí)的愈傷組織顆粒進(jìn)行繼代培養(yǎng)擴(kuò)繁。擴(kuò)繁90～180 d生長(zhǎng)健壯的胚性愈傷組織均可作為后續(xù)遺傳轉(zhuǎn)化的材料，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)。

選擇3個(gè)不同基因型的愈傷組織，挑選生長(zhǎng)狀態(tài)良好的愈傷組織每4周繼代1次，在16、24、36、48周繼代時(shí)，分別選取部分愈傷組織接種于再生培養(yǎng)基中，在光照培養(yǎng)箱（28℃，16 h光照，8 h黑暗）中進(jìn)行再生。每次進(jìn)行再生試驗(yàn)的愈傷組織繼代3個(gè)培養(yǎng)皿即3次重復(fù)，培養(yǎng)4～5周后統(tǒng)計(jì)愈傷組織的生長(zhǎng)時(shí)間對(duì)再生率的影響，摸索出愈傷組織具有最佳再生效率的生長(zhǎng)時(shí)間，確定愈傷組織能夠作為遺傳轉(zhuǎn)化材料的最佳時(shí)期。

1.5 胚性愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化

從-80℃冰箱中分別取出含有質(zhì)粒pCAMBIA1305.2和pCAMBIA3301的農(nóng)桿菌菌液，分別接種于20 mL含有50 mg·L-1卡那霉素和35 mg·L-1利福平的YEP液體培養(yǎng)基中，在28℃搖床中，200 r·min-1振蕩培養(yǎng)12～18 h，當(dāng)菌液濃度OD600值為0.6～1.0時(shí)，吸取農(nóng)桿菌菌液加入滅菌離心管中，在離心機(jī)中以2000 r·min-1離心5 min，倒掉YEP液體培養(yǎng)液收集菌體。

用MS液體繼代培養(yǎng)基重新懸浮至菌液濃度OD600值為0.6～1.0。將挑選出的顏色鮮黃、顆粒緊實(shí)的愈傷組織浸泡在菌液中；浸染20～30 min后，吸除愈傷組織上多余的菌液，并用滅菌濾紙吸干，將愈傷組織平鋪在有滅菌濾紙的MS繼代培養(yǎng)基中，在28℃培養(yǎng)箱中黑暗條件下共培養(yǎng)2 d。共培養(yǎng)后，用含有200 mg·L-1頭孢霉素的無(wú)菌水漂洗掉愈傷組織上多余的菌液，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到選擇繼代培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng)2～3周，有農(nóng)桿菌溢菌時(shí)，要及時(shí)轉(zhuǎn)移至新的選擇繼代培養(yǎng)基中。每個(gè)質(zhì)粒各進(jìn)行了5個(gè)批次的遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，每批轉(zhuǎn)化材料接種20～30個(gè)培養(yǎng)皿。

1.6 篩選壓的選擇

選取繼代16周且再生率高的基因型，進(jìn)行愈傷組織繼代和再生階段的最佳篩選壓試驗(yàn)。將一定數(shù)量的愈傷組織分別接種到含0、40、80、100、120 mg·L-1潮霉素的繼代培養(yǎng)基、含0、10、20、60、80 mg·L-1潮霉素的再生培養(yǎng)基；含0、0.2、0.4、0.8、1.2 mg·L-1草丁膦的繼代培養(yǎng)基和再生培養(yǎng)基。生長(zhǎng)5周后，分別移入不含篩選劑的再生培養(yǎng)基中生長(zhǎng)5周后統(tǒng)計(jì)再生率，3次重復(fù)，以確定抑制愈傷組織再生的最低篩選劑濃度為最佳篩選壓。

1.7 遺傳轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化

乙酰丁香酮（acetosyringone，AS）添加濃度的優(yōu)化：在浸染菌液濃度OD600為0.6中浸染30 min，使用超聲波處理5 min，比較浸染菌液中添加50、100、200 μmol·L-1濃度AS對(duì)GUS瞬時(shí)表達(dá)效率的影響。

Silwet L-77（表面活性劑）添加濃度的優(yōu)化：在浸染菌液濃度OD600為0.6中浸染30 min，使用超聲波處理5 min，添加100 μmol·L-1AS的轉(zhuǎn)化條件下，比較浸染菌液中分別添加0.01%、0.1%、0.3%濃度Silwet L-77對(duì)GUS瞬時(shí)表達(dá)效率的影響。

真空或超聲波處理時(shí)間的優(yōu)化：在浸染菌液濃度OD600為0.6中浸染30 min，添加100 μmol·L-1AS的轉(zhuǎn)化條件下，分別比較超聲波處理或真空處理0、10、20 min，對(duì)GUS瞬時(shí)表達(dá)效率的影響。

以上每個(gè)因素的優(yōu)化處理，均3次重復(fù)，共培養(yǎng)2 d后分別轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行轉(zhuǎn)化體的篩選。

1.8 抗性愈傷組織篩選和再生

將共培養(yǎng)后的胚性愈傷組織在選擇繼代培養(yǎng)基上每3～4周繼代一次（暗培養(yǎng)4～6周）；然后繼代到選擇再生培養(yǎng)基并轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)箱（28℃，8 h黑暗，16 h光照）培養(yǎng)，每3～4周繼代一次?？剐灾仓暝偕筠D(zhuǎn)移至選擇壯苗培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，3～5周后將抗性苗移至溫室中養(yǎng)護(hù)。

1.9 GUS基因瞬時(shí)、穩(wěn)定表達(dá)染色

將共培養(yǎng)2 d后的愈傷組織和篩選12～16周的抗性愈傷組織和抗性植株葉片浸于GUS染液中，置于37℃恒溫箱中12 h，使用96%乙醇脫色后，統(tǒng)計(jì)GUS瞬時(shí)表達(dá)或穩(wěn)定表達(dá)的結(jié)果。

1.1 0抗性植株的PCR檢測(cè)

通過(guò)CTAB法少量粗提野生型和抗性再生植株的DNA，通過(guò)snapgene軟件設(shè)計(jì)引物并交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。hpt基因的PCR擴(kuò)增516 bp引物為：hpt-F（5′-ATGTTGGCGACCTCGTATT-3′）；hpt-R（5′-CGTTATGTTTATCGGCACTTT-3′）。bar基 因 的PCR擴(kuò) 增434 bp引 物 為：bar-F（5′-GCTGCCAGAAACCCACG-3′）；bar-R（5′-CTGCACCATCGTCAACCAC-3′）。

1.1 1數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

分別統(tǒng)計(jì)每個(gè)批次進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的愈傷組織數(shù)，在之后的篩選過(guò)程中，統(tǒng)計(jì)抗性愈傷組織數(shù)、抗性愈傷組織和抗性再生植株葉片GUS穩(wěn)定表達(dá)的數(shù)量及最終經(jīng)檢測(cè)的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株數(shù)。

運(yùn)用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，并用Duncan法進(jìn)行多重比較，數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）；采用Excel 2019進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的整理和制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織培養(yǎng)年齡對(duì)再生的影響

海濱雀稗的成熟種子在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)6～8周，即可誘導(dǎo)出黃色顆粒狀且結(jié)構(gòu)緊實(shí)的胚性愈傷組織（圖2A，B）。每粒種子培養(yǎng)成的愈傷組織標(biāo)記為一個(gè)獨(dú)立的基因型。選取最優(yōu)的愈傷組織顆粒進(jìn)行擴(kuò)繁，用鑷子將其分割成2 mm左右的小顆粒進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)繁。在愈傷組織擴(kuò)繁的同時(shí)，對(duì)來(lái)自不同基因型的部分愈傷組織進(jìn)行再生（圖2C，D）。通過(guò)統(tǒng)計(jì)繼代時(shí)間對(duì)愈傷組織再生率和褐化率的影響，可選擇具有最高再生率的基因型和愈傷組織年齡作為后續(xù)遺傳轉(zhuǎn)化的材料。

圖2 愈傷組織年齡對(duì)再生的影響Fig.2 Effect of callus age on regeneration

隨繼代培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，所有基因型愈傷組織的再生率均降低。基因型1和2在繼代培養(yǎng)24周后的再生率均無(wú)顯著下降；繼代培養(yǎng)36周后的再生率均顯著下降，褐化率均顯著升高；繼代培養(yǎng)48周基因型2的再生率僅28.4%，愈傷組織的褐化率高且質(zhì)量下降較快。由此可見(jiàn)，愈傷組織繼代培養(yǎng)的年齡對(duì)再生的影響因基因型的不同而不同?；蛐?的愈傷組織狀態(tài)在多次繼代后，仍能保持較好的生長(zhǎng)狀態(tài)，繼代48周的愈傷組織狀態(tài)大部分仍可以保持黃色的緊實(shí)顆粒狀，且再生率在67.6%以上，依然可以作為后續(xù)遺傳轉(zhuǎn)化的基因型。但基因型2在培養(yǎng)36周左右的愈傷組織質(zhì)量下降明顯，已不適合做后續(xù)的遺傳轉(zhuǎn)化材料（圖2E，F(xiàn)）。

2.2 潮霉素篩選壓的確定

愈傷組織的繼代培養(yǎng)和再生過(guò)程對(duì)潮霉素敏感程度不同，因此不同篩選階段的最佳篩選壓也不同。繼代培養(yǎng)階段的愈傷組織對(duì)潮霉素抗性較高，在含有120 mg·L-1潮霉素的繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)4周后，轉(zhuǎn)移至再生培養(yǎng)基生長(zhǎng)4周，仍有25.0%的愈傷組織具有再生能力（圖3A，C）。愈傷組織在含不同濃度潮霉素的再生培養(yǎng)基上表現(xiàn)得敏感度較高，當(dāng)再生培養(yǎng)基中添加80 mg·L-1潮霉素時(shí)，再生率可降低至22.2%（圖3B，D）。由此可見(jiàn)，海濱雀稗胚性愈傷組織的再生階段對(duì)潮霉素較為敏感，是農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化后抗性愈傷組織篩選的重要階段，可在繼代培養(yǎng)基中添加120 mg·L-1潮霉素篩選6～8周，然后轉(zhuǎn)入含有80或100 mg·L-1潮霉素的選擇再生培養(yǎng)基繼續(xù)進(jìn)行篩選，并且可適當(dāng)延長(zhǎng)篩選時(shí)間，以盡量降低假陽(yáng)性轉(zhuǎn)化體的存在。

圖3 潮霉素對(duì)胚性愈傷組織繼代培養(yǎng)和再生的影響Fig.3 Effects of hygromycin on embryogenic callus subculture and regeneration

2.3 草丁膦篩選壓的確定

愈傷組織在繼代、再生階段對(duì)草丁膦的敏感程度均較高。接種于含有草丁膦繼代培養(yǎng)基中的愈傷組織的生長(zhǎng)速度和質(zhì)量均受到了明顯的抑制，愈傷組織隨著草丁膦濃度的升高，生長(zhǎng)速度受抑制的程度越高；在含有1.2 mg·L-1草丁膦的繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)4周后，愈傷組織最小且顏色呈黃褐色；接種到再生培養(yǎng)基后僅有1.67%的愈傷組織能夠再生，且再生苗生長(zhǎng)極慢（圖4A，C）。愈傷組織在含不同濃度草丁膦再生培養(yǎng)基中的敏感度相對(duì)較低，在再生培養(yǎng)基中添加0.4 mg·L-1草丁膦，對(duì)再生率影響較?。划?dāng)添加1.2 mg·L-1草丁膦時(shí)，仍有15.0%的愈傷組織可以再生，再生苗部分生長(zhǎng)受到較大抑制，但仍有再生苗生長(zhǎng)較好（圖4B，C）。由此可見(jiàn)，海濱雀稗的胚性愈傷組織對(duì)草丁膦較為敏感的階段是在愈傷組織的繼代階段，也是農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化后抗性愈傷組織篩選的關(guān)鍵階段，在繼代和再生階段均可以使用1.2 mg·L-1草丁膦作為適宜的篩選壓。

圖4 草丁膦對(duì)胚性愈傷組織繼代培養(yǎng)和再生的影響Fig.4 Effects of glufosinate on embryogenic callus subculture and regeneration

2.4 轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化

為了進(jìn)一步提高農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化效率，試驗(yàn)通過(guò)GUS瞬時(shí)表達(dá)染色，對(duì)相關(guān)的影響因素進(jìn)行了單因素條件的優(yōu)化。在浸染轉(zhuǎn)化共培養(yǎng)2 d后，統(tǒng)計(jì)愈傷組織的GUS瞬時(shí)染色效率，從而摸索影響遺傳轉(zhuǎn)化的最佳處理?xiàng)l件。添加適當(dāng)濃度AS到農(nóng)桿菌的浸染液中，可以顯著提高瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率，但隨著添加AS濃度的增加對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響不顯著（圖5A，E）。在浸染的農(nóng)桿菌菌液中添加低濃度的表面活性劑Silwet L-77可顯著提高瞬時(shí)表達(dá)效率，添加0.01%和0.1%的Silwet L-77后其GUS瞬時(shí)表達(dá)效率顯著提高，分別為78.07%和80.1%，雖然添加0.5%高濃度的Silwet L-77的GUS瞬時(shí)表達(dá)效率最高，但是卻對(duì)愈傷組織造成明顯的傷害，在共培養(yǎng)后，愈傷組織明顯褐化且表面呈現(xiàn)粘稠狀，極大降低了愈傷組織的后續(xù)繁殖和再生（圖5B，F(xiàn)）。在浸染階段，通過(guò)增加超聲波處理，可在愈傷組織表面產(chǎn)生更多有利農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的小傷口，可以顯著地提高瞬時(shí)表達(dá)效率。超聲波處理20 min的GUS瞬時(shí)表達(dá)效率最高且差異顯著，愈傷組織的GUS瞬時(shí)表達(dá)效率高達(dá)94.17%。因超聲波處理后愈傷組織狀態(tài)沒(méi)有明顯改變，且后續(xù)篩選過(guò)程中無(wú)法跟蹤評(píng)估更長(zhǎng)時(shí)間的超聲波處理是否對(duì)愈傷組織的傷害程度更高，因此可以選擇20 min超聲波處理，或者適當(dāng)降低處理時(shí)間（圖5C，G）。在浸染階段通過(guò)真空處理，可有效增加愈傷組織和菌液的接觸，從而顯著提高GUS瞬時(shí)表達(dá)效率，但處理10或20 min對(duì)表達(dá)效率無(wú)顯著差異，因此為盡量降低對(duì)愈傷組織的傷害，可以選擇10 min為最佳的真空處理時(shí)間（圖5D，G）。

圖5 不同因素對(duì)GUS瞬時(shí)表達(dá)效率的影響Fig.5 Factors affecting on percentage of transient GUS expression

2.5 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的不同質(zhì)粒GUS穩(wěn)定表達(dá)效率和轉(zhuǎn)化效率的統(tǒng)計(jì)

挑選黃色顆粒狀且結(jié)構(gòu)緊實(shí)的愈傷組織，在滅菌的空培養(yǎng)皿中分別用含有兩種不同質(zhì)粒的AGL1農(nóng)桿菌菌液進(jìn)行浸染，在浸染菌液濃度OD600為0.6時(shí)，菌液中同時(shí)添加100 μmol·L-1AS和0.01%的Silwet L-77，浸染過(guò)程中先超聲波處理20 min，然后再真空處理10 min，浸染30 min后共培養(yǎng)2 d。之后分別接種于含有120 mg·L-1潮霉素、200 mg·L-1頭孢噻肟（圖6A）和含有1.2 mg·L-1草丁膦、200 mg·L-1頭孢噻肟（圖6D）的選擇繼代培養(yǎng)基進(jìn)行抗性愈傷組織的篩選，繼代3～5次后，將抗性愈傷組織進(jìn)行GUS染色呈深藍(lán)色（圖6B，E），表明GUS基因在抗性愈傷組織中獲得了穩(wěn)定表達(dá)。將抗性愈傷組織再分別轉(zhuǎn)到含有80 mg·L-1潮霉素和200 mg·L-1頭孢噻肟或者含有1.2 mg·L-1草丁膦和200 mg·L-1頭孢噻肟的選擇再生培養(yǎng)基上，再生的同時(shí)進(jìn)一步篩選，篩選過(guò)程中非抗性愈傷組織逐漸變褐死亡，而部分抗性愈傷組織能夠在選擇再生培養(yǎng)基中再生出健康的植株（圖6C，F(xiàn)）。將抗性再生的幼苗進(jìn)行壯苗后，轉(zhuǎn)至溫室中單株種植（圖6G）。分別剪取部分抗性再生植株的葉片，進(jìn)行GUS染色并用酒精脫色后葉片兩端仍呈深藍(lán)色（圖6H），說(shuō)明GUS基因在抗性植株中穩(wěn)定表達(dá)。

圖6 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的胚性愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化及GUS染色Fig.6 Agrobacterium-mediated transformation of embryogenic calli and result of GUS staining

在以上農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的最優(yōu)條件下，2種質(zhì)粒各進(jìn)行了5個(gè)批次的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)化。共轉(zhuǎn)化hpt做篩選標(biāo)記的愈傷組織329粒，篩選出74個(gè)克隆的抗性愈傷組織，其中55個(gè)克隆成功再生出抗性苗，其中抗性苗的葉片GUS染色呈現(xiàn)藍(lán)色的共48個(gè)克隆，占獲得抗性再生植株克隆數(shù)的87.3%，根據(jù)PCR鑒定的陽(yáng)性抗性苗的平均轉(zhuǎn)化效率為14.46%。共轉(zhuǎn)化bar做篩選標(biāo)記的愈傷組織355粒，篩選獲得抗性愈傷組織和抗性苗的數(shù)量均較低，平均轉(zhuǎn)化效率為5.65%。由此可見(jiàn)，以潮霉素為篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)化效率較高，適合在海濱雀稗轉(zhuǎn)基因中使用（表2）。

表2 兩種不同質(zhì)粒的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化效率Table 2 Summary of transformation efficiencies of Agrobacterium transformation using embryogenic callus

2.6 抗性再生植株的PCR檢測(cè)

通過(guò)分別擴(kuò)增外源hpt或bar片段，對(duì)野生型和農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的抗性再生植株進(jìn)行陽(yáng)性檢測(cè)。結(jié)果表明，野生型植株在516或434 bp處均無(wú)擴(kuò)增條帶，對(duì)獲得的葉片GUS染色為深藍(lán)色的64株具有潮霉素抗性的再生植株進(jìn)行PCR檢測(cè)，除No.6沒(méi)有擴(kuò)增出hpt條帶外，其他63株均在葉片中擴(kuò)增出516 bp的陽(yáng)性條帶，說(shuō)明外源hpt基因在受體植株中獲得了穩(wěn)定表達(dá)（圖7A）。在18株葉片GUS染色為深藍(lán)色的草丁膦抗性植株中，均擴(kuò)增出了434 bp的陽(yáng)性條帶，表明bar基因已在轉(zhuǎn)基因海濱雀稗植株的基因組穩(wěn)定表達(dá)（圖7B）。

圖7 抗性再生植株的PCR檢測(cè)Fig.7 PCR test results of resistant regenerated plants

3 討論

隨著分子設(shè)計(jì)育種的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因育種以其周期短、目標(biāo)性狀精準(zhǔn)可控等優(yōu)點(diǎn)成為草坪草育種中的重要方法。海濱雀稗應(yīng)用廣泛且具有非常強(qiáng)的耐鹽性，是目前最耐鹽的暖季型草坪草［13］，然而目前國(guó)內(nèi)育種進(jìn)程緩慢，所有商業(yè)品種均來(lái)自國(guó)外［14-17］。目前，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化具有多個(gè)突出優(yōu)點(diǎn)，仍是禾本科轉(zhuǎn)基因的主要方法，然而禾本科因不是農(nóng)桿菌的天然宿主，特別是暖季型草坪草的再生和轉(zhuǎn)化難度更大［18-19］。本研究建立了hpt和bar兩種篩選標(biāo)記的遺傳轉(zhuǎn)化體系，并分別獲得了陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株，潮霉素作為篩選劑的平均轉(zhuǎn)基因效率可以達(dá)18.93%。海濱雀稗高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立為進(jìn)一步加快育種進(jìn)程奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

以成熟種子作為愈傷組織誘導(dǎo)的外植體，具有不受季節(jié)性影響并且取材方便的優(yōu)點(diǎn)［20］，目前已在多種草坪草如黑麥草（Lolium perenne）、紫羊茅（Festuca rubra）、日本結(jié)縷草（Zoysia japonica）、早熟禾（Poa annua）成功建立了離體再生體系［21］。此外，也可以采用未成熟胚、莖尖分生組織、根尖、花序、匍匐莖等部位作為禾本科的外植體來(lái)源，建立組織培養(yǎng)再生體系［22］。Liu等［11］以海濱雀稗‘Sea Spray’品種的成熟種子為外植體建立了再生體系，比較了不同外源物質(zhì)對(duì)組織培養(yǎng)再生的影響。因海濱雀稗的自交不親和性，每粒種子代表著不同的遺傳信息，本研究選擇來(lái)自同一基因型的愈傷組織，比較了繼代時(shí)間對(duì)再生率的影響，最佳的可用于遺傳轉(zhuǎn)化的愈傷組織繼代時(shí)間為36周左右，既能保證有足夠數(shù)量的愈傷組織，又可以保證具有較高的再生效率。

潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（hpt）和膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（bar）是禾本科轉(zhuǎn)化中最常用的篩選標(biāo)記基因［23-24］，已在多種轉(zhuǎn)基因禾本科草中獲得成功［25-28］。海濱雀稗在不同的發(fā)育階段對(duì)潮霉素和草丁膦的敏感性有所不同。海濱雀稗的胚性愈傷組織在繼代階段對(duì)草丁膦較為敏感，是篩選的關(guān)鍵階段，1.2 mg·L-1草丁膦可作為整個(gè)篩選過(guò)程的適宜篩選壓。在繼代階段愈傷組織對(duì)潮霉素的抗性較高，在含有120 mg·L-1潮霉素的繼代培養(yǎng)基中仍有部分可再生，而再生階段對(duì)潮霉素的耐性較低，在80 mg·L-1潮霉素濃度的再生培養(yǎng)基中愈傷組織再生率較低。由此可見(jiàn)，海濱雀稗具有較高的潮霉素耐性，而在高羊茅（Festuca elata）、柳枝稷（Panicum virgatum）、假儉草（Eremochloa ophiuroides）和結(jié)縷草中使用的潮霉素篩選濃度在50 mg·L-1左右，并獲得了轉(zhuǎn)基因植株［29-32］。在農(nóng)桿菌浸染轉(zhuǎn)化過(guò)程中，各種處理對(duì)愈傷組織都具有一定的傷害，而潮霉素對(duì)愈傷組織也具有不良影響，對(duì)陽(yáng)性愈傷組織的再生具有較大壓力。因此，在選擇繼代的篩選階段使用相對(duì)低濃度的潮霉素，抑制部分假陽(yáng)性愈傷組織生長(zhǎng)的同時(shí)，可對(duì)陽(yáng)性的愈傷組織生長(zhǎng)提供緩沖的時(shí)間；而在愈傷組織選擇再生的篩選階段使用高濃度的篩選壓，由此獲得了更高的轉(zhuǎn)化效率。

遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程的不同處理可以明顯影響轉(zhuǎn)基因效率。本研究根據(jù)前期建立的海濱雀稗遺傳體系，在轉(zhuǎn)化條件菌液濃度OD600=0.6，輔以超聲波處理，共培養(yǎng)2 d的基礎(chǔ)上［12］，通過(guò)添加100 μmol·L-1乙酰丁香酮和0.01%的Silwet L-77，并提高超聲波的處理時(shí)間至20 min，同時(shí)輔以真空處理10 min，明顯提高了海濱雀稗的平均遺傳轉(zhuǎn)化效率。以潮霉素作為篩選劑的平均轉(zhuǎn)基因效率提高至14.46%，并且還獲得了以草丁膦為篩選劑的轉(zhuǎn)基因植株。

乙酰丁香酮（AS）通過(guò)誘發(fā)農(nóng)桿菌Ri或Ti質(zhì)粒上Vir區(qū)基因的活化，可有效地提高轉(zhuǎn)化效率［33-34］。不同AS濃度（50～400 μmol·L-1）對(duì)不同植物受體轉(zhuǎn)化效率的影響程度不同［35］。添加50～300 μmol·L-1的AS，丁香羅勒（Ocimum gratissimum）的GUS表達(dá)效率呈升高趨勢(shì)，但添加400 μmol·L-1時(shí)表達(dá)效率下降［36］。在花生（Arachis hypogaea）轉(zhuǎn)化 的 共培養(yǎng)過(guò) 程的培養(yǎng) 基 中添加200 μmol·L-1，瞬時(shí)轉(zhuǎn) 化效率最 高 為80%［37］。在 金發(fā)草（Pogonatherum paniceum）的轉(zhuǎn)化中添加40 mg·L-1AS的轉(zhuǎn)化效率最高為67.3%［38］。海濱雀稗的轉(zhuǎn)化中通過(guò)添加50～200 μmol·L-1的AS均可獲得較高的GUS瞬時(shí)表達(dá)效率。

表面活性劑能夠在農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化過(guò)程中，通過(guò)增加細(xì)胞膜通透性，提高農(nóng)桿菌T-DNA插入受體細(xì)胞的效率［39-40］。植物遺傳轉(zhuǎn)化中，Silwet L-77是應(yīng)用較為廣泛的一種表面活性劑，可有效提高轉(zhuǎn)化效率［41］。在菌液中添加0.01%～0.02%濃度的Silwet L-77，可提高玉米（Zea mays）幼胚愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化效率［42］。本研究中，添加0.01%和0.1%濃度的Silwet L-77的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率較高；濃度提高至0.5%的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率最高，但愈傷組織外觀已部分或全部褐變。在玉米胚珠的轉(zhuǎn)化中添加0.1% Silwet L-77的轉(zhuǎn)化效率最高［41］，本試驗(yàn)結(jié)果與其相似。由此可見(jiàn)，添加適當(dāng)濃度的Silwet L-77可有效提高瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率，但因受體材料的質(zhì)地不同，對(duì)表面活性劑耐受力差異較大，需要通過(guò)試驗(yàn)確定最佳添加濃度。

超聲波處理可通過(guò)在愈傷組織表面形成微傷口，使農(nóng)桿菌更易穿透細(xì)胞壁［43］；真空處理可在農(nóng)桿菌浸染中增加和愈傷組織的深度接觸，從而均可有效地提高轉(zhuǎn)化效率［44］。但需根據(jù)受體材料的質(zhì)地和特性，選擇合適的處理時(shí)間和強(qiáng)度。本研究中，在農(nóng)桿菌浸染過(guò)程中分別輔以超聲波處理20 min和真空處理10 min，均可顯著提高轉(zhuǎn)化效率。

4 結(jié)論

本研究以海濱雀稗‘Sea Spray’成熟種子為外植體，進(jìn)一步優(yōu)化了海濱雀稗遺傳轉(zhuǎn)化體系。愈傷組織繼代36周后的再生率會(huì)顯著下降，以繼代24周的愈傷組織為轉(zhuǎn)化材料，在菌液（OD600=0.6）中添加100 μmol·L-1乙酰丁香酮和0.01%的Silwet L-77，浸染過(guò)程中輔以超聲波處理20 min或真空處理10 min，浸染30 min后共培養(yǎng)2 d。在繼代和再生階段使用最佳的篩選壓進(jìn)行篩選，分別獲得了表達(dá)hpt和bar基因的轉(zhuǎn)基因植株。潮霉素更適合作為海濱雀稗遺傳轉(zhuǎn)化中的篩選劑，能夠獲得較高的轉(zhuǎn)化效率。