魏健強(qiáng)，張春瑞

1.延安大學(xué)附屬醫(yī)院 神經(jīng)血管介入治療中心， 陜西 延安 716000; 2.漢中市人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科， 陜西 漢中 723000

缺血性卒中是病死率、殘疾率均很高的常見神經(jīng)系統(tǒng)疾病，在中國發(fā)病率較高，也是導(dǎo)致居民死亡的主要原因之一[1]。腦組織神經(jīng)元在腦卒中的發(fā)病及治療中可因缺氧/復(fù)氧過程造成大量凋亡，引發(fā)嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙，炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)在其中扮演著重要角色，減輕腦內(nèi)炎性反應(yīng)、增強(qiáng)抗氧化功能是抑制腦神經(jīng)元凋亡、改善腦缺血再灌注損傷的有效方法[2]。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)/核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear transcription factor-κB，NF-κB)通路與糖尿病、牙周炎、神經(jīng)炎性反應(yīng)等炎性疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，降低其通路蛋白磷酸化水平可明顯減少促炎細(xì)胞因子表達(dá)分泌，抑制牙周炎性反應(yīng)[3]，并可抑制缺血性中風(fēng)體內(nèi)外模型中神經(jīng)元凋亡，減輕神經(jīng)炎性反應(yīng)導(dǎo)致的腦組織病理學(xué)改變，保護(hù)神經(jīng)功能[4-5]。咪達(dá)唑侖是臨床常用的鎮(zhèn)靜麻醉藥物，可提高缺血缺氧性新生大鼠抗氧化能力，抑制缺血缺氧引發(fā)的神經(jīng)炎性反應(yīng)，下調(diào)凋亡蛋白表達(dá)，減輕神經(jīng)元凋亡及腦損傷，改善大鼠的神經(jīng)行為功能障礙[6]。因而推測咪達(dá)唑侖可能通過抑制MAPK/NF-κB信號通路激活減輕缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷，本文以咪達(dá)唑侖處理體外培養(yǎng)的缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷模型，對此假設(shè)進(jìn)行探究。

1 材料與方法

1.1 材料

咪達(dá)唑侖(純度98%，上海創(chuàng)賽科技有限公司)；MAPK激活劑C16-PAF(Biomedsci公司)；小鼠海馬神經(jīng)元完全培養(yǎng)基和小鼠海馬神經(jīng)元(武漢普諾賽生命科技有限公司)；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒和甲基噻唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；小鼠白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒、小鼠腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)ELISA試劑盒、小鼠白細(xì)胞介素-17(interleukin-17，IL-17)ELISA試劑盒、過氧化氫酶(catalase，CAT)活性測定試劑盒、兔源抗小鼠β肌動(dòng)蛋白(β-actin)一抗、兔源抗小鼠半胱氨酸蛋白酶-9(cysteinyl aspartate specific proteinase-9，caspase-9)一抗、兔源抗小鼠Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)一抗、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性檢測試劑盒和二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白檢測試劑盒(Abcam公司)；兔源抗小鼠NF-κB p65一抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)、兔源抗小鼠p-NF-κB p65一抗、兔源抗小鼠p-p38 MAPK一抗和兔源抗小鼠p38 MAPK一抗(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)及咪達(dá)唑侖最佳作用濃度篩選：復(fù)蘇海馬神經(jīng)元，離心后以其完全培養(yǎng)基洗滌，置于常氧培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)中無菌培養(yǎng)，接著0、5、10、40、70、100 ng/mL咪達(dá)唑侖[7]處理，每個(gè)藥物濃度6個(gè)孔，另選未接種細(xì)胞的6個(gè)孔作為空白對照，24 h后采用MTT試劑盒測量各孔吸光值，具體按照試劑盒說明書操作，計(jì)算出不同濃度咪達(dá)唑侖處理后的細(xì)胞活力=(咪達(dá)唑侖處理組細(xì)胞吸光值-空白對照組吸光值)/(咪達(dá)唑侖未處理組(0 ng/mL)吸光值-空白對照組吸光值)×100%。

1.2.2 細(xì)胞的分組處理及收集材料：貼壁培養(yǎng)12 h后，隨機(jī)分為:1)對照組;2)模型組:長滿瓶底后以0.5×106個(gè)/mL傳代接種在96孔板中，細(xì)胞貼壁24 h后，置于三氣培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2、95% N2)中缺氧3 h后馬上置于常氧培養(yǎng)箱中復(fù)氧12 h，誘導(dǎo)缺氧/復(fù)氧神經(jīng)元損傷模型[8];3)咪達(dá)唑侖組:以70 ng/mL的咪達(dá)唑侖處理;4)C16-PAF組:以終濃度4 μmol/L的C16-PAF[9]處理;5)咪達(dá)唑侖+C16-PAF聯(lián)合處理組。24 h后收集各組細(xì)胞沉淀及培養(yǎng)液。

1.2.3 Hoechst33258染色和流式細(xì)胞檢測細(xì)胞凋亡情況：以磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)漂洗細(xì)胞1次，以Hoechst 33258染液避光孵育5 min，再次以PBS漂洗1次后，置于熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞著色情況并任選3個(gè)視野拍照。

以PBS分別重懸后計(jì)數(shù)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果取約0.5×106個(gè)細(xì)胞，離心后PBS洗滌，采用Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒檢測細(xì)胞凋亡情況，具體按照試劑盒說明書操作，以Muticycle AV軟件分析所獲數(shù)據(jù)，得出各組細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 ELISA測定細(xì)胞LDH、TNF-α、IL-18、IL-17釋放量及細(xì)胞SOD、CAT活性：取出細(xì)胞沉淀，經(jīng)RIPA裂解液裂解提取總蛋白后，以BCA試劑盒測出其濃度，以各自試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.5 Western blot檢測細(xì)胞凋亡蛋白及MAPK/NF-κB通路蛋白表達(dá)：取出細(xì)胞沉淀，經(jīng)RIPA裂解液裂解提取總蛋白后，以BCA試劑盒測出其濃度，每組各取20 μg煮沸變性后跑電泳分離，通過濕轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)將其轉(zhuǎn)印到硝酸纖維膜上，以3%牛血清白蛋白溶液封閉蛋白非特異位點(diǎn)后自膜上裁下β-actin、p-p38 MAPK、p38 MAPK、p-NF-κB p65、NF-κB p65、caspase-9、Bax蛋白條帶，通過全自動(dòng)蛋白印跡系統(tǒng)孵育一抗、孵育二抗并洗滌后顯色，采集圖像后運(yùn)用Image J軟件進(jìn)行對蛋白表達(dá)進(jìn)行定量后統(tǒng)計(jì)，最后得到各組蛋白相對表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 咪達(dá)唑侖對缺氧/復(fù)氧神經(jīng)元活力的影響

咪達(dá)唑侖隨劑量升高增強(qiáng)缺氧/復(fù)氧神經(jīng)元活力，達(dá)到70 ng/mL時(shí)，細(xì)胞活力基本不再增強(qiáng)，進(jìn)入平臺期，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用70 ng/mL咪達(dá)唑侖處理缺氧/復(fù)氧神經(jīng)元(圖1)。

2.2 咪達(dá)唑侖對缺氧/復(fù)氧神經(jīng)元凋亡的影響

對照組神經(jīng)元核圓且大，染為微弱的藍(lán)色；模型組、咪達(dá)唑侖+C16-PAF組神經(jīng)元核固縮，大小不一，染為較強(qiáng)的藍(lán)色；咪達(dá)唑侖組神經(jīng)元核相比模型組變大變圓，藍(lán)色染色變淺；C16-PAF組神經(jīng)元核相比模型組更加固縮，藍(lán)色染色變深(圖2)。與對照組(3.73±0.91)比較，模型組(46.15±5.27)神經(jīng)元凋亡率明顯升高(P<0.05)。與模型組(46.15±5.27)、咪達(dá)唑侖+C16-PAF組(42.92±6.04)分別比較，咪達(dá)唑侖組(6.02±2.82)神經(jīng)元凋亡率均降低(P<0.05)；C16-PAF組(67.59±3.85)神經(jīng)元凋亡率均升高(P<0.05)(圖3，表1)。

2.3 咪達(dá)唑侖對缺氧/復(fù)氧神經(jīng)元抗氧化酶CAT、SOD水平及LDH釋放量的影響

與對照組比較，模型組神經(jīng)元LDH釋放量明顯升高(P<0.05)，細(xì)胞抗氧化酶CAT、SOD水平明顯降低(P<0.05)。與模型組、咪達(dá)唑侖+C16-PAF組分別比較，咪達(dá)唑侖組神經(jīng)元LDH釋放量均降低(P<0.05)，細(xì)胞抗氧化酶CAT、SOD活性均升高(P<0.05)；C16-PAF組神經(jīng)元LDH釋放量均升高(P<0.05)，細(xì)胞抗氧化酶CAT、SOD活性均降低(P<0.05)(表1)。

2.4 咪達(dá)唑侖對缺氧/復(fù)氧神經(jīng)元炎性因子TNF-α、IL-17、IL-18釋放量的影響

與對照組比較，模型組神經(jīng)元炎性因子TNF-α、IL-17、IL-18釋放量明顯升高(P<0.05)。與模型組、咪達(dá)唑侖+C16-PAF組分別比較，咪達(dá)唑侖組神經(jīng)元炎性因子TNF-α、IL-17、IL-18釋放量均降低(P<0.05)；C16-PAF組神經(jīng)元炎性因子TNF-α、IL-17、IL-18釋放量均升高(P<0.05)(表2)。

2.5 咪達(dá)唑侖對缺氧/復(fù)氧神經(jīng)元凋亡蛋白及MAPK/NF-κB通路蛋白表達(dá)的影響

與對照組比較，模型組神經(jīng)元凋亡蛋白caspase-9、Bax表達(dá)及MAPK/NF-κB通路p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65水平明顯升高(P<0.05)。與模型組、咪達(dá)唑侖+C16-PAF組分別比較，咪達(dá)唑侖組神經(jīng)元凋亡蛋白caspase-9、Bax表達(dá)及MAPK/NF-κB通路p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65水平均降低(P<0.05)；C16-PAF組神經(jīng)元凋亡蛋白caspase-9、Bax表達(dá)及MAPK/NF-κB通路p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65水平均升高(P<0.05)(表3,圖4)。

A.control group; B.model group; C.midazolam group; D.C16-PAF group; E.midazolam +C16-PAF group圖2 Hoechst33258染色檢測神經(jīng)元凋亡形態(tài)Fig 2 Hoechst33258 staining to detect apoptosis morphology of neurons(×400)

A.control group; B.model group; C.midazolam group; D.C16-PAF group; E.midazolam +C16-PAF group圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測神經(jīng)元凋亡Fig 3 Detection of neuronal apoptosis by flow cytometry

表1 各組神經(jīng)元抗氧化酶CAT、SOD水平及LDH釋放量Table 1 Levels of antioxidant enzymes CAT, SOD and LDH release of neurons in each group

表2 各組神經(jīng)元細(xì)胞炎性因子TNF-α、IL-17、IL-18釋放量Table 2 Neuronal inflammatory factor release amount of TNF-α， IL-17 and IL-18 in each

3 討論

神經(jīng)元凋亡是腦缺血再灌注損傷中的重要病理過程，受到多種機(jī)制的復(fù)雜調(diào)控，探討研究其調(diào)控機(jī)制及進(jìn)行過程，對缺血性卒中引發(fā)的腦損傷進(jìn)行防治具有積極理論和實(shí)用價(jià)值[10]。小膠質(zhì)細(xì)胞激活活引發(fā)的氧化應(yīng)激和炎性因子因子過度表達(dá)是缺血性腦損傷的主要病理機(jī)制，而嚴(yán)重的氧化應(yīng)激及炎性因子可導(dǎo)致缺血性腦損傷的體外模型中神經(jīng)元大量凋亡，因此針對氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和炎性因子進(jìn)行抑制， 可有效減輕腦卒中后神經(jīng)系統(tǒng)損傷[11]。咪達(dá)唑侖可降低大鼠海馬區(qū)細(xì)胞死亡受體表達(dá)，減輕其神經(jīng)細(xì)胞損傷，改善大鼠學(xué)習(xí)記憶功能[12]，并可明顯改善重癥腦損傷患者腦代謝指標(biāo)， 緩解其臨床癥狀[13]。本實(shí)驗(yàn)以不同濃度咪達(dá)唑侖干預(yù)缺氧/復(fù)氧處理后的神經(jīng)元，可提升其細(xì)胞活力，在一定范圍內(nèi)，隨濃度升高而作用增強(qiáng)，以70 ng/mL咪達(dá)唑侖干預(yù)缺氧/復(fù)氧處理后的神經(jīng)元，可明顯提升抗氧化酶CAT、SOD活性，降低促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-18、IL-17釋放量，進(jìn)而抑制LDH釋放及凋亡蛋白caspase-9、Bax表達(dá)，減輕神經(jīng)元損傷，降低其凋亡率，表明咪達(dá)唑侖具有較強(qiáng)的抗感染、抗氧化作用，可顯著抑制缺氧/復(fù)氧處理后的神經(jīng)元凋亡，進(jìn)一步證實(shí)了咪達(dá)唑侖對缺血性腦損傷的治療作用。

表3 各組神經(jīng)元凋亡蛋白及MAPK/NF-κB通路蛋白相對表達(dá)水平

圖4 各組神經(jīng)元凋亡蛋白及MAPK/NF-κB通路蛋白表達(dá)Fig 4 Expression of neuronal apoptotic protein and MAPK/NF-κB pathway protein in each group

MAPK是機(jī)體典型的神經(jīng)炎性因子及應(yīng)激反應(yīng)信號，在神經(jīng)元增殖、代謝及突觸可塑性等方面起到中心調(diào)控作用， 特異性抑制其激活可改善阿爾茨海默病小鼠突觸可塑性， 緩解其記憶缺陷[14]；NF-κB是其下游信號分子，抑制p38 MAPK和NF-κB p65的磷酸化，可明顯減弱缺血性卒中體內(nèi)外模型中的炎性因子反應(yīng)，緩解其神經(jīng)細(xì)胞損傷[15]，由此可知MAPK/NF-κB是重要的缺血性腦損傷治療靶點(diǎn)。提示咪達(dá)唑侖可通過抑制MAPK/NF-κB信號激活減輕缺氧/復(fù)氧神經(jīng)元損傷。