龍春頻 林泉峰 歐陽堅 梁卉 袁曉兵

(萍鄉(xiāng)衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院腫瘤研究實驗室，江西 萍鄉(xiāng) 337000)

阿爾茨海默病(AD)是一種神經(jīng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)為認知障礙和記憶喪失等。老年斑是AD的主要病理變化之一，其主要分布在海馬區(qū)及附近，由β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積形成〔1〕。研究顯示，Aβ能對神經(jīng)細胞發(fā)揮毒性作用，誘導(dǎo)細胞凋亡，在對神經(jīng)細胞的損傷過程中涉及氧化應(yīng)激和線粒體凋亡〔2,3〕。黃連解毒湯成分為黃連、黃柏、黃芩、梔子，為清熱解毒的代表方。研究報道，黃連解毒湯能夠通過抗氧化應(yīng)激，降低梔子導(dǎo)致的肝細胞凋亡〔4〕。黃連解毒湯還可以提高神經(jīng)營養(yǎng)因子水平，減輕氧化應(yīng)激對神經(jīng)的毒性作用〔5〕。研究顯示，細胞凋亡除含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)依賴途徑外，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)也有密切聯(lián)系〔6〕。Gerakis等〔7〕報道，在AD患者的腦組織中，Aβ沉積可引起神經(jīng)元發(fā)生ERS，導(dǎo)致神經(jīng)元退變。目前對于黃連解毒湯含藥血清對Aβ誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元凋亡的影響及其中涉及的機制尚不明確。本研究觀察黃連解毒湯含藥血清對Aβ誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元凋亡及葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(GRP)78/蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)/CCAAT-增強子結(jié)合蛋白同源蛋白(CHOP)通路的影響，初步探討黃連解毒湯含藥血清對神經(jīng)元的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 小鼠海馬神經(jīng)元細胞HT22購自青旗(上海)生物技術(shù)發(fā)展有限公司；Aβ25～35購自MCE公司；2月齡、體重(200±10)g SPF級雄性SD鼠20只購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心；DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；6孔板、24孔板和96孔板購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)和0.2%胰蛋白酶溶液購自武漢普諾賽生命科技有限公司；TUNEL細胞凋亡(綠色熒光)檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；蛋白提取試劑盒和蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；B細胞淋巴瘤(Bcl)-2抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體、Caspase-3抗體、GRP78抗體、PERK抗體和CHOP抗體均購自Abcam(中國)公司。生物安全柜購自廣州淶泊銳科技股份有限公司；CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；高速低溫離心機購自SIGMA公司；電泳儀、凝膠成像儀、酶標儀均購自Bio-Rad公司。

1.2Aβ25～35溶液制備 將Aβ25～35溶于去離子水中，用0.22 μm濾膜進行過濾，37℃孵育7 d，-20℃避光保存。實驗使用10 μmol/L Aβ25～35〔8〕作用于海馬神經(jīng)元細胞建立損傷模型。

1.3黃連解毒湯含藥血清制備 黃連解毒湯處方：黃連9 g、黃柏6 g、黃芩6 g、梔子9 g，加蒸餾水煎煮濃縮至1∶2，待冷卻后緩慢加入乙醇攪拌，使含醇量達50%后靜置2 d，過濾取上清并回收乙醇，藥劑使用前加蒸餾水稀釋至所需濃度。將20只SD鼠隨機分為空白組和黃連解毒湯低、中、高劑量組，每組5只，用藥劑量按照動物體表面積比率換算等劑量法，黃連解毒湯低、中、高劑量組大鼠分別以2.7、5.4、8.1 g/kg灌胃給藥，空白組給予蒸餾水灌胃，灌胃1次/d、2 ml/次，連續(xù)7 d。最后1次給藥3 h后，對各組大鼠進行腹主動脈穿刺取血，離心取上清并除菌滅活，儲于-20℃環(huán)境備用。

1.4細胞培養(yǎng)及分組 將HT22細胞隨機分為5組，每組各設(shè)置10個平行對照：1、對照組：給予HT22細胞空白血清培養(yǎng)24 h；2、Aβ組：向HT22細胞中加入Aβ25～35(40 μmol/L)和空白血清，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；3～5、黃連解毒湯低、中、高劑量組：向HT22細胞中加入Aβ25～35(40 μmol/L)1 h后再加入黃連解毒湯含藥血清，培養(yǎng)24 h。

1.5MTT法檢測海馬神經(jīng)元細胞活性 將HT22細胞以5×104個/ml的密度接種于96孔板中培養(yǎng)過夜，按照1.4中的分組進行處理。每孔加入20 μl MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h后，1 500 r/min離心10 min，棄去培養(yǎng)基，每孔加入150 μl DMSO，避光并用振蕩器混勻，通過酶標儀測定每孔細胞的570 nm吸光度(A)值。細胞活性(%)=(A1～5-A空白組)/(A1-A空白組)×100%，空白組為150 μl的細胞培養(yǎng)基，用以排除培養(yǎng)板和培養(yǎng)基本底吸光值對實驗的影響。

1.6TUNEL法檢測海馬神經(jīng)元細胞凋亡 在24孔板中放入已消毒的蓋玻片，加入密度為5×105個/ml的HT22細胞培養(yǎng)過夜，按照1.4中的分組進行處理，遵循TUNEL檢測試劑盒說明書對取出的蓋玻片進行固定、洗滌、孵育和顯色，熒光顯微鏡下觀察。用不含末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶的標記液代替TUNEL混合反應(yīng)液作陰性對照，用陽性對照試劑盒為陽性對照。計算細胞凋亡指數(shù)=凋亡(陽性)細胞數(shù)/視野細胞總數(shù)×100%。

1.7Western印跡檢測Bcl-2、Bax、Caspase-3、GRP78、PERK和CHOP蛋白蛋白表達水平 將HT22細胞以1×106個/ml的密度接種于6孔板中培養(yǎng)過夜，按照1.4中的分組進行處理。棄去培養(yǎng)基后用胰蛋白酶消化細胞，終止后低溫1 500 r/min離心10 min，無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞2次，再次離心棄上清，加入細胞裂解液，按照試劑盒說明書提取細胞總蛋白。蛋白定量后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，小心取出凝膠并使用電轉(zhuǎn)儀進行聚偏氯乙烯(PVDF)轉(zhuǎn)膜，在室溫下用5%脫脂奶封閉1 h，加入稀釋(1∶1 000)的對應(yīng)一抗，4℃搖床孵育過夜，棄去一抗溶液并洗滌PVDF膜，加入稀釋(1∶2 000)的二抗溶液，室溫搖床1 h，洗膜3次，電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色并用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1黃連解毒湯對Aβ誘導(dǎo)HT22細胞損傷的保護作用 對照組HT22細胞呈現(xiàn)多極形或錐形，細胞間突起相互連接成網(wǎng)，胞體折光性強。Aβ25～35處理細胞后，細胞突起收縮，胞間連接斷裂，胞體折光性下降，可見部分胞體溶解死亡。黃連解毒湯含藥血清干預(yù)細胞后，可明顯改善Aβ對HT22細胞的形態(tài)學(xué)損傷，見圖1。

2.2黃連解毒湯對Aβ?lián)p傷HT22細胞活性的影響 與對照組相比，Aβ組細胞活性顯著降低(P<0.05)；與Aβ組相比，黃連解毒湯各組的細胞活性顯著升高(P<0.05)，見表1。

2.3黃連解毒湯對Aβ誘導(dǎo)HT22細胞凋亡的影響 與對照組比較，Aβ組細胞凋亡指數(shù)顯著升高(P<0.05)；與Aβ組比較，黃連解毒湯各組的細胞凋亡指數(shù)顯著降低(P<0.05)，見表1、圖2。

圖1 黃連解毒湯對Aβ誘導(dǎo)HT22細胞損傷的保護作用(TUNEL染色，×400)

表1 黃連解毒湯對Aβ?lián)p傷HT22細胞活性、凋亡、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白水平及GRP78、PERK和CHOP蛋白表達的影響

圖2 黃連解毒湯對Aβ誘導(dǎo)HT22細胞凋亡的影響(TUNEL染色，×100)

2.4黃連解毒湯對Aβ?lián)p傷HT22細胞Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白水平的影響 與對照組相比，Aβ組細胞Bcl-2/Bax水平顯著降低，cleaved-/pro-Caspase-3水平顯著升高(均P<0.05)；與Aβ組比較，黃連解毒湯各組細胞Bcl-2/Bax水平顯著升高，cleaved-/pro-Caspase-3水平顯著降低(均P<0.05)，見表1、圖3。

2.5黃連解毒湯對Aβ?lián)p傷HT22細胞GRP78、PERK和CHOP蛋白表達的影響 與對照組相比，GRP78、PERK和CHOP蛋白表達顯著升高(均P<0.05)；與Aβ組比較，黃連解毒湯各組細胞GRP78、PERK和CHOP蛋白表達顯著降低(均P<0.05)，見表1、圖4。

1～5:對照組，Aβ組，黃連解毒湯低劑量組，黃連解毒湯中劑量組，黃連解毒湯高劑量組；圖4同

圖4 黃連解毒湯對Aβ?lián)p傷HT22細胞GRP78、PERK和CHOP蛋白表達的影響

3 討 論

AD屬中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，嚴重威脅人類健康，患者在記憶、運動和語言等方面發(fā)生障礙，嚴重者喪失生活自理能力。AD患者神經(jīng)系統(tǒng)病變主要包括：Aβ沉積形成的老年斑、細胞內(nèi)異常磷酸化蛋白聚集形成的神經(jīng)元纖維纏結(jié)和細胞凋亡造成的神經(jīng)元突觸連接丟失〔9〕。越來越多的研究顯示，誘發(fā)AD的各種原因中均涉及Aβ積聚和沉積，它是AD發(fā)生的關(guān)鍵因素〔10～12〕。因此，如何解除Aβ引起的神經(jīng)元損害，減輕中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，成為AD治療策略相關(guān)研究的一個焦點。

Bcl-2家族是細胞凋亡過程中涉及的一類調(diào)節(jié)因子，它的成員抗凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax是否平衡對細胞是否進入凋亡通路起重要作用。Bcl-2維持線粒體膜通透性，保護線粒體的完整性，減少細胞色素C的釋放，抑制細胞凋亡；Bax則影響線粒體膜的滲透性，誘導(dǎo)細胞色素C從線粒體膜間隙進入胞漿，間接促進Caspase-3剪切激活，誘導(dǎo)細胞凋亡〔13,14〕。黃連解毒湯是經(jīng)典的清熱解毒方。有報道稱，黃連解毒湯可通過清除或減少Aβ、抑制微管相關(guān)蛋白Tau過度磷酸化和抗感染等多種途徑對AD起到治療作用〔15〕。張茹蘭等〔16〕研究報道，黃連解毒湯含藥血清可通過抗氧化應(yīng)激和抑制線粒體凋亡途徑來減輕Aβ誘導(dǎo)HT22細胞毒性作用，降低細胞凋亡。本研究結(jié)果提示，黃連解毒湯能夠逆轉(zhuǎn)Aβ引起的海馬神經(jīng)元細胞活力降低，抑制細胞凋亡，可能通過抑制氧化應(yīng)激及線粒體凋亡實現(xiàn)。

有研究報道，ERS與細胞凋亡有著密切的聯(lián)系〔6〕。ERS由細胞內(nèi)外環(huán)境改變導(dǎo)致，會引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)發(fā)生聚集和鈣流失導(dǎo)致的穩(wěn)態(tài)失衡，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能出現(xiàn)紊亂，大量促凋亡蛋白被激活，誘導(dǎo)ERS反應(yīng)性細胞凋亡〔17〕。長時間持續(xù)的ERS會啟動GRP78/PERK/CHOP凋亡通路，正常結(jié)合在GRP78上的PERK被解離下來并得到激活，促進其下游促凋亡基因CHOP的表達，誘導(dǎo)細胞凋亡〔18〕。Xu等〔19〕研究發(fā)現(xiàn)，靜壓引起大鼠髁突軟骨細胞發(fā)生ERS，GRP78、PERK和CHOP表達上調(diào)，激活凋亡通路引起細胞凋亡。Yi等〔20〕在建立的神經(jīng)元ERS模型中檢測到PERK和CHOP蛋白表達上調(diào)可導(dǎo)致下丘腦神經(jīng)損傷。本研究結(jié)果表明，黃連解毒湯可能抑制GRP78/PERK/CHOP通路的激活，提示黃連解毒湯還可能通過抑制ERS，抑制Aβ所誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元細胞凋亡，進一步豐富了黃連解毒湯的藥理作用。

綜上，黃連解毒湯含藥血清可降低Aβ誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元細胞凋亡，抑制GRP78/PERK/CHOP通路激活，發(fā)揮對細胞的保護作用。但AD涉及的信號通路及作用機制較復(fù)雜，需要深入研究。