曹永強(qiáng)，吳昌旭，王婷婷，張銘林，胡庭俊，于美玲

（ 廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530005 ）

青蒿素是一種分離自植物青蒿（黃花蒿葉）中的倍半萜烯內(nèi)酯[1]。自屠呦呦教授于20世紀(jì)70年代發(fā)現(xiàn)青蒿素后，關(guān)于青蒿素及其衍生物的研究層出不窮。有研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素及其衍生物具有抗寄生蟲[2-3]、抗腫瘤[4]、抗病毒[5]、抗菌[6]、抗炎[7]、抗纖維化[8]和保護(hù)腎臟[9]等作用。青蒿素的應(yīng)用研究主要集中于各種動(dòng)物寄生蟲疾病的防治，如應(yīng)用青蒿素治療豬附紅細(xì)胞體病、雞柔嫩艾美爾球蟲、牛焦蟲病、錐蟲病和血吸蟲病等[10-13]。但因青蒿素存在水溶性差、生物利用度低、半衰期短和穩(wěn)定性差等特點(diǎn)限制了其在獸醫(yī)臨床中的應(yīng)用[14]。納米脂質(zhì)體藥物遞送系統(tǒng)能夠提高青蒿素的水溶性，并將藥物靶向遞送到靶器官，從而解決青蒿素溶解度差的問題；還能夠提高藥物生物利用度，具有很好的緩釋作用和穿透作用[15]。本試驗(yàn)通過比較薄膜分散法、逆向蒸發(fā)法、乙醇注入法和改良乙醇注入法，優(yōu)選制得脂質(zhì)體粒徑較小、包封率較高、操作簡單的制備方法，并通過單因素試驗(yàn)和Box-Benhnken響應(yīng)面法優(yōu)化了其制備工藝，為應(yīng)用青蒿素防控動(dòng)物疾病提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 藥品及試劑耗材

青蒿素（批號：20210720，陜西寶雞市方晟生物開發(fā)有限公司）、青蒿素標(biāo)準(zhǔn)品（北京索萊寶科技有限公司）、大豆卵磷脂（上海生工生物工程股份有限公司，BC級，純度≥60%）、膽固醇（上海生工生物工程股份有限公司，Reagent級）、2%磷鎢酸負(fù)染色液（北京索萊寶科技有限公司）、透析袋MD34（規(guī)格：MD34，透析膜截留分子量：3500D，北京索萊寶科技有限公司）、200目碳膜銅網(wǎng)（深圳市瑞格銳思科技有限公司）。NaOH、無水乙醇、二甲基亞砜（DMSO）和NaCl試劑等均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器設(shè)備

HEI VAP ADVANTAGE旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（海道夫公司）、UV-1800紫外可見光分光光度計(jì)（島津儀器有限公司）、Zetasizer Nano-ZS納米粒度電位分析儀（Malvern instrument lid）、SCIENTZ-IID超聲波細(xì)胞粉碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）、HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州澳華儀器有限公司）、524G恒溫磁力攪拌器（上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司）、himac CF16RN多用途冷凍離心機(jī)（日立公司）、日立HT7700透射電子顯微鏡（日立公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 青蒿素納米脂質(zhì)體制備方法的優(yōu)選

1.2.1.1 薄膜分散法

精確稱取大豆卵磷脂250 mg、膽固醇50 mg、青蒿素12.5 mg，加入無水乙醇超聲溶解。45 ℃旋轉(zhuǎn)減壓蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，形成一層均勻的薄膜后，加入10 mL生理鹽水，邊振搖邊水浴超聲使脂質(zhì)膜溶于水相呈混懸液?；鞈乙航?jīng)0.45 μm有機(jī)濾膜過濾，得青蒿素納米脂質(zhì)體。

1.2.1.2 逆向蒸發(fā)法

精確稱取大豆卵磷脂250 mg、膽固醇50 mg、青蒿素12.5 mg，加入無水乙醇超聲溶解。將10 mL生理鹽水加入有機(jī)相中，振搖使之呈淡黃色乳狀液。45 ℃旋轉(zhuǎn)減壓蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑?；鞈乙航?jīng)0.45 μm有機(jī)濾膜過濾，得青蒿素納米脂質(zhì)體。

1.2.1.3 乙醇注入法

精確稱取大豆卵磷脂250 mg、膽固醇50 mg、青蒿素12.5 mg，加入無水乙醇超聲溶解。將有機(jī)相用注射器緩緩地滴加入45 ℃水浴的10 mL生理鹽水中，邊滴加邊攪拌，然后置于磁力攪拌器上常溫?cái)嚢?~4 h。混懸液經(jīng)0.45 μm有機(jī)濾膜過濾，得青蒿素納米脂質(zhì)體。

1.2.1.4 改良乙醇注入法

精確稱取大豆卵磷脂250 mg、膽固醇50 mg、青蒿素12.5 mg，加入無水乙醇超聲溶解。將有機(jī)相用注射器緩緩地滴加入45 ℃水浴的10 mL生理鹽水中，邊滴加邊攪拌，然后置于恒溫磁力攪拌器攪拌30 min，40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)30 min后，常溫磁力攪拌1~2 h?；鞈乙河眉?xì)胞破碎儀探頭超聲10 min，期間每超聲10 s，暫停10 s?；鞈乙航?jīng)0.45 μm有機(jī)濾膜過濾，得青蒿素納米脂質(zhì)體。

1.2.1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取青蒿素標(biāo)準(zhǔn)品2 mg，溶解于1 mL DMSO中，配制2 000 mg/L溶液。精密量取溶液于10 mL容量瓶中，用2% NaOH溶液-DMSO（1∶1，V/V）定容至刻度，配成10、20、30、40、50、100和125 mg/L的青蒿素標(biāo)準(zhǔn)溶液，室溫反應(yīng)1 h。在291 nm處進(jìn)行吸光度值測定，以青蒿素標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.1.6 包封率、粒徑、多分散性指數(shù)（PDI）和Zeta電位的測定

包封率測定參考Isacchi等[16]的方法。將2 mL脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移到透析袋中，在800 mL生理鹽水中透析2 h，中間將水介質(zhì)更換一次，利用透析法去除游離青蒿素。收集透析袋中液體，加入適量2% NaOH-DMSO混合液超聲破乳10 min，室溫反應(yīng)35 min，8 000 r/min離心15 min，取上清液，在291 nm處測定吸光度值。另取未經(jīng)透析的脂質(zhì)體溶液2 mL，同法操作。通過青蒿素標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算包封率。

式中：w1為透析后的納米脂質(zhì)體中青蒿素的質(zhì)量；w2為納米脂質(zhì)體中青蒿素的總量。

粒徑、PDI和Zeta電位測定：將納米脂質(zhì)體稀釋10倍，用馬爾文納米粒度電位分析儀測定脂質(zhì)體粒徑分布、PDI和Zeta電位。

1.2.2 青蒿素納米脂質(zhì)體制備單因素試驗(yàn)

根據(jù)制備方法篩選結(jié)果選擇本試驗(yàn)條件下的最佳制備方法進(jìn)行工藝優(yōu)化。通過單因素試驗(yàn)分別考察藥脂比（1∶10、1∶12、1∶14、1∶16、1∶18、1∶20、1∶22和1∶26）、磷膽比（3∶1、4∶1、5∶1、6∶1和7∶1）、生理鹽水體積（5、10、15、20、25和30 mL）、超聲時(shí)間（5、10、15和20 min）對青蒿素納米脂質(zhì)體包封率的影響。

1.2.3 Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)

單因素考察結(jié)果表明，藥脂比、磷膽比和生理鹽水體積對青蒿素納米脂質(zhì)體的包封率的影響較為顯著，故選取這3個(gè)因素作為考察對象。每個(gè)因素選取3個(gè)水平，各因素及水平見表1。以包封率（Y）作為響應(yīng)值，建立數(shù)學(xué)模型，優(yōu)化青蒿素納米脂質(zhì)體制備工藝。利用Design Expert 13.0 軟件建立Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平Tab.1 Factors and levels of Box-Behnken experimental design

1.2.4 青蒿素納米脂質(zhì)體制備工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

在響應(yīng)面優(yōu)化的最佳條件下重復(fù)青蒿素納米脂質(zhì)體的制備和包封率的測定。每個(gè)樣品進(jìn)行3個(gè)重復(fù)，測定脂質(zhì)體的包封率、粒徑、PDI和Zeta電位。

1.2.5 青蒿素納米脂質(zhì)體形態(tài)學(xué)研究

將青蒿素納米脂質(zhì)體用超純水進(jìn)行10倍稀釋，取適量稀釋液滴加至200目的碳膜銅網(wǎng)上，靜置3~5 min，用濾紙條從液滴邊緣吸去多余液體，自然干燥。滴加2%的磷鎢酸負(fù)染色液，靜置2 min，吸去多余液體，靜置干燥。使用透射電鏡觀察脂質(zhì)體的形態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 青蒿素標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖1）

由圖1可知，線性回歸方程：y=0.013 2x-0.019 2，y為吸光度，x為青蒿素對照品濃度，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8。

圖1 青蒿素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Artemisinin standard curve

2.2 不同方法制備脂質(zhì)體的包封率、平均粒徑和PDI（見表2）

由表2可知，薄膜分散法的包封率和逆向蒸發(fā)法的包封率均較低，分別為41.31%和41.04%。乙醇注入法包封率為48.65%，平均粒徑為（214.20±2.48）nm。改良乙醇注入法的包封率為58.79%，為4種方法中最高，其平均粒徑和PDI最低，為本試驗(yàn)條件下最佳方法，故選擇改良乙醇注入法進(jìn)行工藝優(yōu)化。

表2 不同方法制備脂質(zhì)體的包封率、平均粒徑和PDITab.2 Encapsulation efficiency, mean particle size and PDI of different preparation methods

2.3 各因素對青蒿素納米脂質(zhì)體包封率的影響（見圖2）

圖2 各因素對青蒿素納米脂質(zhì)體包封率的影響Fig.2 Effects of various factors on encapsulation efficiency of artemisinin nanoliposomes

由圖2（a）可知，藥脂比對脂質(zhì)體的包封率影響較大。藥脂比為1∶10~1∶14時(shí)，包封率隨藥脂比增加而增高；藥脂比為1∶14時(shí)包封率最高，為59.99%；藥脂比為1∶14~1∶26時(shí)，包封率隨藥脂比增加而逐漸減小。

由圖2（b）可知，磷膽比對脂質(zhì)體的包封率影響較大。磷膽比在3∶1~5∶1范圍內(nèi)時(shí)，包封率隨著磷膽比增加而增高，磷膽比在5∶1時(shí)，包封率最高，為56.90%。磷膽比在5∶1~7∶1范圍內(nèi)時(shí)，包封率隨著磷膽比增加而逐漸減小。

由圖2（c）可知，生理鹽水體積對脂質(zhì)體的包封率影響較大。生理鹽水體積在5~10 mL范圍內(nèi)，包封率隨著生理鹽水體積增大而增高，生理鹽水體積為10 mL時(shí)包封率最高，達(dá)58.67%。生理鹽水體積在10~30 mL范圍內(nèi)，包封率隨著生理鹽水體積增加而逐漸減小。

由圖2（d）可知，超聲時(shí)間對脂質(zhì)體的包封率影響較小。青蒿素納米脂質(zhì)體包封率呈微小的上下波動(dòng)趨勢。

2.4 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化制備工藝

2.4.1 回歸模型的建立

利用Design Expert 13.0軟件建立Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)。對試驗(yàn)測得數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸分析，得到A、B、C與Y的二次多項(xiàng)回歸方程：Y=61.03+1.20A+4.80B-1.35C-0.54AB+0.43AC-0.715BC-5.90A2-11.20B2-14.30C2，R2=0.994 5，模型的變異系數(shù)為2.65%，表明本試驗(yàn)建立的模型精密度良好。失擬項(xiàng)F值為0.534 2，失擬項(xiàng)不顯著，表明該回歸方程擬合情況良好，見表3。

表3 青蒿素納米脂質(zhì)體響應(yīng)面回歸模型的方差分析Tab.3 Analysis of variance for regression model of artemisinin nanoliposomes

2.4.2 響應(yīng)曲面分析與優(yōu)化條件的確定

Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表4。3種影響因素對于響應(yīng)值的3D曲面圖的影響結(jié)果見圖3~圖5。

表4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Tab.4 Box-Behnken experimental design scheme and results

由圖3~圖5可知，包封率隨著藥脂比、磷膽比及生理鹽水體積增大，均呈先增大后減小的趨勢。得到最優(yōu)制備工藝條件為藥脂比為1∶14.53，磷膽比為5.42∶1，生理鹽水體積為9.74 mL（此時(shí)磷脂質(zhì)量為250 mg）。

圖3 藥脂比和磷膽比對包封率的影響Fig.3 Effect of drug lipid ratio and phosphorus bile ratio on encapsulation efficiency

圖5 磷膽比和生理鹽水體積對包封率的影響Fig.5 Effect of phosphorus/bile ratio and normal saline volume on encapsulation efficiency

圖4 藥脂比和生理鹽水體積對包封率的影響Fig.4 Effect of drug lipid ratio and normal saline volume on encapsulation efficiency

2.5 青蒿素納米脂質(zhì)體制備工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（見表5）

由表5可知，最佳制備工藝條件下，3次重復(fù)制備的青蒿素納米脂質(zhì)體包封率平均值為68.57%，平均粒徑為195.13 nm，PDI為0.19，Zeta電位為-12.10 mV。

表5 青蒿素納米脂質(zhì)體制備工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Validation test results of artemisinin nanoliposomes preparation process

2.6 青蒿素納米脂質(zhì)體形態(tài)學(xué)研究

透射電鏡觀察脂質(zhì)體的形態(tài)，結(jié)果見圖6。

由圖6可知，制備的青蒿素納米脂質(zhì)體形態(tài)呈雙層球形，且脂質(zhì)體大小與馬爾文粒徑電位分析測定儀測定的結(jié)果一致。

圖6 青蒿素納米脂質(zhì)體透射電鏡觀察結(jié)果Fig.6 Transmission electron microscopic observation of artemisinin nanoliposomes

3 討論

青蒿素的問世拯救了全球無數(shù)受瘧疾折磨的生命[17]，青蒿素的抗寄生蟲和抗腫瘤作用是目前研究的兩大熱點(diǎn)[18-21]。但由于青蒿素具有溶解性和穩(wěn)定性，限制了其發(fā)展。納米脂質(zhì)體技術(shù)可延長藥物的半衰期，遞送藥物透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞[22-23]，為青蒿素的進(jìn)一步發(fā)展提供了更多可能性。

青蒿素納米脂質(zhì)體制備工藝中使用最多的是薄膜分散法，關(guān)于不同制備方法對包封率的影響研究較少，大多數(shù)研究忽略了不同制備方法對包封率和粒徑的影響[16,24-25]。許賢會(huì)[26]制備阿維菌素脂質(zhì)體時(shí)聯(lián)合薄膜分散法與凍融法，發(fā)現(xiàn)改良薄膜分散法的包封率為90.36%，薄膜分散法為86.51%。王虹雅[27]采用薄膜分散法、注入法、逆向蒸發(fā)法以及改良后的逆向蒸發(fā)-薄膜分散法制備頭孢噻呋鈉納米脂質(zhì)體，發(fā)現(xiàn)注入法的包封率最高（74.2%），但粒徑比改良后的逆向蒸發(fā)-薄膜分散法大。

本試驗(yàn)通過比較常用的脂質(zhì)體制備方法，并將傳統(tǒng)乙醇注入法進(jìn)行改良。在傳統(tǒng)乙醇注入法的基礎(chǔ)上，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀和細(xì)胞破碎儀，結(jié)合超聲法和乙醇注入法。試驗(yàn)結(jié)果表明，改良乙醇注入法制備的脂質(zhì)體包封率較高、粒徑較小。通過使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將大部分有機(jī)溶劑快速蒸發(fā)，降低環(huán)境溫度對注入法的影響，縮短制備時(shí)間，從而解決了傳統(tǒng)乙醇注入法因長時(shí)間攪拌導(dǎo)致青蒿素析出的問題，提高包封率。

使用細(xì)胞破碎儀進(jìn)行超聲可進(jìn)一步提高包封率，減小粒徑和PDI。白先群等[28]利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法制備青蒿琥脂納米脂質(zhì)體，其包封率為44.14%，經(jīng)超聲粉碎的脂質(zhì)體包封率達(dá)到74.10%，表明超聲法的融入能夠有效提高脂質(zhì)體包封率，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。本研究進(jìn)一步通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化乙醇注入法制備青蒿素納米脂質(zhì)體工藝，優(yōu)化工藝后制備的青蒿素納米脂質(zhì)體包封率達(dá)69.62%、粒徑為167.50 nm。陸慧等[29]使用薄膜分散法制備青蒿素脂質(zhì)體包封率大于43%，粒徑為194 nm，本研究中改良乙醇注入法明顯優(yōu)于該試驗(yàn)使用的薄膜分散法。余熒藍(lán)等[24]采用薄膜分散法制備青蒿素長循環(huán)脂質(zhì)體粒徑為113.3 nm，包封率為95.88%，分析其原因是該研究使用的磷脂純度高達(dá)98%，磷脂純度對脂質(zhì)體的包封率影響較大，長循環(huán)修飾和高純度磷脂提高了脂質(zhì)體包封率，減小了脂質(zhì)體平均粒徑。彭盛峰[30]研究發(fā)現(xiàn)，磷脂中磷脂酰膽堿純度與姜黃素在脂質(zhì)體中包封率和熱穩(wěn)定性成正比，表明磷脂純度是影響脂質(zhì)體包封率的重要因素。本試驗(yàn)采用磷脂純度為60%，后續(xù)研究將進(jìn)一步提高大豆卵磷脂純度以提高青蒿素脂質(zhì)體包封率。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過比較不同的脂質(zhì)體制備方法，發(fā)現(xiàn)改良乙醇注入法明顯優(yōu)于薄膜分散法、逆向蒸發(fā)法和傳統(tǒng)乙醇注入法。通過單因素試驗(yàn)和Box-Benhnken響應(yīng)面優(yōu)化得出青蒿素納米脂質(zhì)體制備的最佳工藝條件為青蒿素與磷脂的質(zhì)量比1∶14.53，磷脂與膽固醇的質(zhì)量比5.42∶1，生理鹽水體積9.74 mL（此時(shí)磷脂質(zhì)量為250 mg）。此條件下制備的青蒿素納米脂質(zhì)體形態(tài)呈雙層球形，包封率68.57%，平均粒徑為195.13 nm，PDI為0.19，Zeta電位為-12.10 mV。

本研究優(yōu)化了青蒿素納米脂質(zhì)體制備工藝，可為青蒿素納米脂質(zhì)體在動(dòng)物寄生蟲疾病防控和寵物腫瘤治療方面的研究提供參考。