羅飛，師旭，王頡，龐永宏，趙彥敏

（1. 中糧華夏長城葡萄酒有限公司，河北秦皇島 066000；2. 中糧長城桑干酒莊（懷來）有限公司，河北張家口 075400；3. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定 071000；4. 張家口市食品藥品檢驗中心，河北張家口 075000；5. 河北省張家口市農(nóng)業(yè)廣播電視學(xué)校，河北張家口 075000）

‘龍眼’葡萄是中國最具特色和代表性的鮮食釀酒兼用品種，有近千年的栽培歷史，目前主要在懷來地區(qū)有集中種植，且面積逐年縮減。據(jù)懷來縣統(tǒng)計局數(shù)據(jù)，2021年‘龍眼’葡萄種植面積約有20 hm2，有兩家企業(yè)釀造‘龍眼’干白葡萄酒，其他均以鮮食消費。因此‘龍眼’葡萄面臨被淘汰的風(fēng)險。

眾所周知，葡萄酒復(fù)雜的風(fēng)味很大部分是一系列微生物代謝活動的結(jié)果[1]，微生物對葡萄酒香氣的貢獻，及其在葡萄酒品質(zhì)中的改良始終在研究之中[2-3]，大量芳香化合物在釀酒酵母初級發(fā)酵過程中形成[4]。此外，現(xiàn)有研究表明，接種本土非釀酒酵母可以改善葡萄酒的芳香特征[5]，如有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）和高滲漢森酵母（Hanseniaspora osmophila）可以分泌多種水解酶，有助于葡萄酒花香物質(zhì)的產(chǎn)生[6]；而葡萄酒微生態(tài)系統(tǒng)除以釀酒酵母、非釀酒酵母為代表的真菌群落外，細菌群落也對葡萄酒風(fēng)味存在重要影響，其中乳酸菌（LAB）具有廣泛的酯合成和水解活性。許多研究中觀察到蘋乳酸發(fā)酵（MLF）后，乙酸乙酯、乙酸異戊酯和乳酸乙酯水平增加[7-8]，其中最常用的酒酒球菌（Oenococcus oeni）的多糖被證明具有與釋放的香氣化合物結(jié)合的能力，從而影響最終的葡萄酒香氣[9]。近年來國內(nèi)外通過高通量測序（HTS）技術(shù)報道了不同產(chǎn)區(qū)、不同葡萄品種發(fā)酵過程中微生物多樣性組成和其此消彼長的變化及其與揮發(fā)香香氣的相關(guān)性[10]，如‘威代爾’冰白葡萄酒[11]、‘法蘭娜’（Falanghina）甜葡萄酒[12]和‘馬瑟蘭’[13]紅葡萄酒已有報道，然而我國獨有的‘龍眼’干白葡萄酒工業(yè)發(fā)酵過程尚缺乏相關(guān)研究。

本研究對‘龍眼’干白葡萄酒發(fā)酵過程中微生物群落變化及其與揮發(fā)性香氣變化相關(guān)性分析，將為我國本土品種‘龍眼’干白發(fā)酵過程中微生物多樣性研究提供一定理論支持，從而了解葡萄酒風(fēng)味特征的形成和質(zhì)量控制，為釀酒師監(jiān)控發(fā)酵過程提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 葡萄原料

‘龍眼’葡萄產(chǎn)自懷來，行距2 m，株距0.8 m。

1.1.2 酵母選擇

釀酒酵母（S. cerevisiae）VL2，由Lamothe Abiet公司生產(chǎn)，經(jīng)釀酒師長期驗證，具有低溫耐受性強、啟動發(fā)酵快的特點，適合‘龍眼’干白葡萄酒的釀造。

1.1.3 主要試劑

果膠酶（食品級），Laffort公司；氯化鈉（分析純）、偏亞硫酸鉀（食品級），國藥集團有限公司；甲醇（色譜純），北京迪科馬科技有限公司；3-辛醇（分析純），美國Sigma公司；FastDNA? Spin Kit for Soil DNA抽提試劑盒，美國MP Biomedicals公司；MiSeq Reagent Kit v3測序試劑盒，美國Illumina公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890B-5977A氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，Agilent公司；57328-u頂空固相微萃取纖維頭，Supelco公司；HPINNOWAX毛細管色譜柱（60 m×250 μm×0.25 μm），Agilent公司；Autosampler 2707高效液相色譜儀，Waters公司；Wine Scan FT 120 FOSS儀，F(xiàn)OSS公司；2720 thermal cycler PCR儀，美國Applied Biosystems公司；Illumina Miseq測序儀，美國Illumina公司。

1.3 試驗設(shè)計方法

試驗用10 t不銹鋼控溫發(fā)酵罐發(fā)酵，每罐9 t葡萄汁，設(shè)置3個平行處理。

發(fā)酵工藝流程：葡萄原料→穗選→破碎除梗→葡萄汁壓榨（果膠酶 15 g·t-1）→焦亞硫酸鉀處理（60 mg·L-1）→冷浸漬48 h→澄清汁→接種釀酒酵母（200 g·t-1）→控制發(fā)酵溫度12～13 ℃進行酒精發(fā)酵→發(fā)酵結(jié)束→分離、調(diào)硫→下膠→熱穩(wěn)定試驗→冷穩(wěn)定處理→過濾→干白葡萄酒。

葡萄汁壓榨、前處理和澄清：葡萄采收后，用氮氣保護氣囊壓榨機（2 t·h-1）壓榨獲得葡萄汁（總糖：178.93 g·L-1，總酸：9.2 g·L-1），壓榨過程中添加焦亞硫酸鉀（60 mg·L-1）和果膠酶（15 g·t-1）。壓榨出的葡萄汁在7～8 ℃下放置48 h后分離出澄清汁（C），取500 mL用于后續(xù)分析。

酵母活化及擴培：取5400 g活性干酵母，在38 ℃水浴條件下，加入10倍水（54 L，38 ℃）進行活化?；罨蟮幕钚愿山湍咐闷咸殉吻逯?0 ℃）進行擴培，從38 ℃開始按照每次6 ℃的梯度依次降溫，每次降溫后保持3～5 min，將溫度降至11～13 ℃后，等量接種于11～13 ℃葡萄汁中，48 h后，溫度控制在12～13 ℃發(fā)酵，每天保持早中晚測量溫度。

各處理每隔1 d取樣，至酒精發(fā)酵結(jié)束。取樣共8次，分別為第2天、第4天……第16天，記為L2、L4、L6、L8、L10、L12、L14、L16。在3個發(fā)酵罐上中下部取樣共500 mL，樣品經(jīng)4 ℃離心（9900 r·min-1離心15 min），上清液用于理化指標和揮發(fā)性香氣分析。樣品收集后，保存于﹣80 ℃。至發(fā)酵液殘?zhí)切∮? g·L-1時，結(jié)束取樣。

1.4 微生物群落測定方法

參考先前方法將發(fā)酵過程中樣品進行總DNA提取和檢測，對細菌16S rRNA基因的V3～V4區(qū)和真菌ITS rRNA基因的ITS區(qū)目的基因進行PCR擴增，3個平行樣本PCR產(chǎn)物混合，用2%瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物進行檢測；按AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒說明對回收產(chǎn)物提取純化，用微型熒光計進行檢測定量。采用邊合成邊測序的方法在Illumina公司Miseq PE300平臺上機進行高通量測序。

1.5 理化指標測定方法

總糖、總酸和酒精度：利用FOSS儀在Wine Scan FT 120從波數(shù)926～5012 cm-1進行透射掃描測定；pH采用pH計法測定；甲醇參照GB/T 15038—2016[14]利用高效氣相色譜儀測定。

1.6 揮發(fā)性香氣測定方法

GC條件：Agilent HP-INNOWax毛細管極性色譜柱（60 m×250 μm×0.25 μm），進樣口溫度設(shè)定為240 ℃，載氣為高純He（＞99.999%），流速為 1 mL·min-1，不分流模式；柱箱升溫程序如表1所示。

表1 GC柱箱升溫程序Table 1 GC column box warming procedure

MS條件： EI＋離子源，電子能量為70 eV，離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，溶劑延遲5 min，質(zhì)譜質(zhì)量掃描范圍45～350 u。

測定結(jié)果利用NIST14譜庫定性，篩選匹配度＞90%的香氣組分，頂空固相微萃取，利用3-辛醇進行內(nèi)標法半定量，每個樣品重復(fù)3次。

1.7 結(jié)果統(tǒng)計分析

試驗結(jié)果用X±SD形式表示，使用SPSS 26軟件（SPSS，Inc.，USA）進行統(tǒng)計分析；繪圖采用Origin 2020（OriginLab Corporation，USA）軟件；發(fā)酵過程中微生物變化使用SIMCA 14.1（Umetrics AB，Sweden）進行正交偏最小二乘分析（OPLS）；通過R語言包進行Spearman相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 干白葡萄酒理化指標

‘龍眼’干白葡萄酒發(fā)酵結(jié)束及葡萄澄清汁基本理化指標如表2所示。發(fā)酵天數(shù)共計16 d，酒精發(fā)酵結(jié)束時葡萄酒中甲醇含量為41.17±1.45 mg·L-1，符合GB/T 15037—2006[15]規(guī)定的不超過250 mg·L-1的要求。

表2 ‘龍眼’干白葡萄酒理化指標Table 2 Physical and chemical indexes of 'Longyan' dry white wine

2.2 干白葡萄酒發(fā)酵過程中微生物群落變化分析

對8個樣本的16S rRNA基因V3～V4區(qū)進行測序，獲得518 942個高質(zhì)量讀數(shù)，每個樣本平均8212個序列。去除低豐度和非細菌操作分類單位（OTU）后，通過OTU聚類（相似性97%）得到766個OTU。對于真菌，使用HTS生成720 231的高質(zhì)量讀數(shù)，每個樣本平均47 742個序列，獲得350個OTU（相似性97%）。

由圖1可見發(fā)酵過程中的總體樣本相對豐度大于1%的優(yōu)勢微生物有細菌屬20種、真菌屬6種，相對豐度小于1%的歸為其他屬。

圖1 ‘龍眼’干白葡萄酒發(fā)酵過程中主要細菌（左）和真菌（右）相對豐度變化的影響Figure 1 Relative abundance changes of major bacteria (Left) and fungi (Right) during 'Longyan' dry white wine

對于細菌，葡萄汁中相對豐度較高的為駒形氏桿菌屬Komagataeibacter（53.79%），其次是葡糖桿菌屬Gluconobacter（14.40%），二者在發(fā)酵中逐漸減少，發(fā)酵結(jié)束時的豐度分別為1.31%和0.60%。發(fā)酵過程中增加最快的是地芽孢桿菌屬Geobacillus，到第8天時豐度達到66.76%，之后逐漸減少，在第16天時又增加到54.06%；其次是泛菌屬Pantoea在第4天（59.95%）時顯著增加，之后又逐漸減少，第16天時降至2.28%；不動桿菌屬Acinetobacter在第2天的豐度猛增至47.03%，隨后又迅速降低。

對于真菌，葡萄汁中有孢圓酵母屬Torulaspora豐度最高，為82.86%；其次是未分類門的子囊菌g_unclassified_p_Ascomycota（2.64%），枝孢屬g_Cladosporium（1.92%）。而發(fā)酵過程中以接種的釀酒酵母占優(yōu)勢。

2.3 干白葡萄酒發(fā)酵過程中揮發(fā)性香氣變化分析

‘龍眼’干白葡萄酒揮發(fā)性化合物含量如表3所示。共鑒定出28種揮發(fā)性香氣化合物，分為醇類、乙酸酯、脂肪酸乙酯、其他酯類、酸類、醛類、酮類、萜烯類和C13-降異戊二烯?！堁邸咸殉吻逯泄茶b定出4種揮發(fā)性香氣，有C6醇類的正己醇、(E)-2-己烯-1-醇，醛類為己醛，酮類為3-辛酮。發(fā)酵結(jié)束時，‘龍眼’干白葡萄酒共鑒定出25種揮發(fā)性香氣，相對含量較高的為脂肪酸乙酯中的辛酸乙酯、己酸乙酯、癸酸乙酯及乙酸酯中的乙酸異戊酯、乙酸己酯，均高于最低閾值，是葡萄酒果香的主要來源。其中，除辛酸乙酯在發(fā)酵中逐漸增加，到第14天最高（14 498.14±1279.99 μg·L-1），發(fā)酵結(jié)束降低到10 247.03±957.75 μg·L-1，其余均為發(fā)酵過程中逐漸增加；其他酯類中辛酸異戊酯帶有菠蘿、椰子和奶油香，己酸異戊酯與癸酸異戊酯均帶有果香和甜味，在發(fā)酵過程中逐漸增加；醇類中相對含量最高的為異戊醇，其次為苯乙醇，發(fā)酵過程中乙酰轉(zhuǎn)移酶催化高級醇酯化產(chǎn)生乙酸酯；脂肪酸含量最高的是辛酸，其次是癸酸和己酸，來源于脂質(zhì)代謝和長鏈脂肪酸分解[16]，均逐漸增加到第10天最高后減少。萜烯類是β-石竹烯和4-萜烯醇分別在發(fā)酵第10天較高，第4天開始檢測到，并逐漸增加。C13-降異戊二烯中的β-大馬士酮在發(fā)酵第2天被檢測到，以后逐漸增加。

表3 ‘龍眼’干白葡萄酒揮發(fā)性化合物相對含量Table 3 Volatile compounds relative content in 'Longyan' dry white wine

2.4 干白葡萄酒發(fā)酵過程中微生物群落與揮發(fā)性香氣化合物變化相關(guān)性

如圖2所示，以鑒定出的28種揮發(fā)性化合物為橫坐標，以相對含量＞1細菌和真菌為縱坐標進行正交偏最小二乘分析（OPLS），得到VIP＞1（R2＞0.5，Q2＞0.5）的核心微生物細菌屬11種，真菌屬2種。如圖3所示，通過AI進行可視化得到OPLS分析VIP＞1的核心微生物與28種揮發(fā)香氣的Spearman相關(guān)性（|R|＞0.7；P＜0.05）。

圖2 ‘龍眼’干白葡萄酒發(fā)酵過程中微生物群與揮發(fā)性化合物的相關(guān)性VIP分析Figure 2 VIP correlation analyses between microflora and volatile compounds of 'Longyan' dry white wine fermentation

如圖3所示細菌中有5個屬：駒形桿菌屬、葡萄糖桿菌屬、醋酸桿菌屬、甲基桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬與葡萄汁中品種香正己醇、(E)-2-己烯-1-醇和己醛呈顯著正相關(guān)，與發(fā)酵過程中產(chǎn)生的香氣呈負相關(guān)；而地芽孢桿菌屬與乙酸癸酯、乙酸苯乙酯、4-萜烯醇和β-大馬士革酮；乙酸己酯、己酸乙酯、4-萜烯醇呈極顯著正相關(guān)；乳酸桿菌屬（Lactobacillus）與4-萜烯醇和β-大馬士革酮；己酸、乙酸癸酯、乙酸苯乙酯、己酸乙酯和癸酸異戊酯呈極顯著正相關(guān)；嗜熱厭氧桿菌屬與己酸、4-萜烯醇和β-大馬士革酮；乙酸癸酯、乙酸苯乙酯、己酸乙酯和癸酸異戊酯呈極顯著正相關(guān)；乳球菌屬與乙酸癸酯呈極顯著正相關(guān)。

圖3 ‘龍眼’干白葡萄酒發(fā)酵過程中核心微生物（VIP＞1）和揮發(fā)性化合物相關(guān)性熱圖Figure 3 Correlation heatmap between core microbiota (VIP＞1) and volatile compounds during 'Longyan' dry white wine fermentation

真菌中釀酒酵母與發(fā)酵香呈正相關(guān)，而非釀酒酵母有孢圓酵母屬與葡萄汁中品種香(E)-2-己烯-1-醇和己醛呈顯著正相關(guān)。

3 討論和結(jié)論

本研究用高通量16s rRNA及ITS測序技術(shù)和HSSPME-GC/MS，對‘龍眼’干白葡萄酒發(fā)酵過程中微生物群落和揮發(fā)性成分變化進行監(jiān)測。

共鑒定出28種揮發(fā)性香氣，包括醇類3種、乙酸酯7種、脂肪酸乙酯6種、其他酯類3種、酸類4種、醛類1種、酮類1種、萜烯類2種和C13-降異戊二烯1種，相對含量最高的為脂肪酸乙酯中的辛酸乙酯、己酸乙酯、癸酸乙酯及乙酸酯中的乙酸異戊酯、乙酸己酯。值得注意的是，萜類化合物β-石竹烯（倍半萜）是薄荷中的主要香氣[23]，具有青草和木質(zhì)的味道，在葡萄酒中未見報道；4-萜烯醇（單萜）化合物常存在于葡萄表皮和葡萄藤中，一些釀造工藝壓榨、浸漬，以及酶、細菌、酵母的參與會影響其在葡萄酒中的含量[24]。β-大馬士酮（C13-降異戊二烯，倍半萜酮）是胡蘿卜素的降解產(chǎn)物，對葡萄酒有重要影響[25]，在葡萄酒中的閾值極低，通常為0.05 μg·L-1，可以直接賦予葡萄酒花香、蜂蜜和水果的香味[26]，或協(xié)同改變其他水果的香味[27]。本研究初步明確了‘龍眼’干白葡萄酒發(fā)酵過程中的揮發(fā)性香氣，未來可以通過感官組學(xué)中GC-O、香氣提取稀釋、香氣遺漏和重組等技術(shù)進一步明確具有代表性的‘龍眼’干白的典型香氣。

本試驗檢測到的相對含量＞1%的細菌屬有20種，真菌屬有6種。通過OPLS分析初步確定了11種細菌和5種真菌為VIP＞1的核心微生物。通過Spearman相關(guān)性分析得出，其中的5種細菌和1種真菌與葡萄汁中品種香正己醇、(E)-2-己烯-1-醇和己醛呈顯著正相關(guān)，4種細菌和1種真菌即釀酒酵母屬（Saccharomyces）與發(fā)酵過程中的部分發(fā)酵香呈極顯著正相關(guān)，特別是地芽孢桿菌屬（Geobacillus）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和嗜熱厭氧桿菌屬（Thermoanaerobacterium）均與乙酸癸酯、乙酸苯乙酯、4-萜烯醇、β-大馬士革酮、乙酸苯乙酯和癸酸異戊酯等呈極顯著正相關(guān)。已有研究表明，地芽孢桿菌屬（Geobacillus）的許多脂肪酶能在極端溫度和pH值下存在，并具有酯合成潛力[28]。與蘋果酸-乳酸發(fā)酵相關(guān)的乳酸桿菌屬（Lactobacillus）具有糖苷酶和酯酶活性，從而進一步改善葡萄酒的風(fēng)味[29]，因此地芽孢桿菌屬（Geobacillus）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和嗜熱厭氧桿菌屬（Thermoanaerobacterium）可能是與發(fā)酵過程中揮發(fā)性香氣產(chǎn)生相關(guān)的核心功能微生物，共同促進了‘龍眼’干白葡萄酒發(fā)酵過程中復(fù)雜揮發(fā)性香氣的形成。在以往的研究中已有高通量技術(shù)監(jiān)測發(fā)酵過程中微生物變化及與揮發(fā)性香氣相關(guān)性研究[11-13]，從而初步確定對揮發(fā)性香氣有貢獻的核心功能微生物，但工業(yè)化生產(chǎn)中葡萄酒相關(guān)研究較少。綜上，本研究初步明確了‘龍眼’干白葡萄酒發(fā)酵過程中的核心微生物、核心功能微生物及其與揮發(fā)性香氣的相關(guān)性。關(guān)于微生物如何代謝仍需要進行轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)的深入研究，這些微生物的食品安全性仍待長期驗證。