馮 薇，李雅麗，武 偉

(河北省承德市口腔醫(yī)院，河北 承德 067000)

傳統(tǒng)的牙周炎治療方法主要牙周基礎(chǔ)治療和局部抗生素應(yīng)用。這些方法可較好的改善牙周組織炎癥反應(yīng)，對(duì)牙槽骨缺損修復(fù)作用不大，甚至影響牙周組織的修復(fù)[2]。引導(dǎo)骨組織再生術(shù)(GBR)是一種新型治療方法，已逐步應(yīng)用于牙周疾病之中。它的基本原理為將骨粉均勻填入骨缺損部位，然后將屏障膜(GBRM)緊密覆蓋上面，可隔離上皮結(jié)締組織的侵犯，保護(hù)血凝塊，促進(jìn)牙槽骨骨組織的生長(zhǎng)和發(fā)育[3]。目前，用于制備GBRM的材料種類繁多，主要包括：聚乙醇酸(PGA)、膠原蛋白、明膠、膠原、天然絲素蛋白、聚乳酸(PLA)及其共聚物和殼聚糖(CS)等[4]。

雖然GBRM可促進(jìn)牙槽骨缺損的修復(fù)，但也依賴于牙周組織周?chē)臒o(wú)菌環(huán)境。因?yàn)榭谇恢写嬖诖罅康奈⑸锞海a(chǎn)生的生物因子和代謝廢物會(huì)阻礙牙周組織的修復(fù)[5]。因此，這種GBRM必須具備抗菌活性。近年來(lái)，研究者將多西環(huán)素等抗生素加入至GBRM的制備過(guò)程中，但是經(jīng)常使用抗生素容易產(chǎn)生耐用性[6]。因此，目前的研究方向轉(zhuǎn)向開(kāi)發(fā)一種更安全、環(huán)保、不易產(chǎn)生耐藥性的抗菌劑[7]。白藜蘆醇(resveratrol,RES)是一種從植物中提取出來(lái)的多酚類抗毒素，具備多種功效，主要包括抗炎、抗生物氧化、抗消化道及呼吸道等多種腫瘤細(xì)胞等[8]。但是這種物質(zhì)生物利用率低，在水中極易溶解，在胃腸道內(nèi)很快被代謝吸收。因此在體內(nèi)應(yīng)用時(shí)效果不佳。利用一種載藥膠束可以解決這個(gè)難題，不僅能提高RES的水溶性能，而且具備良好的抗炎功效[9]。

同軸靜電紡絲技術(shù)是一種新型納米纖維技術(shù)，具備芯-殼結(jié)構(gòu)。它的工作原理是對(duì)聚合物溶液放電，高壓電場(chǎng)力作用于聚合物溶液，溶液受到力的作用克服溶液本身的表面張力，出現(xiàn)高速噴射，接收器用來(lái)接收這種高速噴射的溶液，溶液冷卻后形成納米纖維[10]。根據(jù)同軸靜電紡絲技術(shù)可制備多種類型的支架，在傳遞藥物、促進(jìn)組織再生鄰域廣泛應(yīng)用。因?yàn)檫@種技術(shù)具備多種優(yōu)點(diǎn)，主要包括與細(xì)胞外基質(zhì)具備類似的環(huán)境、負(fù)載容量大、操作簡(jiǎn)易方便、運(yùn)營(yíng)成本低廉、節(jié)能環(huán)保等[11]。因此，本研究原料選取RES及BMP-2，采用同軸靜電紡絲技術(shù)制備載藥膠束-納米纖維膜。并分析這種載藥膠束-納米纖維膜對(duì)牙周炎癥的抑制作用及對(duì)牙槽骨細(xì)胞的修復(fù)效果。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

主要材料：白藜蘆醇(Mocedex公司)，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2,NobedexBiohcedicals公司)，碳酸鈉，甲醛，金黃色葡萄球菌(中科院研究所)，CCK-7試劑盒，甘油，等。

主要儀器：電子天平，恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱，高速離心機(jī)(Thedecema)，冷凍干燥機(jī)，恒溫水浴鍋，掃描電子顯微鏡，傅里葉變換紅外光譜儀，同軸靜電紡絲儀，全功能酶標(biāo)儀器，等。

1.2 同軸靜電紡絲的制作過(guò)程

1.2.1白藜蘆醇膠束的制作

實(shí)驗(yàn)方法為薄膜水化法，主要工藝包括5個(gè)步驟：①稱取材料溶解：用電子天平稱取6 mg的白藜蘆醇及30 mg的碳酸鈉；然后將二者混合均勻，向混合物中加入20 mL的乙醇和10 mL的甲醛，用玻璃棒攪拌均勻，保證溶質(zhì)充分溶解。②蒸發(fā)：使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀加速有機(jī)溶劑的蒸發(fā)。③水化：向溶液中加入20 mL的去離子水；然后均勻攪拌，確保溶液水化完全。④去除雜質(zhì)：在室溫條件下，利用電磁力對(duì)溶液進(jìn)行攪拌，時(shí)間大約3 h，然后用0.13 μm的濾過(guò)膜過(guò)濾液體，去除溶液中的雜質(zhì)。⑤冷凍干燥液體：將溶液放入冷凍室內(nèi)冷凍保存24 h后取出，用干燥器充分干燥溶液，得到了純度高的白藜蘆醇膠束。

1.2.2納米纖維膜的制備

實(shí)驗(yàn)運(yùn)用靜電紡絲裝置制備納米纖維膜，具體如圖1所示。其主要由3部分組成：高壓直流電源、噴射裝置及收集器。工作流程：①超聲分散混合物：用量筒量取20 mL的四氟乙烯(TFE)，放入干燥的錐形瓶中，然后用電子天平稱取3 g多孔納米羥基磷灰石(n-HA)。用玻璃棒攪拌均勻，然后用超聲裝置超聲分散1 h；②充分?jǐn)嚢杌靹蛉芤海河貌ＡО舨粩鄶嚢瑁刂苹旌先芤旱馁|(zhì)量和體積比為固定值12%；③制備共混紡絲液：向混合溶液后加入13 mL體積分?jǐn)?shù)為2%的乙酸溶液，用玻璃棒不斷攪拌，得到實(shí)驗(yàn)所需共混紡絲液；④紡絲制作：嚴(yán)格控制紡絲電壓為-1.8 kV/4 kV，噴射裝置與收集器之間的距離不變(13 cm)，發(fā)射速度為固定值(0.29 mL/h)，可制備出含n-HA的納米纖維膜；⑤交聯(lián)：向納米纖維膜中加入50 mL的EDC/NHS乙醇交聯(lián)液，靜置36 h；⑥清除交聯(lián)劑：用量筒量取100 mL的無(wú)水乙醇溶液，充分洗出納米纖維膜表面的交聯(lián)劑，然后利用真空環(huán)境保證納米纖維膜真空干燥。殼層溶液為明膠溶液，主要包含72%的白藜蘆醇，芯層溶液為2%的BSA溶液，主要成分為BMP-2。將明膠溶液和BSA溶液作為對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)包括4組，A組為空白膜組，B組為RES組，C組為BMP-2組，D組為雙載藥組；具體分組情況如表1所示。

圖1 靜電紡絲裝置Fig.1 Electrostatic spinning device

表1 4組同軸納米纖維膜溶液成分表Tab.1 Components of four groups of coaxial nanofiber membrane solutions

1.2.3同軸納米纖維膜的表征

(1)SEM與EDX。4組同軸納米纖維膜分別固定到置物臺(tái)之上，向膜上均勻噴灑金，時(shí)間72 s，通過(guò)SEM對(duì)膜的表面形貌仔細(xì)觀察。然后，運(yùn)用EDX分析膜表面的微量元素，試驗(yàn)設(shè)置的電壓為3 kV，試驗(yàn)完成后，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理；

(2)FTIR。固定材料選用導(dǎo)電膠，利用FTIR數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)納米纖維膜的官能團(tuán)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；

(3)XRD。運(yùn)用放射電子顯微鏡，將納米纖維膜放置于載玻片上，分析膜的晶體結(jié)構(gòu)；

(4)將4組納米纖維膜分別放置在載物臺(tái)上，分別滴3滴去離子水，等待膜與去離子水混合均勻后，用測(cè)量工具精細(xì)測(cè)量接觸角的尺寸，這個(gè)過(guò)程重復(fù)3次，最后測(cè)量結(jié)果取平均值；

(5)機(jī)械性能監(jiān)測(cè)。選用的測(cè)量工具為游標(biāo)卡尺，將膜均分為12 mm×21 mm×0.3 mm，然后使用專門(mén)的檢測(cè)工具對(duì)膜的機(jī)械性能進(jìn)行監(jiān)測(cè)。實(shí)驗(yàn)中需要固定試劑位置，一般固定工具選用砂紙。檢測(cè)速度一般設(shè)置為1.3 mm/min，繪制應(yīng)力-應(yīng)變曲線最高點(diǎn)值為抗拉強(qiáng)度，彈性模量則為曲線的斜率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

分析軟件選用SPSS26.0，將所有數(shù)據(jù)導(dǎo)入統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件之中，4個(gè)組同軸納米纖維膜之間的組間差異用單因素方差分析方法，當(dāng)“P<0.05”時(shí)，認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 白藜蘆醇溶液靜電納米纖維膜掃描電鏡結(jié)果

4組同軸納米纖維膜溶液制備纖維膜經(jīng)掃描電子顯微鏡觀察，結(jié)果如圖2所示。

從圖2可能看出，A組沒(méi)有形成典型的纖維形態(tài)，產(chǎn)生了大量串珠樣形狀的物質(zhì)；B組形成了少量纖維樣結(jié)構(gòu)物質(zhì)，仍形成了部分串珠樣結(jié)構(gòu)物質(zhì)，但明顯少于A組；C、D組形成的纖維膜可滿足實(shí)驗(yàn)的要求，纖維膜表面光滑，形態(tài)規(guī)則，彼此之間差異較小，均呈現(xiàn)立體三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。制備過(guò)程中D組出現(xiàn)故障，當(dāng)對(duì)D組纖維膜射頻照射時(shí)，膜形成不穩(wěn)定。工作人員通過(guò)增加電場(chǎng)強(qiáng)度，可促進(jìn)膜形成穩(wěn)定，但是當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度增加時(shí)，會(huì)影響細(xì)胞的生理功能，對(duì)細(xì)胞活性造成不可逆性損傷。通過(guò)實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論，D組溶液配比更合理，即72%白藜蘆醇膠束作為殼層溶液，BMP-2作為芯層溶液。處理軟件選用ImageW，可計(jì)算出不同纖維的直徑，并進(jìn)行比較。結(jié)果顯示為伴隨著2%白藜蘆醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)不斷增加，與纖維膜的直徑成正比。由此可繪制直徑分布圖，結(jié)果如圖3～圖5所示。

圖3 B組直徑分布圖Fig.3 Diameter distribution of group B

圖4 C組直徑分布圖Fig.4 Diameter distribution of group C

圖5 D組直徑分布圖Fig.5 Diameter distribution of group D

2.2 同軸納米纖維膜對(duì)炎癥因子的作用

運(yùn)用PCR擴(kuò)增技術(shù)對(duì)炎癥因子進(jìn)行擴(kuò)增，然后檢測(cè)牙周膜細(xì)胞。運(yùn)用LPS為誘導(dǎo)劑，反應(yīng)充足的時(shí)間，4組細(xì)胞因子表達(dá)顯著升高(P<0.05)，主要表現(xiàn)為IL-1、IL-6、MMP-3、MMP-7明顯升高；而C、D組的IL-B、IL-9、MMP-2明顯高于A、B組。

2.3 同軸納米纖維膜對(duì)成骨基因表達(dá)的影響

本實(shí)驗(yàn)采用2種常規(guī)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段：茜素紅實(shí)驗(yàn)和ALP活性檢測(cè)，2種方法均可用來(lái)測(cè)定細(xì)胞骨向分化的過(guò)程。4組同軸納米纖維膜均在同種培養(yǎng)液及實(shí)驗(yàn)環(huán)境下培養(yǎng)，周期為2周。與其他3組結(jié)果相比，D組同軸納米纖維膜經(jīng)茜素紅染色后，通過(guò)顯微鏡觀察可發(fā)現(xiàn)明顯的橘紅色礦化物，這種礦化物呈結(jié)節(jié)狀外觀，表面粗糙不平，結(jié)節(jié)大小不等。

由2名研究員分別記錄4組同軸納米纖維膜在浸提液中培養(yǎng)7、14、28 d的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，4組纖維膜細(xì)胞內(nèi)ALP表達(dá)活性差異較大，研究發(fā)現(xiàn)D組納米纖維膜組測(cè)試結(jié)果與其他3組結(jié)果差異較大，ALP活性較其他3個(gè)組對(duì)照組高(P<0.05)。而且，在D組納米纖維膜經(jīng)浸提液培養(yǎng)14 d時(shí)，ALP活性明顯升高，達(dá)到峰值。由此可以推測(cè)，ICA對(duì)細(xì)胞骨向分化有誘導(dǎo)作用，尤其在培養(yǎng)早期，7～14 d時(shí)效果更明顯。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ICA生物活性良好，促進(jìn)同軸納米纖維膜誘導(dǎo)細(xì)胞成骨過(guò)程，促進(jìn)牙周炎牙槽骨細(xì)胞再生。

3 討論

牙周炎是一種常見(jiàn)的慢性感染性疾病，主要病理過(guò)程是牙周組織的炎癥變化及破壞性改變，牙周炎嚴(yán)重影響患者的口腔健康[12]。然而，目前的研究未發(fā)現(xiàn)牙周炎發(fā)病的具體機(jī)制，主要影響因素為炎癥和感染。口腔內(nèi)存在多種微生物菌群，主要包括牙齦單胞菌、放線桿菌，這2種細(xì)菌可產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，能促發(fā)人體的免疫反應(yīng)機(jī)制[13]。

一種新型多酚類植物，具備抗毒素的特性——白藜蘆醇。這種植物具備多種藥用功效，可協(xié)助機(jī)體抵抗炎癥、抗細(xì)胞氧化、殺滅腫瘤細(xì)胞等[14]。然而，白藜蘆醇生物利用度低，限制了它的使用價(jià)值。它的水溶性低，不易溶于體液之中，而且在胃腸道內(nèi)的代謝率極高。研究發(fā)現(xiàn)，將聚合物膠束作為載體，可攜帶藥物，因此可提高白藜蘆醇的生物利用度，提高白藜蘆醇的藥用價(jià)值。

白藜蘆醇有抑制炎癥發(fā)展的作用，抗炎效果明顯。當(dāng)牙周組織被破壞時(shí)，不僅需要抗炎，還需要促進(jìn)骨組織再生[15]。這個(gè)過(guò)程需要多種生長(zhǎng)因子的調(diào)控，我們的研究發(fā)現(xiàn)BMP-2可誘導(dǎo)骨組織再生，當(dāng)牙周炎牙槽骨缺損時(shí)，局部應(yīng)用BMP-2即可促進(jìn)骨組織骨化發(fā)生，從而減少缺損愈合時(shí)間。

引導(dǎo)組織再生術(shù)(GTR)是一種常見(jiàn)的口腔科手術(shù)方式，牙科醫(yī)師在牙體缺損部位應(yīng)用屏障膜，可促進(jìn)新生組織在手術(shù)區(qū)正常生長(zhǎng)，利于美學(xué)修復(fù)。這種手術(shù)方式與傳統(tǒng)的GTR差異不大，不僅可促進(jìn)牙周周?chē)浗M織的生長(zhǎng)，而且利于硬組織的形成[16]。目前這種手術(shù)方式主要在口腔醫(yī)學(xué)中應(yīng)用，可以促進(jìn)牙周骨的生長(zhǎng)，促進(jìn)種植體更好地完成種植?？墒悄壳芭R床應(yīng)用的生物膜只具備阻斷和隔離異物的作用，不具備誘導(dǎo)骨組織再生的能力，因此使用價(jià)值有限[17]。人為的添加BMP-2，通過(guò)靜電紡絲技術(shù)可制得纖維支架，這種支架可促進(jìn)人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育，進(jìn)而可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化[18]。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用同軸靜電紡絲技術(shù)，殼層選用白藜蘆醇作為載體，芯層選用BMP-2作為載體。這種新型納米纖維膜具備良好的生物相容性，可高度抑制牙周組織周?chē)难装Y因子表達(dá)，同時(shí)對(duì)成骨基因的表達(dá)有促進(jìn)作用[19]。這種新技術(shù)可為牙周炎治療提供依據(jù)，將來(lái)可為口腔頜面部骨缺損美容提供治療新方向。

4 結(jié)語(yǔ)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)術(shù)后3個(gè)月后進(jìn)行隨訪，對(duì)照組中可觀察到大面積的骨缺損，這種現(xiàn)象也存在于空白膜之中；但結(jié)果相對(duì)于對(duì)照組差異不大。因此，可認(rèn)為納米纖維膜可部分阻隔異物，達(dá)到屏障作用，有利于骨組織的修復(fù)過(guò)程。芯層負(fù)載的BMP-2可促進(jìn)納米纖維膜的修復(fù)過(guò)程，縮短修復(fù)時(shí)間。當(dāng)雙載藥的同軸納米纖維膜放置在手術(shù)區(qū)時(shí)，第1步是白藜蘆醇釋放，它可以抑制牙周組織的炎癥反應(yīng)，可形成一種無(wú)菌環(huán)境，利于BMP-2發(fā)揮成骨效應(yīng)；第2步是BMP-2緩慢釋放，二者物質(zhì)聯(lián)合作用牙槽骨，可加強(qiáng)牙槽骨的修復(fù)效果。因此，本研發(fā)的同軸納米纖維具備極大優(yōu)勢(shì)，可作為藥物搭載載體，成為一種良好的牙科手術(shù)方式。