鄭麗 秦學(xué)維 王利民 姚賢鳳 陳梅 伍丹丹

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科，貴州 貴陽(yáng) 550001)

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)水平增長(zhǎng)，生活質(zhì)量及飲食結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致我國(guó)趕超美國(guó)成為糖尿病第一大國(guó)〔1〕。糖尿病發(fā)展后期容易出現(xiàn)糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病腎病、糖尿病足等嚴(yán)重并發(fā)癥〔2〕。據(jù)臨床數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，糖尿病視網(wǎng)膜病變?cè)谔悄虿』颊咧屑s占40%，且若無(wú)法及時(shí)控制血糖會(huì)導(dǎo)致視網(wǎng)膜持續(xù)出血，對(duì)視力造成嚴(yán)重影響〔3〕。糖尿病視網(wǎng)膜病變是指機(jī)體長(zhǎng)期處于高糖狀態(tài)，導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管自我調(diào)節(jié)出現(xiàn)紊亂的過(guò)程，嚴(yán)重者可導(dǎo)致失明。臨床對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變進(jìn)行治療以降血糖為主，同時(shí)配合血管、神經(jīng)保護(hù)劑進(jìn)行對(duì)癥治療〔4,5〕。本研究建立糖尿病視網(wǎng)膜病變模型，通過(guò)Wnt信號(hào)通路探究上調(diào)miR-184對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變模型大鼠的干預(yù)效果。

1 材料與方法

1.1材料 研究動(dòng)物：選取40只SD健康大鼠，來(lái)源于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司。9～12月齡，平均(10.5±1.3)月齡。體重200～220 g，平均體重(210.0±8.5)g。環(huán)境溫度(23.1±1.7)℃，濕度35%～42%，12 h光照晝夜交替照明環(huán)境下喂養(yǎng)1 w，給予標(biāo)準(zhǔn)鼠科動(dòng)物飼料，不限制飲水與飲食。本文研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

主要試劑：兔抗小鼠谷胱甘肽(GSH)抗體、兔抗大鼠一氧化氮(NO)抗體(Hyclone公司)；兔抗糖原合成激酶(GSK)-3β、β-連環(huán)蛋白(catenin)、原癌基因(C-Myc)多克隆抗體(北京搏奧森生物技術(shù)有限公司)；小鼠抗大鼠總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)抗體(Dako公司)

1.2方法

1.2.1建模及分組 大鼠飼養(yǎng)1 w，飼養(yǎng)環(huán)境溫度保持在21～25℃，12 h光照，不限制飲水與飲食。參考時(shí)倩倩等〔6〕研究中糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠模型建立方法并進(jìn)行細(xì)微改動(dòng)，對(duì)隨機(jī)選取的30只SD健康大鼠建立糖尿病視網(wǎng)膜病變模型。大鼠禁食12 h后尾靜脈注射鏈尿佐菌素(STZ)溶液40 mg/kg建立高糖模型，72 h后對(duì)所有大鼠進(jìn)行空腹血糖水平檢測(cè)，若檢測(cè)水平≥16.7 mmol/L，則代表糖尿病模型建模成功。大鼠均給予高脂飼料喂養(yǎng)1個(gè)月后，進(jìn)行熒光素血管造影檢查，若糖尿病大鼠眼底出現(xiàn)明顯視網(wǎng)膜出血及滲出等視網(wǎng)膜病變表現(xiàn)，說(shuō)明糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠建模成功。建模過(guò)程中死亡5只，成功25只。將建模成功的25只大鼠，隨機(jī)分為模型組9只、下調(diào)miR-184組8只、上調(diào)miR-184組8只。下調(diào)miR-184組尾部靜脈注射30 mg/kg miR-184拮抗劑(antagomiR-184)，上調(diào)miR-184組大鼠尾部靜脈注射30 mg/kg雙鏈形式miR-184(agomiR-184)，正常組、模型組采用同等劑量的生理鹽水進(jìn)行尾部靜脈注射。各組大鼠連續(xù)干預(yù)10 w。

1.2.2標(biāo)本采集 所有大鼠連續(xù)干預(yù)1 w后取靜脈血液3 ml，2 000 r/min離心20 min，分離上清液，置于-70℃溫度下保存。麻醉處死后，對(duì)大鼠進(jìn)行解剖，快速取出新鮮大鼠雙眼視網(wǎng)膜。

1.2.3蘇木素-伊紅(HE)染色 取大鼠雙眼視網(wǎng)膜，液氮冷凍后常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋，做5 μm切片。將切片烤干后進(jìn)行脫蠟處理，之后順序置入不同濃度的酒精中各復(fù)水3 min。使用蘇木素染色15 min后清洗3次，使用鹽酸酒精分化處理30 s，充分清洗之后使用1%伊紅染色，酒精脫水處理后進(jìn)行脫蠟處理，封片后使用顯微鏡進(jìn)行觀(guān)察。

1.2.4血脂、血糖、GSH、NO水平檢測(cè) 對(duì)TC、TG、GSH、NO水平采用免疫比濁法進(jìn)行檢測(cè)。準(zhǔn)備3個(gè)試管并分別標(biāo)記為標(biāo)準(zhǔn)管、測(cè)定管及空白管，3個(gè)試管中均加入350 μl緩沖液，標(biāo)準(zhǔn)管中加入20 μl TC、TG標(biāo)準(zhǔn)液，測(cè)定管中加入20 μl血清，空白管中加入20 μl蒸餾水3個(gè)試管分別搖晃均勻，常溫環(huán)境靜置5～10 min后使用分光光度計(jì)進(jìn)行比色，在500 nm波長(zhǎng)處以空白管調(diào)零，記錄吸光度，對(duì)TC、TG、GSH、NO水平進(jìn)行計(jì)算。采用血糖分析儀對(duì)空腹血糖水平進(jìn)行檢測(cè)，并進(jìn)行組間比較。

1.2.5血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、腫瘤壞死因子(TNF)-α采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)進(jìn)行水平檢測(cè) 將待測(cè)標(biāo)本置于室溫后，標(biāo)記酶標(biāo)板，制作標(biāo)準(zhǔn)品，然后取出試劑盒，以1∶2的稀釋液稀釋樣品；在反應(yīng)孔上依次加入稀釋好的待測(cè)血清和標(biāo)準(zhǔn)品100 μl/孔，放置37℃恒溫孵育箱中濕育2 h；用專(zhuān)用的洗滌液將反應(yīng)板清洗3次以后，再加入抗體工作液(1∶100倍稀釋后)100 μl/孔，放于37℃恒溫孵育箱中濕育45 min；繼續(xù)清洗反應(yīng)板4次后，在反應(yīng)孔內(nèi)加入四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶液100 μl/孔，置于37℃恒溫孵育箱中濕育45 min后在反應(yīng)孔內(nèi)加入終止液100 μl/孔終止反應(yīng)，在450 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，經(jīng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算VEGF、TNF-α水平。

1.2.6Western印跡檢測(cè)各組大鼠GSK-3β、β-catenin、C-Myc表達(dá) 使用磷酸鹽緩沖液(PBS)緩沖液對(duì)標(biāo)本沖洗之后裂解30 min，測(cè)定蛋白濃度。取20 μg/孔蛋白質(zhì)，添加蛋白緩沖液后進(jìn)行電泳，10 min后將電轉(zhuǎn)膜置于10%的牛奶中浸泡，常溫環(huán)境下封閉90 min。之后結(jié)合一抗、稀釋?zhuān)跤? d，取出后使用TBST液沖洗，結(jié)合二抗，60 min后清洗、顯色，對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白GSK-3β、β-catenin、C-Myc表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)方差分析、F檢驗(yàn)、獨(dú)立t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組病理形態(tài) 如圖1所示，正常組視網(wǎng)膜表面光滑、結(jié)構(gòu)清晰、無(wú)異常增生。與正常組相比，模型組視網(wǎng)膜各層充血、細(xì)胞排列不勻。與模型組相比，下調(diào)miR-184組視網(wǎng)膜各層充血嚴(yán)重、視網(wǎng)膜外有萎縮現(xiàn)象、表面凹凸不平，上調(diào)miR-184組視網(wǎng)膜各層充血量相對(duì)較少、內(nèi)膜較為光滑、未見(jiàn)視網(wǎng)膜萎縮、細(xì)胞排列緊密。

圖1 各組視網(wǎng)膜病理形態(tài)(HE染色，×400)

2.2各組TC、TG、空腹血糖水平對(duì)比 如表1所示，與正常組相比，模型組TC、TG、空腹血糖水平顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，下調(diào)miR-184組TC、TG、空腹血糖水平顯著升高(P<0.05)；與下調(diào)miR-184組相比，上調(diào)miR-184組TC、TG、空腹血糖水平顯著降低(P<0.05)。

2.3各組VEGF、TNF-α水平比較 與正常組相比，模型組VEGF、TNF-α水平上升(P<0.05)；與模型組相比，下調(diào)miR-184組VEGF、TNF-α水平顯著上升(P<0.05)；與下調(diào)miR-184組相比，上調(diào)miR-184組VEGF、TNF-α水平顯著下降(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.4各組GSH、NO水平對(duì)比 與正常組相比，模型組GSH顯著下降、NO水平顯著上升(P<0.05)；與模型組相比，下調(diào)miR-184組GSH下降、NO水平顯著上升(P<0.05)；與下調(diào)miR-184組相比，上調(diào)miR-184組GSH顯著上升、NO水平顯著下降(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.5各組GSK-3β、β-catenin、C-Myc表達(dá)對(duì)比 如表2、圖2所示，與正常組相比，模型組GSK-3β表達(dá)顯著升高、β-catenin、C-Myc表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，下調(diào)miR-184組GSK-3β表達(dá)顯著升高、β-catenin、C-Myc表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與下調(diào)miR-184組相比，上調(diào)miR-184組GSK-3β表達(dá)顯著降低，β-catenin、C-Myc表達(dá)顯著升高(P<0.05)。

表1 各組TC、TG、空腹血糖、VEGF、TNF-α水平對(duì)比

表2 各組GSH、NO水平及GSK-3β、β-catenin、C-Myc表達(dá)對(duì)比

1～4：正常組、模型組、下調(diào)miR-184組、上調(diào)miR-184組

3 討 論

據(jù)流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)糖尿病發(fā)病率在13%左右，其中糖尿病視網(wǎng)膜病變是因糖尿病誘發(fā)的以微血管損傷為特征的并發(fā)癥之一，其發(fā)病率約占糖尿病患者總數(shù)的40%〔7〕。微血管長(zhǎng)期處于高糖狀態(tài)下導(dǎo)致的視網(wǎng)膜微血管代謝能力是導(dǎo)致糖尿病視網(wǎng)膜病變的主要原因，若血糖無(wú)法控制則會(huì)導(dǎo)致視網(wǎng)膜持續(xù)出血，對(duì)視力造成影響。持續(xù)出血導(dǎo)致視網(wǎng)膜屏障受損，微血管異常增生，對(duì)視網(wǎng)膜功能產(chǎn)生影響，導(dǎo)致患者視力下降，嚴(yán)重者甚至導(dǎo)致失明〔8〕。

高血糖導(dǎo)致眼底微循環(huán)紊亂，激活催化相關(guān)酶，促進(jìn)新生血管發(fā)生。在糖尿病大鼠中其視神經(jīng)纖維軸漿流，導(dǎo)致視神經(jīng)纖維萎縮，激活誘導(dǎo)凋亡基因，集中視神經(jīng)損害〔9〕。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路是一條廣泛存在于度細(xì)胞生物體內(nèi)的具有高度進(jìn)化保守性的信號(hào)通路，該通路對(duì)細(xì)胞的增生、分化、凋亡具有調(diào)節(jié)作用，在多種器官發(fā)育過(guò)程及生命體的眾多病理生理過(guò)程中具有重要作用。研究表明，免疫功能維持、炎癥發(fā)生、新生血管形成及創(chuàng)傷愈合及組織再生與Wnt信號(hào)通路之間具有潛在聯(lián)系〔10,11〕。

Wnt信號(hào)通路由Wnt配對(duì)蛋白、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜上受體內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)部分和細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控部分組成。其與視網(wǎng)膜發(fā)育、視網(wǎng)膜血管發(fā)育、視網(wǎng)膜保護(hù)之間密不可分，同時(shí)與視網(wǎng)膜疾病之間存在密切聯(lián)系〔12,13〕。視網(wǎng)膜中β-catenin表達(dá)在糖尿病視網(wǎng)膜病變患者中呈異常高表達(dá)，經(jīng)典Wnt信號(hào)通路在糖尿病視網(wǎng)膜病變中處于激活狀態(tài)。動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)，Wnt信號(hào)通路共受體低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP5/6)呈現(xiàn)異常表達(dá)，分泌型蛋白(Dkk1)抑制劑對(duì)視網(wǎng)膜炎癥及新生血管滲漏具由改善作用，同時(shí)阻斷活性氧簇產(chǎn)生，Wnt信號(hào)通路參與糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生發(fā)展〔13,14〕。

糖尿病的發(fā)生會(huì)降低脂蛋白酶活性，從而導(dǎo)致患者血脂水平上升〔15〕。VEGF作為具有特異性的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，對(duì)血管生成具有誘導(dǎo)作用，在糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生時(shí)，VEGF對(duì)血-視網(wǎng)膜屏障造成損傷，同時(shí)對(duì)血管的通透性產(chǎn)生促進(jìn)作用導(dǎo)致血漿外滲，對(duì)纖維蛋白凝膠形成的同時(shí)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖及新生血管內(nèi)向生成產(chǎn)生促進(jìn)效果。相關(guān)研究顯示，VEGF在糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用〔16,17〕。TNF-α作為常見(jiàn)的且即為重要的炎性因子，對(duì)單核細(xì)胞與中性粒細(xì)胞具有活化或趨化的作用，同時(shí)其能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放大量凝血因子，強(qiáng)化局部炎性反應(yīng)作用〔18〕。本研究結(jié)果顯示，上調(diào)miR-184干預(yù)糖尿病視網(wǎng)膜病變模型大鼠可有效調(diào)控血脂、血糖水平，改善眼底視網(wǎng)膜環(huán)境。

高血糖引起的機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)是糖尿病視網(wǎng)膜病變的主要原因，抗氧化物質(zhì)GSH水平降低和氧化炎癥因子水平的提高為其主要表現(xiàn)。低水平的GSH和水平升高的NO能夠?qū)е乱暰W(wǎng)膜血流改變，造成白細(xì)胞黏滯增加，對(duì)視網(wǎng)膜基底膜產(chǎn)生增厚作用，對(duì)GSH、NO水平逆轉(zhuǎn)能夠?qū)σ暰W(wǎng)膜血流產(chǎn)生改善作用〔19,20〕。本文研究結(jié)果顯示，上調(diào)miR-184干預(yù)糖尿病視網(wǎng)膜病變模型大鼠可有效降低血管通透性，從而改善糖尿病誘發(fā)的視網(wǎng)膜病變。

楊靜〔21〕研究中表示，對(duì)糖尿病大鼠模型眼內(nèi)的β-catenin基因進(jìn)行敲除，發(fā)現(xiàn)大鼠視網(wǎng)膜新生血管及血管滲漏減少，有效緩解炎性因子的過(guò)表達(dá)和周細(xì)胞缺失，證實(shí)Wnt信號(hào)通路的激活對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生在具有重要作用。同時(shí)研究中表示，大鼠模型中視網(wǎng)膜內(nèi)的miR-184表達(dá)明顯上調(diào)，而miR-184對(duì)Wnt信號(hào)通路具有調(diào)節(jié)作用，說(shuō)明miR-184表達(dá)水平上升是視網(wǎng)膜Wnt通路異常激活的機(jī)制之一〔22,23〕。本文研究結(jié)果顯示，Wnt信號(hào)通路在糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。