耿海靜，王海生，張建宇，李薇，鄧秀玲

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010000

原發(fā)性肝癌是消化系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率居高不下。目前對(duì)于肝癌的治療仍以綜合治療為主，其中化療占主要地位。常用的化療藥物有阿霉素（ADR）、5-氟尿嘧啶（5-FU）、鉑類抗癌藥物等。然而隨著治療周期的延長(zhǎng)，化療藥物敏感性逐漸降低，出現(xiàn)多藥耐藥，嚴(yán)重制約了化療的療效，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，是化療失敗的主要原因。腫瘤耐藥性產(chǎn)生的機(jī)制十分復(fù)雜，涉及多因素、多環(huán)節(jié)、多通路，是目前研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。微小RNA（miRNA）是一類非編碼小分子RNA，通過(guò)與靶mRNA的3'端非翻譯區(qū)（3'-UTR）互補(bǔ)結(jié)合，促使靶mRNA的降解或抑制其翻譯，從轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，參與調(diào)控機(jī)體的多種生物學(xué)過(guò)程［1］。研究顯示，miRNA不僅參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展，而且在腫瘤多藥耐藥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中也發(fā)揮重要作用。2018年—2022年，我們通過(guò)miRNA 芯片技術(shù)，尋找人肝癌耐藥細(xì)胞株Bel-7402/5-FU、Bel-7402/ADR 與親本細(xì)胞株Bel-7402 之間差異表達(dá)的miRNA，探討miRNA 在肝癌多藥耐藥中的作用，預(yù)測(cè)其調(diào)控的靶基因，為miRNA參與肝癌耐藥性機(jī)制研究提供更多的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌耐藥細(xì)胞株Bel-7402/5-FU、Bel-7402/ADR 和親本細(xì)胞株Bel-7402 均購(gòu)自上海美軒生物技術(shù)公司。Gene Chip miRNA 4.0（Affymetrix 公司）；TRIzol 試劑（上海普飛公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑為Promega M-MLV 試劑盒；反轉(zhuǎn)錄引物、miRNA PCR 引物和SYBR Premix Ex Taq 熒光試劑（廣州市銳博生物科技有限公司）；胎牛血清（FBS）、0.25%胰酶、RPIM1640 培養(yǎng)基（Sigma 公司）；RIPA、BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒、小鼠抗人PGP 抗體及抗山羊二抗（索萊寶公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將Bel-7402細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI1640完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素和100 μg/mL 鏈霉素）中，Bel-7402/5-FU 細(xì)胞培養(yǎng)于含10 μg/mL 5-FU 的RPMI1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素）中，Bel-7402/ADR 細(xì)胞培養(yǎng)于含5 000 ng/mL ADR 的RPMI1640 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100 μg/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素）中。置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。

1.3 肝癌細(xì)胞miRNA 表達(dá)譜分析 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按照1×105/孔接種于6 孔板中，培養(yǎng)48 h，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到80%融合度時(shí)，加入TRIzol 試劑提取總RNA，使用NanoDrop2000 和安捷倫生物分析儀2100 分析RNA 純度，質(zhì)檢合格的RNA 進(jìn)行miRNA 芯片檢測(cè)。使用FlashTag? Biotin HSR RNA Labeling Kit 對(duì)樣本miRNA 進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記后的miRNA 與上膠緩沖液混合，PCR 儀孵育99 ℃ 5 min，45 ℃ 5 min。孵育完成后，取130 μL 注入芯片，雜交16～18 h后，用清洗液清洗芯片。將芯片放入Gene Chip Scanner 3000 掃描儀中進(jìn)行掃描，讀取芯片掃描圖像提取探針的信號(hào)值。圖像和數(shù)據(jù)以TIFF 的文件格式保存。Bel-7402、Bel-7402/5-FU、Bel-7402/ADR 細(xì)胞RNA 分別雜交1 張芯片，每個(gè)探針重復(fù)3 次。采用t 檢驗(yàn)計(jì)算樣品間miRNA 表達(dá)量變化的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，以P≤0.05 且|差異倍數(shù)（FC）|＞2 為顯著性差異表達(dá)的miRNA。對(duì)不同樣品組之間差異表達(dá)的miRNA 進(jìn)行圖形化展示，即火山圖分析，篩選標(biāo)準(zhǔn)為P≤0.05且|FC|＞2。

1.4 肝癌耐藥細(xì)胞差異表達(dá)miRNA 靶基因的預(yù)測(cè)和 功 能分 析 在Targetscan、microRNA. ORG 和miRDB 三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)FC 最大的miRNA 進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)。通過(guò)Fisher 精確檢驗(yàn)評(píng)價(jià)某個(gè)GO term 基因富集度的顯著性水平和各個(gè)通路基因富集度的顯著性水平。根據(jù)靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果，獲得3 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中共有的靶基因，通過(guò)Gene Ontology 進(jìn)行GO 注釋及富集分析，同時(shí)在KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行信號(hào)通路分析，確定受到顯著影響的代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

1.5 肝癌耐藥細(xì)胞差異表達(dá)miRNA 的驗(yàn)證 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）法。收集6孔板達(dá)80%融合度的Bel-7402、Bel-7402/5-FU和Bel-7402/ADR細(xì)胞，加入TRIzol試劑提取總RNA。按照M-MLV 試劑盒（Promega）進(jìn)行miRNA逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA。向逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中加入無(wú)RNA 酶的去離子水補(bǔ)足體積，取1 μL稀釋液進(jìn)行后續(xù)的PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系：SYBR premix ex taq 6.0 μL，引物mix（5 μmol/L）0.3 μL，模板（反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物）0.6 μL，RNase-Free H2O 5.1 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。所有樣本重復(fù)運(yùn)行3次，繪制解離曲線證實(shí)擴(kuò)增的特異性。以2-ΔΔCt法計(jì)算靶基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS25.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示。Bel-7402 與Bel-7402/5-FU、Bel-7402 與Bel-7402/ADR 之 間 差異的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝癌耐藥細(xì)胞差異表達(dá)miRNA 篩選結(jié)果 與Bel-7402細(xì)胞比較，Bel-7402/5-FU 細(xì)胞存在58個(gè)差異表達(dá)的miRNA，其中上調(diào)27 個(gè)、下調(diào)31 個(gè)，Bel-7402/ADR 細(xì)胞存在87 個(gè)差異表達(dá)的miRNA，其中上調(diào)17個(gè)、下調(diào)70個(gè)。見(jiàn)OSID碼圖1。在Bel-7402/5-FU和Bel-7402/ADR細(xì)胞中分別篩選出10個(gè)FC最大的miRNA，見(jiàn)表1、2。兩種耐藥細(xì)胞有9個(gè)差異表達(dá)miRNA重合，其中Bel-7042/5-FU細(xì)胞中miR-205-5p、miR-10a-5p、miR-675-3p、miR-373-5p、miR-371a-3p、miR-372-3p、miR-675-5p、miR-4532 表達(dá)下調(diào)，miR-31-5p、miR-4446-3p表達(dá)上調(diào)；Bel-7042/ADR細(xì)胞中miR-205-5p、miR-675-3p、miR-373-5p、miR-373-3p、miR-372-3p、miR-371a-3p、miR-675-5p、miR-10a-5p、miR-4532表達(dá)下調(diào)，miR-31-5p表達(dá)上調(diào)。

表1 人肝癌耐藥細(xì)胞Bel-7402/5-FU中的差異表達(dá)基因

2.2 肝癌耐藥細(xì)胞差異表達(dá)miRNA 的預(yù)測(cè)靶基因GO 分析結(jié)果 根據(jù)10 個(gè)FC 最大的miRNA 靶基因的 預(yù) 測(cè) 結(jié) 果，從Targetscan、microRNA. ORG 和miRDB 三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取共同靶基因，進(jìn)行GO 分析。GO 分析涉及生物過(guò)程（BP）、分子功能（MF）和細(xì)胞組分（CC）三個(gè)部分。其中BP主要涉及RNA 聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、生物合成過(guò)程正向調(diào)控和氮化合物代謝過(guò)程負(fù)向調(diào)控等過(guò)程；MF主要涉及酶結(jié)合、大分子復(fù)合物結(jié)合和核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性等功能；CC 主要涉及高爾基體、催化復(fù)合物和轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物等過(guò)程。見(jiàn)OSID碼圖2。

表2 人肝癌耐藥細(xì)胞Bel-7402/ADR中差異表達(dá)基因分析

2.3 肝癌耐藥細(xì)胞差異表達(dá)miRNA 的預(yù)測(cè)靶基因KEGG 分析結(jié)果 根據(jù)靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果，獲得三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中共有的靶基因，同時(shí)進(jìn)行KEGG 通路分析。靶基因富集通路包括軸突引導(dǎo)、泛素介導(dǎo)的蛋白水解、PAR1通路、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、TGF-β信號(hào)通路。見(jiàn)OSID碼圖3。

2.4 肝癌耐藥細(xì)胞差異表達(dá)miRNA 的驗(yàn)證結(jié)果 與Bel-7402 細(xì) 胞比 較，Bel-7402/5-FU 和Bel-7402/ADR 細(xì) 胞 中miR-31-5p、miR-4446-3p 表 達(dá) 上 調(diào)，miR-205-5p、miR-675-3p、miR-373-5p、miR-372-3p、miR-371a-3p、miR-675-5p、miR-10a-5p 和miR-4532表達(dá)下調(diào)（P均＜0.05），驗(yàn)證結(jié)果與芯片結(jié)果一致。見(jiàn)表3。

表3 人肝癌耐藥細(xì)胞Bel-7402/5-FU和Bel-7402/ADR中 差異表達(dá)miRNA的驗(yàn)證結(jié)果

3 討論

目前研究認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞高表達(dá)的耐藥基因MDR1/P 糖蛋白（P-gp）導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)藥物攝取降低、細(xì)胞外排功能增加，是腫瘤細(xì)胞多藥耐藥產(chǎn)生的主要機(jī)制。P-gp 是ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之一，利用ATP 水解產(chǎn)生的能量，將5-FU、ADR、紫杉醇、長(zhǎng)春新堿等多數(shù)化療藥物及一些分子靶向藥物轉(zhuǎn)運(yùn)出胞外，以降低其在細(xì)胞內(nèi)的濃度，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥性［2］。在肝癌、胰腺癌、腎癌等腫瘤耐藥細(xì)胞中，P-gp表達(dá)水平普遍升高［3］，提示P-gp表達(dá)量與腫瘤耐藥性發(fā)生有關(guān)。5-FU 和ADR 是臨床常用的肝癌化療藥物，也是P-gp 轉(zhuǎn)運(yùn)的底物，因此本研究以人肝癌耐藥細(xì)胞株Bel-7402/5-FU 和Bel-7402/ADR為研究對(duì)象。miRNA 是細(xì)胞內(nèi)的一類非編碼小RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控體內(nèi)多種生理和病理活動(dòng)過(guò)程。miRNA 不僅調(diào)控腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移，而且還調(diào)控腫瘤細(xì)胞的耐藥性，miRNA 異常可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的表型改變，從而導(dǎo)致耐藥發(fā)生，提示miRNA 有可能作為預(yù)測(cè)化療敏感性和逆轉(zhuǎn)耐藥的靶點(diǎn)用于腫瘤治療。本研究利用miRNA 芯片技術(shù)分析人肝癌Bel-7402 細(xì) 胞 與Bel-7402/5-FU 和Bel-7402/ADR 細(xì)胞的miRNA 表達(dá)譜，篩選耐藥細(xì)胞中的差異表達(dá)miRNA，并對(duì)FC＞10 的差異表達(dá)miRNA 進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示，在Bel-7402/5-FU 和Bel-7402/ADR 細(xì)胞中，有9 個(gè)miRNA 的表達(dá)發(fā)生明顯變化，其中miR-31-5p 表達(dá)上調(diào)，miR-205-5p、miR-675-3p、miR-373-5p、miR-372-3p、miR-371a-3p、miR-675-5p、miR-10a-5p 和miR-4532 表達(dá)下調(diào)，后續(xù)PCR 檢測(cè)結(jié)果也驗(yàn)證了這一點(diǎn)。這表明上述miRNA 在肝癌耐5-FU 和ADR 發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有重要作用。此外我們還發(fā)現(xiàn)，miR-4446-3p 在Bel-7402/5-FU 細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，而miR-373-3p在Bel-7402/ADR細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，提示miR-4446-3p 參與了Bel-7402/5-FU 耐藥性的形成，miR-373-3p參與了Bel-7402/ADR 耐藥性的形成。

研究顯示，上述miRNA 在不同腫瘤耐藥機(jī)制中可能發(fā)揮不同的作用（目前未見(jiàn)miR-373-3p 的研究報(bào)道）。miR-4532 在乳腺耐藥和敏感細(xì)胞中差異表達(dá)，它可通過(guò)調(diào)節(jié)HIC-1 的表達(dá)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐藥性［4］，這可能成為逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性的新的治療靶點(diǎn)。ZICHITTEllA 等［5］報(bào)道，在缺氧微環(huán)境中，直腸癌中miR-675-5p 表達(dá)升高，通過(guò)抑制Caspase-3影響5-FU誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡，從而增強(qiáng)耐藥性。CHEN 等［6］報(bào)道，在大腸癌細(xì)胞中，miR-31-5p 高表達(dá)導(dǎo)致使大腸癌對(duì)奧沙利鉑產(chǎn)生耐藥性，其機(jī)制是由于miR-31-5p 抑制了大腫瘤抑制激酶2（LATS2）表達(dá)；而抑制miR-31-5p表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡并增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。葉茸茸［7］報(bào)道，與小細(xì)胞肺癌親本細(xì)胞株H69 相比，miR-4446-3P 在小細(xì)胞肺癌多藥耐藥細(xì)胞H69AR 中呈高表達(dá)。李清華等［8］報(bào)道，結(jié)直腸腺瘤復(fù)發(fā)患者與未復(fù)發(fā)患者相比，miR-4446-3p 表達(dá)上調(diào)，其高表達(dá)可能參與了結(jié)直腸腺瘤的復(fù)發(fā)機(jī)制。miR-372-3p可能作為一種致癌物，在直腸癌［9］、睪丸生殖細(xì)胞腫瘤［10］和口腔癌［11］等多種腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮作用。在結(jié)直腸癌中，miR-372-3p 高表達(dá)與腫瘤大小和分化顯著相關(guān)［12］，miR-372-3p上調(diào)通過(guò)抑制LATS2、抑制Hippo信號(hào)通路參與結(jié)直腸癌的進(jìn)展。在鼻咽癌中，miR-372通過(guò)下調(diào)PBK、激活p53信號(hào)通路抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，同時(shí)miR-372 過(guò)表達(dá)也增強(qiáng)了對(duì)放療的敏感性［13］。然而，在胃癌［14］、肝癌［15］和乳腺癌［16］中，miR-372 可促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移；在口腔癌［17］、鼻咽癌［18］、腎細(xì)胞癌［19］、前列腺癌［20］中，miR-31-5p可顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)，可能成為腫瘤治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

一個(gè)miRNA 可以同時(shí)調(diào)控多個(gè)靶基因，而一個(gè)靶基因可以被多個(gè)miRNA 調(diào)控，這使得它們?cè)诓煌哪[瘤中發(fā)揮不同的作用。本研究對(duì)篩選出的10個(gè)差異表達(dá)的miRNA 預(yù)測(cè)靶基因進(jìn)行GO 和KEGG分析，以期尋找miRNA 參與調(diào)控的生物學(xué)功能和相關(guān)通路，結(jié)果顯示，其參與正向調(diào)控RNA 聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子、酶結(jié)合和高爾基體的轉(zhuǎn)錄調(diào)控等生物過(guò)程，富集的通路有泛素依賴的蛋白酶體降解途徑、PAR1通路、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、TGF-β 信號(hào)通路。TGF-β 可在上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，與多種纖維化疾病和癌癥進(jìn)展相關(guān)［21］。研究顯示，miR-372 表達(dá)可顯著抑制HaCaT 細(xì)胞中TGF-β 誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化［22］。MAPK 位于許多生長(zhǎng)因子的下游，是細(xì)胞增殖最重要的途徑之一，許多證據(jù)表明，MAPK 過(guò)度表達(dá)和激活在癌癥進(jìn)展中起重要作用。miRNA 可調(diào)節(jié)MAPK 信號(hào)，而MAPK 信號(hào)通常在癌癥進(jìn)展的情況下過(guò)度表達(dá)，表明miRNA與MAPK信號(hào)通路之間的串?dāng)_在人類癌癥的發(fā)展中起關(guān)鍵作用。一項(xiàng)對(duì)肝細(xì)胞癌的研究表明，EGFRp38 MAPK 可下調(diào)miR-675-5p 表達(dá)，其下調(diào)可增強(qiáng)PD-L1 mRNA 的穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致PD-L1 積累［23］。在L-精氨酸誘導(dǎo)的胰腺炎中，毒蕈堿乙酰膽堿受體被激活并通過(guò)p38 MAPK 信號(hào)通路調(diào)節(jié)胰腺炎，在體外和體內(nèi)胰腺炎模型中，miR-31-5p 表達(dá)均降低［24］，提示miR-31-5p表達(dá)與MAPK信號(hào)通路之間存在重要關(guān)系?；谝陨涎芯?，我們推測(cè)差異表達(dá)的miRNA 可能通過(guò)調(diào)控MAPK、TGF-β 等信號(hào)通路參與肝癌耐藥的形成。

本研究通過(guò)芯片數(shù)據(jù)和生物信息學(xué)方法篩選在肝細(xì)胞癌耐藥細(xì)胞中差異表達(dá)的miRNA，并對(duì)這些miRNA的表達(dá)情況進(jìn)行驗(yàn)證。進(jìn)一步的功能分析表明這些miRNA可能通過(guò)調(diào)控MAPK和TGF-β等信號(hào)通路參與肝癌耐藥的發(fā)生過(guò)程。但本研究也存在一定的局限性：其一，本文鑒定的miRNA有些已被證明與其他腫瘤耐藥相關(guān)，但部分miRNA 如miR-373-3p目前尚無(wú)相關(guān)證據(jù)，這些miRNA 是否在肝癌耐藥過(guò)程中發(fā)揮作用仍不明確；其二，克服腫瘤多藥耐藥性是未來(lái)肝癌治療的研究重點(diǎn)，而miRNA 介導(dǎo)的耐藥又具有多樣性和復(fù)雜性的特點(diǎn)，其靶基因的功能較復(fù)雜，要在多個(gè)miRNA 及其靶基因中找到導(dǎo)致肝癌細(xì)胞耐藥的關(guān)鍵機(jī)制，有待進(jìn)一步研究探索。