王芳芳，曹慧媛，汪 婧，王 寧，黃國良

廣東醫(yī)科大學(xué)中美腫瘤所 東莞市表觀遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東醫(yī)科大學(xué)附屬東莞第一醫(yī)院廣東省醫(yī)學(xué)分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 東莞 523808

結(jié)直腸癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一，全球范圍來看結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)的發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢(shì)[1]，在中國，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和病死率在所有癌中分別位居第3位和第5位[2]，嚴(yán)重威脅中國人民的身體健康以及國民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。因此，迫切需要進(jìn)一步研究結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，尋找結(jié)直腸癌新的診斷和治療靶點(diǎn)。

MicroRNAs(miRNAs)是19～25 nt的短RNA分子, 可調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)[3]。miRNA是基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在生物標(biāo)志物的開發(fā)中具有前景。目前，處于臨床前開發(fā)階段的miRNA模擬物(mimic)和miRNA抑制劑(inhibitor)有望成為新的治療藥物[4]。miR-200家族是miRNA家族之一，由miR-141/200a/200b/200c/429組成，參與調(diào)控細(xì)胞轉(zhuǎn)化、增殖和耐藥性等許多重要的生物學(xué)過程[5-6]。本研究通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miRNA模擬物和miRNA抑制劑觀察高低表達(dá)miR-200c-5p對(duì)人結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW480增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480(上海蓋寧生物公司)；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco公司)；含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化液(吉諾生物公司)；RT-qPCR主要試劑：RNA-easy(南京諾唯贊公司)；TB GREEN MIX、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)；CCK8試劑(ZETA公司)；miR-200c-5p引物、U6引物、miR-200c-5p模擬物/抑制劑及陰性對(duì)照物(廣州銳博生物公司)；Lipofectamine 3000(Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的分組及轉(zhuǎn)染: SW480在含有10%胎牛血清(FBS)的1640培養(yǎng)基中保存。細(xì)胞系置于5% CO2培養(yǎng)箱，保持在37 ℃環(huán)境下培養(yǎng)。選擇對(duì)數(shù)增殖期的細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，當(dāng)細(xì)胞貼壁匯合度達(dá)70%時(shí)，按照制造商的說明使用Lipofectamine 3000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)箱中放置48 h后取出收集樣品用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染miRNA模擬物和抑制劑。

1.2.2 RT-qPCR檢測(cè)miR-200c-5p的表達(dá): 采用RNA-easy法提取轉(zhuǎn)染48 h后的各組細(xì)胞中的總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明反轉(zhuǎn)錄總RNA為cDNA，每組取等量cDNA進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。以U6為內(nèi)參分析miR-200c-5p的表達(dá)，采用2-△△Ct計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 CCK-8法檢測(cè)SW480細(xì)胞活力: 將轉(zhuǎn)染48 h后的各組SW480細(xì)胞按照每孔2 000個(gè)接種于96孔板，分別在培養(yǎng)1、2、3、4 d時(shí)，每孔加100 μL的CCK-8試劑稀釋液，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，利用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450 nm波長處的吸光度(A)值，反映各孔細(xì)胞的活力。

1.2.4 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆形成能力:將各組SW480細(xì)胞以100個(gè)/孔接種于6孔板，置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育12～15 d直到出現(xiàn)細(xì)胞集落。棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液洗滌2次，用4%多聚甲醛固定后，用1%結(jié)晶紫染色20 min。

1.2.5 生物信息方法分析miR-200c-5p的靶基因及其在結(jié)直腸癌中的差異表達(dá):本研究使用R軟件multiMiR統(tǒng)計(jì)分析經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的miR-200c-5p的靶基因，從TCGA數(shù)據(jù)庫下載結(jié)直腸癌的基因表達(dá)和臨床數(shù)據(jù)，利用limma和ggplot2軟件對(duì)靶基因進(jìn)行差異分析和可視化；使用enrichment plot軟件對(duì)差異基因進(jìn)行富集分析以進(jìn)一步揭示miR-200c-5p可能與之相關(guān)的潛在生物途徑。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有比較均為雙側(cè)。

2 結(jié)果

2.1 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞后miR-200c-5p的表達(dá)水平

轉(zhuǎn)染模擬物組的miR-200c-5p水平顯著高于對(duì)照組，轉(zhuǎn)染抑制劑組的miR-200c-5p水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)(圖1A)。由此可見，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染模擬物/抑制劑可以成功高表達(dá)/低表達(dá)miR-200c-5p。

2.2 高表達(dá)/低表達(dá)miR-200c-5p對(duì)SW480細(xì)胞增殖活力的影響

高表達(dá)miR-200c-5p組的SW480細(xì)胞增殖活力明顯低于對(duì)照組，低表達(dá)miR-200c-5p組的SW480細(xì)胞增殖活力明顯高于對(duì)照組(P<0.05)(圖1B～C)。

2.3 高表達(dá)/低表達(dá)miR-200c-5p對(duì)SW480細(xì)胞克隆形成的影響

與對(duì)照組相比，miR-200c-5p模擬物組細(xì)胞克隆數(shù)顯著降低，miR-200c-5p抑制劑組細(xì)胞克隆數(shù)顯著增加(P<0.05)(圖2)。

2.4 miR-200c-5p靶基因及其在結(jié)直腸癌中的差異表達(dá)

生物信息分析結(jié)果顯示，miR-200c-5p經(jīng)過驗(yàn)證的靶基因有67個(gè)，其中在結(jié)直腸癌中有1個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，3個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，顯著上調(diào)的基因?yàn)镃XCL10，顯著下調(diào)的3個(gè)基因?yàn)镃2orf72、ZC3H12C和DST。KEGG富集分析結(jié)果顯示變化最顯著的3條相關(guān)通路為“melanoma”、 “microRNAs in cancer”和“bladder cancer”(圖3)。

A.expression of miR-200c-5p in SW480 cells after transient transfection with mimic/inhibitor; B.detection of the proliferation activity of SW480 cells with high expression of miR-200c-5p; C.detection of the proliferation activity of SW480 cells with low expression of miR-200c-5p; *P<0.05 compared with normal control group

*P<0.05 compared with normal control group圖2 miR-200c-5p對(duì)SW480細(xì)胞克隆形成能力的影響Fig 2 Effect of miR-200c-5p on clonogenic ability of SW480 cells

3 討論

結(jié)直腸癌是臨床上消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，在全球呈快速上升趨勢(shì)，是中國癌死亡相關(guān)的第五大原因[2]。已有研究證明，轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是結(jié)直腸癌相關(guān)死亡的主要原因。因此對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制的研究是有必要的。本研究的結(jié)果為miR-200c-5p在結(jié)直腸癌增殖及克隆形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用提供了確鑿證據(jù)。高水平表達(dá)miR-200c-5p可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖及克隆形成，低水平表達(dá)miR-200c-5p可以促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖及克隆形成。本研究提示miR-200c-5p是一種很有前途的結(jié)直腸癌治療靶點(diǎn)。

MicroRNAs是生物過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子。人類基因組中存在超過兩千個(gè)不同的miRNA，它們控制著大部分轉(zhuǎn)錄組，大多數(shù)miRNA通過失活或誘導(dǎo)mRNA降解來阻止翻譯，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控[7]。已有大量研究證明miR-200能夠調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(EMT)，是腫瘤轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)[8]。

本研究通過生物信息方法統(tǒng)計(jì)經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的 miR-200c-5p的靶基因，發(fā)現(xiàn)靶基因CXCL10在結(jié)直腸癌中的表達(dá)顯著上調(diào)，C2orf72、ZC3H12C和DST在結(jié)直腸癌中顯著下調(diào)。CXCL10是一種關(guān)鍵的驅(qū)動(dòng)趨化因子，可以在癌和炎性反應(yīng)自身免疫中指導(dǎo)CD4+和CD8+T細(xì)胞遷移特性[9]。C2orf72參與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展[10]；ZC3H12C能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞的炎性反應(yīng)，過表達(dá)Zc3h12c可降低TNFα(腫瘤壞死因子α)誘導(dǎo)的趨化因子和黏附分子的表達(dá)，從而降低單核細(xì)胞對(duì)HUVECs(人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)的黏附[11]。DST與多個(gè)免疫檢查點(diǎn)和趨化因子相關(guān)，可能通過影響免疫微環(huán)境來改變腫瘤的發(fā)生發(fā)展[12]。KEGG富集分析結(jié)果顯示miR-200c-5p可能在結(jié)直腸癌中參與“melanoma”、 “microRNAs in cancer”和“bladder cancer”。癌癥中的microRNAs通路與包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的9種癌的發(fā)展相關(guān);黑色素瘤和膀胱癌通路分別與黑素瘤和膀胱癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)?？傊?，本研究發(fā)現(xiàn)表明miR-200c-5p在結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖進(jìn)展中起到重要作用，miR-200c-5p可能成為結(jié)直腸癌診斷和治療的具有前景的生物標(biāo)志物。

A.volplot shows the differential expression of miR-200c-5p target genes in human colorectal cancer; B.KEGG enrichment analysis shows the related pathways of miR-200c-5p involved in the development of human colorectal cancer