石夢(mèng)琦，馮濤，孔秋蓮，戚文元，王亮*，宋詩(shī)清，姚凌云，孫敏，王化田

（1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046；2.上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)香料香精技術(shù)與工程學(xué)院，上海 201418；3.上海束能輻照技術(shù)有限公司，上海 201403；4.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，上海 201403）

輻照技術(shù)是一種用來(lái)延長(zhǎng)貨架期的新興綠色加工保鮮技術(shù)。目前大多數(shù)食品利用傳統(tǒng)熱殺菌技術(shù)控制引起腐敗的生理過(guò)程和消滅微生物，但熱殺菌的高溫條件會(huì)影響其外觀和口感[1-2]，而輻照技術(shù)屬于非熱力食品加工技術(shù)，為滿足人們對(duì)新鮮食品營(yíng)養(yǎng)豐富、感官屬性、安全性和延長(zhǎng)貨架期的需求，輻照技術(shù)可以對(duì)冷凍或冷鮮食品進(jìn)行殺菌，并能保證更有效的儲(chǔ)存，提高消費(fèi)者滿意度。特別是輻照處理肉品，不僅能減少肉品中大多數(shù)微生物，而且沒有放射性污染以及化學(xué)殘留[3-4]。輻照技術(shù)是利用鈷-60和銫-137等放射源產(chǎn)生電離輻射進(jìn)行殺菌，例如用X射線、γ射線或電子束輻射與物質(zhì)相互作用后產(chǎn)生物理、化學(xué)和生物反應(yīng)。相關(guān)研究顯示，利用X射線輻照技術(shù)最好控制在5 MeV以下，高能電子束輻照最好控制在10 MeV以下[5]。

我國(guó)《輻射食品衛(wèi)生管理辦法》僅允許使用γ射線或電子束射線，而電子束輻照具有輻照效率高、可操作性強(qiáng)、對(duì)食品品質(zhì)影響小的優(yōu)點(diǎn)[6-7]。這與李新等[8]研究結(jié)果一致，該研究選用γ射線和10 MeV電子束兩種輻照技術(shù)，對(duì)新鮮冷卻豬后腿肉進(jìn)行3 kGy輻照處理，第30天時(shí)樣品中細(xì)菌總數(shù)小于10 cfu/g；γ射線輻照樣品中過(guò)氧化值、硫代巴比妥酸值與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量均高于電子束輻照，表明相同劑量下電子束輻照殺菌效果較好。電子束輻照技術(shù)是由電子加速器產(chǎn)生電子束射線，利用高能脈沖直接作用破壞活體生物細(xì)胞內(nèi)DNA或間接作用使小分子與水發(fā)生輻解，形成-OH、-H等活性自由基與核內(nèi)物質(zhì)作用發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)[9]。研究表明，通過(guò)低劑量電子束輻照處理冷鮮豬肉能有效減少冷鮮肉中的微生物數(shù)量，1.25 kGy電子束輻照可以殺滅冷鮮豬肉中90%微生物，1.5 kGy及以上劑量輻照可以完全殺滅大腸菌群[10]。因此在肉類食品中微生物存活率與輻照劑量呈反比關(guān)系，并且輻照處理影響其脂肪和蛋白質(zhì)的氧化。

目前市場(chǎng)上銷售的肉包括熱鮮肉、冷凍肉和冷鮮肉，冷鮮肉在營(yíng)養(yǎng)、安全、口感等方面具有優(yōu)勢(shì)，并且不易發(fā)生交叉污染、安全性高，被視為傳統(tǒng)熱鮮肉和冷凍肉的替代品，因此冷鮮肉是生鮮肉發(fā)展的必然趨勢(shì)[11]。雖然冷鮮肉已廣泛銷售，但也存在沙門氏菌等致病菌感染的安全隱患，而輻照處理能有效殺滅冷鮮肉中病原菌及寄生蟲，保證其在儲(chǔ)運(yùn)和銷售中的衛(wèi)生安全。李新等[12]研究表明，2.4 kGy輻照處理真空包裝的冷鮮肉察覺不到所產(chǎn)生的異味，能有效抑制脂肪氧化。

食品輻照作為一種冷殺菌技術(shù)，在影響肉類食品部分營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)及色澤的同時(shí)，也會(huì)對(duì)風(fēng)味產(chǎn)生影響。豬肉的風(fēng)味由氣味和滋味組成，其中滋味主要由滋味活性物質(zhì)與味蕾接觸產(chǎn)生，一般包括酸味、甜味、鮮味、咸味和苦味，氣味主要體現(xiàn)為揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)是一類小分子，它是食品中最重要的感官質(zhì)量指標(biāo)之一[13]。豬肉風(fēng)味的來(lái)源是蛋白質(zhì)、脂肪、微量礦物質(zhì)、碳水化合物和維生素等風(fēng)味前體物質(zhì)，其中起關(guān)鍵作用的主要是蛋白質(zhì)與脂肪[14]。

里脊肉也稱為背最長(zhǎng)肌，與豬身其他部位相比，豬背最長(zhǎng)肌中肌內(nèi)脂肪含量低[15]，并且豬里脊肉作為肉食更美味，因此選用冷鮮豬里脊肉作為研究對(duì)象。食品輻照對(duì)易受到微生物攻擊的產(chǎn)品進(jìn)行殺菌是有效的，特別是對(duì)未經(jīng)熱處理銷售的食品，如生家禽、肉類和海鮮等。由于冷鮮豬里脊肉的保質(zhì)期有限且容易受到微生物污染，所以選用電子束輻照技術(shù)進(jìn)行保鮮處理，為了確定適宜的劑量保證風(fēng)味能達(dá)到良好的水平，需要對(duì)其進(jìn)行分析研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬里脊肉：市售，用保溫袋及冰袋運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

鄰二氯苯（分析純）：上海泰坦科技股份有限公司；三氯乙酸、二氯甲烷（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；C6～C30正構(gòu)烷烴、17種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品（均為色譜純）：美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Heracles II快速氣相電子鼻系統(tǒng)（MXT-5弱極性柱和MXT-1701中等極性柱、2個(gè)氫火焰離子化檢測(cè)器）：法國(guó)阿爾法莫斯儀器公司；7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀、1260型高效液相色譜儀：安捷倫科技（中國(guó)）有限公司；ASTREE電子舌、電子舌系統(tǒng)：法國(guó)Alpha M.O.S公司；SPME手動(dòng)進(jìn)樣手柄（50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭）：美國(guó)Supelco公司；IS1020電子加速器：同方威視技術(shù)股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

將冷鮮豬里脊肉分裝于聚乙烯自封袋中，每份肉樣約50 g，每片肉厚度不超過(guò)1 cm，以備輻照處理。

1.3.2 輻照處理

將前處理后的肉樣進(jìn)行輻照處理，輻照能量為10 MeV，輻照劑量為 0、1、2、3、4 kGy，其中 0 kGy 為對(duì)照組。每一組輻照樣品單包排列不重疊放置，保證輻照均勻，輻照完畢后立即置于4℃冰箱中貯藏備用。

1.3.3 氣相色譜電子鼻分析

取適量的不同輻照劑量處理的肉樣絞碎為肉糜，準(zhǔn)確稱取（2.00±0.02）g樣品于20 mL頂空瓶中，加緊蓋子密封待測(cè)，每個(gè)樣品設(shè)置4個(gè)平行樣。每4個(gè)平行樣后放置一個(gè)空瓶，以降低樣品間的誤差。Heracles II系統(tǒng)內(nèi)置兩根不同的色譜柱，MXT-5為非極性色譜柱，MXT-1701為弱極性色譜柱，氫火焰離子化檢測(cè)器為分析檢測(cè)器。

1.3.4 電子舌分析

分別稱取不同輻照劑量處理的豬肉樣品（2.00±0.02）g，置于離心管中，加入25 mL蒸餾水，均質(zhì)后超聲5 min置于室溫20℃中靜置15 min，4℃條件下10 000 r/min離心10 min，取上清液過(guò)濾后用100 mL容量瓶收集濾液定容，每個(gè)樣品取80 mL樣液用電子舌檢測(cè)，每個(gè)樣品均做3次重復(fù)試驗(yàn)。

測(cè)量程序：依次用清洗液清洗90 s、兩種參比液各清洗120 s，傳感器位于平衡位置歸零30 s，平衡后開始測(cè)試30 s；再次于兩種參比液中清洗3 s后，傳感器再放入新參比液中測(cè)試回味30 s。以此循環(huán)測(cè)試4次，除去第1次循環(huán)，以后面3次測(cè)試的平均數(shù)據(jù)作為結(jié)果。每次清洗、平衡和測(cè)試回味的液體均在不同樣品杯中[16]。

1.3.5 游離氨基酸測(cè)定

分別稱取輻照處理好的肉樣（1.500±0.010）g，加入5%三氯乙酸溶液，均質(zhì)后超聲15 min于4℃冰箱中靜置2 h，靜置后在4℃條件下10 000 r/min離心10 min，取上清液5 mL并且調(diào)節(jié)pH值為2.0，然后定容至10 mL，搖勻后用0.22 μm水相濾膜過(guò)濾后待測(cè)。

色譜條件：色譜柱ODS Hypersil（250 mm×4.6 mm×5μm）、柱溫40℃、進(jìn)樣量10μL、紫外檢測(cè)波長(zhǎng)338nm，脯氨酸為262 nm；流動(dòng)相A：7.35 mmol/L乙酸鈉∶三乙胺 ∶四氫呋喃=500∶0.12∶2.5（體積比），流動(dòng)相 B：5 mmol/L乙酸鈉 ∶甲醇 ∶乙腈（1∶2∶2，體積比），通過(guò)滴加5%醋酸溶液，將流動(dòng)相的pH值調(diào)至7.2。通過(guò)17種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用外標(biāo)法對(duì)肉樣游離氨基酸進(jìn)行定量分析。

1.3.6 頂空-固相微萃取

將萃取頭老化20 min后備用，稱取輻照處理好的肉樣（4.00±0.04）g（精確到 0.01 g）置于 20 mL 頂空瓶中并加入4 mL飽和氯化鈉以及4 μm內(nèi)標(biāo)（100 mg/L鄰二氯苯），用聚四氟乙烯隔墊蓋密封置于40℃水浴鍋中平衡10 min，再用萃取好的萃取頭插入頂空瓶中萃取30 min，最后將萃取頭拔出置于250℃的進(jìn)樣口解吸5 min。

經(jīng)頂空-固相微萃?。╤eadspace solid-phase microextraction，HS-SPME）提取的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)通過(guò)GCMS進(jìn)行分析。

色譜條件：DB-Wax分析型熔融石英毛細(xì)管色譜柱和DB-5分析型熔融石英毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；高純氦氣作為載氣，恒定流速為1.0 mL/min，采用無(wú)分流模式進(jìn)樣，起始溫度為40℃，保持3 min，以3℃/min速度升溫至140℃保持6 min，以5℃/min速度升溫至230℃保持8 min。

質(zhì)譜條件：電離方式為電子轟擊電離（electron impact，EI），電子轟擊能量為 70 eV，采用全掃描模式采集信號(hào)，掃描范圍為35 amu～350 amu，離子源溫度為230℃。

1.3.7 揮發(fā)性物質(zhì)定性方法

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)正構(gòu)烷烴（C6～C20）在相同GC-MS檢測(cè)條件下的保留時(shí)間，采用Kovats法計(jì)算揮發(fā)性物質(zhì)保留指數(shù)（retention index，RI），計(jì)算公式如下。

RIx=（lg tx-lg tn）/（lg tn+1-lg tn+Z）×100

式中：RIx、tx分別為待測(cè)化合物的保留指數(shù)和保留時(shí)間，min；tn、tn+1分別為碳原子數(shù)為n和n+1正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間，min；Z為未知化合物的正構(gòu)烷烴的碳原子數(shù)。

1.3.8 揮發(fā)性物質(zhì)的定量方法

用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量，內(nèi)標(biāo)物為鄰二氯苯，計(jì)算公式如下。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用軟件AlphaSoft進(jìn)行主成分分析，其他數(shù)據(jù)采用軟件SPSS 19.0分析。

定性方法通過(guò)NIST 11譜庫(kù)比對(duì)不同出峰時(shí)間化合物的質(zhì)譜圖，選擇匹配度大于80（最大匹配度為100），并結(jié)合人工解譜，確定該化合物的鑒定結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 電子鼻分析結(jié)果

不同輻照劑量的豬里脊肉電子鼻主成分分析（principal component analysis，PCA）見圖1。不同輻照劑量的豬里脊肉進(jìn)行電子鼻判別因子分析（discriminant factor analysis，DFA）見圖 2。

圖1 不同劑量輻照處理的豬里脊肉電子鼻主成分分析Fig.1 Principal component analysis diagram of electronic nose of pork tenderloin irradiated at different doses

圖2 不同劑量輻照處理的豬里脊肉電子鼻判別因子分析Fig.2 Discriminant factors of the electronic nose of pork tenderloin irradiated at different doses

由圖1可知，PC1方差貢獻(xiàn)率為59.393%，PC2方差貢獻(xiàn)率為27.866%，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為87.259%，即主成分可以代表所測(cè)樣品中氣味數(shù)據(jù)中的絕大部分信息。在PCA圖中，橫坐標(biāo)距離越近，代表兩樣品間揮發(fā)性物質(zhì)差異越小，因PC2貢獻(xiàn)率較小，即使縱坐標(biāo)距離相差較遠(yuǎn)，也可視為兩樣品間不存在明顯差異。識(shí)別指數(shù)（discrimination index，DI）值能體現(xiàn)不同樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)輪廓的區(qū)分度，絕對(duì)值越大則樣品間重疊程度越大，表明樣品信息越接近，圖1中DI值為70，3 kGy和4 kGy樣品有重疊部分，有聚類趨勢(shì)，說(shuō)明兩種劑量輻照處理的豬里脊肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分較接近；未輻照（0 kGy）樣品與2、1 kGy樣品有距離，說(shuō)明電子鼻很好地區(qū)分了不同劑量輻照的豬里脊肉樣品，它們?cè)谛岣猩洗嬖诿黠@差別，同時(shí)2 kGy樣品距離未輻照樣品（0 kGy）最近，說(shuō)明其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)最接近未輻照樣品。

由圖2可知，橫、縱坐標(biāo)分別對(duì)應(yīng)第1、2線性判別函數(shù)的判別效率DF1和DF2。兩線性判別函數(shù)的累計(jì)判別效率為97.312%，表明使用DFA可以區(qū)分不同輻照劑量處理的豬里脊肉樣品。圖2中不同劑量輻照的樣品橫坐標(biāo)存在明顯差異，說(shuō)明電子束輻照處理后豬里脊肉風(fēng)味發(fā)生變化，不同輻照劑量對(duì)豬里脊肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生影響，經(jīng)過(guò)2 kGy輻照處理的肉樣揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分能夠更好地維持其原有的揮發(fā)性風(fēng)味，與PCA分析結(jié)果相同。

2.2 電子舌分析結(jié)果

以參比溶液為基準(zhǔn)的不同劑量輻照的豬里脊肉電子舌味覺雷達(dá)圖見圖3。

圖3 以參比溶液為基準(zhǔn)的不同劑量輻照的豬里脊肉電子舌味覺雷達(dá)Fig.3 Taste radar map of electronic tongue of pork tenderloin irradiated at different doses based on the reference solution

電子舌所用的TS5000Z味覺分析系統(tǒng)將傳感器輸出的電勢(shì)值轉(zhuǎn)換為味覺信息，電子舌分析顯示的雷達(dá)圖能客觀具體表明各樣品之間的味覺差異，若低于一個(gè)單位則感知不到其味覺變化[17-19]。由圖3可知，除了豐富度、鮮味、澀味回味，其他味覺指標(biāo)均呈現(xiàn)不同程度的差異。其中酸味最大的為0 kGy肉樣；甜味最大的是樣品1 kGy肉樣，其與未輻照處理的樣品0 kGy肉樣有一定差異；苦味中1kGy肉樣最苦，而未輻照0 kGy肉樣苦味最小；2 kGy有較大的苦味回味。

2.3 游離氨基酸分析

不同劑量輻照處理的豬里脊肉游離氨基酸組成見表1。

表1 不同劑量輻照處理的豬里脊肉游離氨基酸組成Table 1 Free amino acid composition of pork tenderloin irradiated at different doses

由表1可知，游離氨基酸含量不同可以體現(xiàn)出不同劑量電子束輻照豬里脊肉的呈味差異。1、2、3、4 kGy輻照樣品游離氨基酸總含量均低于對(duì)照組0 kGy樣品（408.61 mg/100 g）。輻照處理后的樣品中亮氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、絲氨酸含量下降，表明帶有支鏈的氨基酸（亮氨酸、異亮氨酸）、含硫氨基酸（蛋氨酸）以及含有醇羥基的氨基酸（絲氨酸、酪氨酸），輻照處理對(duì)其均產(chǎn)生影響?；诖私Y(jié)果，可能輻照后游離氨基酸減少與氨基酸結(jié)構(gòu)有關(guān)，輻照對(duì)含硫氨基酸分子中的硫原子、絲氨酸分子中的羥基有影響。研究證明，輻照可以使肉類食品中含硫氨基酸發(fā)生降解反應(yīng)，因此有含硫水溶性化合物產(chǎn)生，被視為“輻照異味”[20]。

Ahn等[21]對(duì)氨基酸進(jìn)行輻照處理，結(jié)果表明輻照使脂肪中的含硫氨基酸亮氨酸、異亮氨酸等進(jìn)行Strecker降解反應(yīng)，產(chǎn)生2-甲基-丁醛、3-甲基-丁醛以及2-甲基丙醛；其次，輻照處理使絲氨酸和蘇氨酸這兩種羥基氨基酸產(chǎn)生大量乙醛和丙醛。同時(shí)，表1的輻照樣品中氨基酸含量變化與蛋白質(zhì)水解也有關(guān)，不同劑量電子束輻照處理冷鮮豬里脊肉后，雖有小部分氨基酸含量增加，但輻照后大多數(shù)游離氨基酸含量產(chǎn)生不同程度的下降，這是由于輻照處理使電離水溶液產(chǎn)生自由基，進(jìn)而攻擊蛋白質(zhì)中的多肽鏈?zhǔn)怪當(dāng)嗔眩瑢?dǎo)致各類氨基酸含量發(fā)生改變，但由于不同氨基酸的結(jié)構(gòu)及其對(duì)電子束敏感程度不同，所以輻照對(duì)不同氨基酸的影響程度不同，氨基酸含量下降程度也不同[22-23]。同時(shí)4 kGy劑量樣品中游離氨基酸的含量與未輻照樣品相比也在減少，表明4 kGy輻照劑量不足以使豬里脊肉中的蛋白質(zhì)徹底水解形成氨基酸。

2.4 不同輻照劑量處理的豬里脊肉揮發(fā)性成分分析

不同輻照劑量處理的豬里脊肉揮發(fā)性成分分析見表2。

表2 不同劑量輻照處理的豬里脊肉揮發(fā)性成分分析Table 2 Volatile components of pork tenderloin irradiated at different doses

采用SPME方法提取豬肉樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，借助GC分離技術(shù)、MS和保留指數(shù)方法，結(jié)合內(nèi)標(biāo)半定量分析法對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行分析。如表2所示，SPME提取的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中未輻照樣品中只有5種化合物，而電子束輻照樣品中揮發(fā)性風(fēng)味化合物種類達(dá)到16種，相比未輻照樣品，經(jīng)輻照處理的豬里脊肉揮發(fā)性風(fēng)味化合物呈現(xiàn)不同程度的變化，特別是1、2、3 kGy樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)較多，這可能是輻照處理誘導(dǎo)脂肪氧化和蛋白質(zhì)降解。其中醛類、酮類、醇類物質(zhì)增加，可能是輻照誘發(fā)自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，脂肪酸經(jīng)輻照處理后碳原子間的單鍵容易斷裂產(chǎn)生烷烴化合物，經(jīng)過(guò)次級(jí)反應(yīng)后轉(zhuǎn)化為烯烴化合物，同時(shí)生成自由基和過(guò)氧化物、氫過(guò)氧化物分解而生成醛、酮等化合物[23-24]。其中有2個(gè)含氮、硫化合物，可能是輻照處理豬里脊肉后部分蛋白質(zhì)中氨基酸分解形成的含硫化合物。

3 結(jié)論

通過(guò)1、2、3、4 kGy不同劑量電子束輻照處理冷鮮豬里脊肉，采用不同方法對(duì)其風(fēng)味進(jìn)行研究，結(jié)果顯示電子束輻照對(duì)冷鮮豬里脊肉風(fēng)味產(chǎn)生影響。電子鼻結(jié)果顯示2 kGy樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分能夠更好地維持其原有的風(fēng)味；輻照處理使豬里脊肉在電子舌味感上的酸味、甜味、苦味和苦味回味有變化，說(shuō)明對(duì)其非揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)有影響；輻照處理后游離氨基酸總量下降，但輻照劑量增加不同味感的氨基酸含量變化不同，同時(shí)也受氨基酸結(jié)構(gòu)的影響，因此天冬氨酸含量隨輻照劑量的增加而下降，呈甜味的丙氨酸含量隨輻照劑量增加變化不明顯；GC-MS結(jié)果顯示輻照處理后豬里脊肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)增加，這是由脂肪氧化和蛋白質(zhì)降解所產(chǎn)生；而輻照異味的產(chǎn)生是由于蛋白質(zhì)中部分氨基酸的氧化分解以及自由基反應(yīng)。