翁 甜，王昱晴，龍超安

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院，園藝植物生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家柑橘保鮮技術(shù)研發(fā)專(zhuān)業(yè)中心，湖北 武漢 430070）

柑橘是全球產(chǎn)量最高的水果之一，因其豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值深受消費(fèi)者的喜愛(ài)。然而，柑橘極易受病原菌的侵害，其中柑橘酸腐病是柑橘采后病害中僅次于綠霉病和青霉病的一大真菌病害，由半知菌亞門(mén)地霉屬真菌酸腐病菌（Geotrichum citri-aurantii）引起[1-2]。該菌通常由果實(shí)傷口侵入，參與細(xì)胞外內(nèi)聚半乳糖醛酸酶的分泌，浸漬果實(shí)組織，同時(shí)會(huì)傳播至臨近的正常果實(shí)，造成果實(shí)間的交叉侵染，引起大面積果實(shí)腐爛，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[3]。

目前，防治柑橘采后真菌病害的有效措施主要是使用化學(xué)合成殺菌劑，例如抑霉唑、噻苯咪唑、嘧霉胺、咪鮮胺等[4]。然而，現(xiàn)階段針對(duì)柑橘酸腐病菌的殺菌劑種類(lèi)極少，且殺菌劑的大量使用會(huì)造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，增強(qiáng)病原菌的抗藥性，同時(shí)殺菌劑帶來(lái)的農(nóng)藥殘留對(duì)人體健康有害[5]。雙弧鹽對(duì)酸腐病菌有明顯的抑制作用，能夠顯著降低柑橘酸腐病的發(fā)生，但長(zhǎng)期使用可能會(huì)影響人類(lèi)健康，在一些國(guó)家和地區(qū)已被禁止使用[6]。因此，尋找安全有效的方法以防治柑橘酸腐病十分必要。

香葉醇又稱(chēng)牻牛兒醇，是一種天然的無(wú)環(huán)類(lèi)異戊二烯單萜，存在于許多不同的植物精油中，例如玫瑰、檸檬草、薰衣草、酸橙等[7-8]。近年來(lái)，大量的研究表明，香葉醇具有多種生物和藥理特性，例如抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗微生物、護(hù)肝、神經(jīng)保護(hù)等[7]。Su Yuwen等[9]研究發(fā)現(xiàn)香葉醇能夠通過(guò)抑制COX-2來(lái)抑制炎癥。El-Bassossy等[10]研究發(fā)現(xiàn)，香葉醇可以通過(guò)抑制氧化應(yīng)激來(lái)發(fā)揮心臟保護(hù)作用。de Oliveira Pereira等[11]研究發(fā)現(xiàn)香葉醇對(duì)紅色毛癬菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜有損傷作用，對(duì)紅色毛癬菌具有抗真菌活性。Singh等[12]研究發(fā)現(xiàn)香葉醇對(duì)白色念珠菌的細(xì)胞膜形成和菌絲形態(tài)發(fā)生具有抑制作用，同時(shí)能夠破壞線粒體功能及鐵的穩(wěn)定性，降低遺傳毒素的毒性。此外，香葉醇還具有抗?jié)?、?qū)蚊、防腐、增甜等作用[13]。多項(xiàng)研究表明，香葉醇是一種純植物化合物，無(wú)副作用，主要通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達(dá)來(lái)發(fā)揮多種活性，現(xiàn)已被美國(guó)食品和藥物管理局批準(zhǔn)作為食品添加劑來(lái)改善飲料、糖果和冰淇淋的風(fēng)味[14]。

關(guān)于香葉醇的抗菌特性研究主要集中在對(duì)細(xì)菌性及人類(lèi)真菌性病害方面，對(duì)植物源真菌的抗性研究較少。本實(shí)驗(yàn)以酸腐病菌為材料，研究香葉醇對(duì)酸腐病菌的抑菌作用，進(jìn)一步探討香葉醇對(duì)酸腐病菌的抑菌機(jī)制，旨在為柑橘酸腐病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

酸腐病菌AY-1菌株由本實(shí)驗(yàn)室分離并保藏，在PDA培養(yǎng)基上活化后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

溫州蜜柑（Citrus unshiu） 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)柑橘園。

香葉醇（純度98%） 上海麥克林生化科技有限公司；鈣熒光白（calcofluor white，CFW）試劑、碘化丙啶（pyridine iodide，PI）試劑 美國(guó)Sigma公司；2,7-二氯熒光素二氫二乙酸酯（2,7-dichlorodihydr of luorescein diacetate，DCFH-DA）試劑盒、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）試劑盒 上海索萊寶生物科技有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1500紫外分光光度計(jì) 翱藝儀器（上海）有限公司；DL-CJ-IMD-II潔凈工作臺(tái) 北京東聯(lián)哈爾冰儀器制造有限公司；Centrifuge高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；Eclipse E100生物顯微鏡、Eclipse 90i正置生物顯微鏡 日本Nikon公司；DDS-307A電導(dǎo)率儀 上海雷磁儀器有限公司；生化培養(yǎng)箱 武漢瑞華儀器設(shè)備有限責(zé)任公司；VICTOR Nivo多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)Perkin Elmer公司；H-7650透射電子顯微鏡 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化

吸取2.5 μL凍存（－80 ℃）于甘油管中的酸腐病菌AY-1菌液接種至馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基上，置于28 ℃培養(yǎng)3～4 d，備用。

1.3.2 孢子懸浮液的配制

取1.3.1節(jié)培養(yǎng)3～4 d的酸腐病菌AY-1，挑取菌絲至1 mL無(wú)菌水中，充分搖勻后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，然后用無(wú)菌水調(diào)整孢子懸浮液濃度分別為1h 105個(gè)/mL和1h 106個(gè)/mL，備用。

1.3.3 香葉醇處理對(duì)酸腐病菌的抑菌活性測(cè)定

參考Yang Shuzhen等[15]的方法測(cè)定香葉醇對(duì)酸腐病菌的抑菌活性。在PDA培養(yǎng)基中加入香葉醇使其終質(zhì)量濃度分別為0.125、0.250、0.500、1.000 g/L，以不添加香葉醇為對(duì)照（CK）組，將PDA培養(yǎng)基倒入直徑為90 mm的培養(yǎng)皿中，待其凝固。取1.3.1節(jié)活化后的酸腐病菌AY-1平板，用打孔器取直徑6 mm酸腐病菌AY-1菌餅，將菌餅置于PDA培養(yǎng)基中央，在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24 h觀察菌落生長(zhǎng)情況并拍照，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，共培養(yǎng)5 d。將48 h內(nèi)完全無(wú)菌絲生長(zhǎng)的質(zhì)量濃度作為最小抑菌質(zhì)量濃度（minimal inhibitory concentration，MIC），96 h內(nèi)完全無(wú)菌絲生長(zhǎng)的質(zhì)量濃度作為最小殺菌質(zhì)量濃度（minimal fungicidal concentration，MFC）[16]。

1.3.4 酸腐病菌孢子萌發(fā)率測(cè)定

參考潘佳亮[17]的方法并稍作改動(dòng)測(cè)定酸腐病菌的孢子萌發(fā)率。取1.3.1節(jié)培養(yǎng)3～4 d的酸腐病菌AY-1，挑取菌絲至馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基（potato dextrose broth，PDB）中，用PDB調(diào)整孢子終濃度為1h 106個(gè)/mL，加入終質(zhì)量濃度0、1/2 MIC、MIC的香葉醇，于搖床中振蕩培養(yǎng)（25 ℃、150 r/min，下同）12 h后置于Eclipse E100生物顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)情況，按式（1）計(jì)算孢子萌發(fā)率。

1.3.5 酸腐病菌菌絲體細(xì)胞壁完整性分析

1.3.5.1 CFW試劑染色

參考Ouyang Qiuli等[18]的方法并稍作改動(dòng)，觀察酸腐病菌菌絲體細(xì)胞壁的完整性。取0.5 mL 1.3.2節(jié)1h 106個(gè)/mL酸腐病菌孢子懸浮于50 mL PDB中，搖床培養(yǎng)2 d，5000 r/min離心20 min收集菌絲體，取1 g菌絲體加入30 mL無(wú)菌水中，加入香葉醇使其終質(zhì)量濃度分別為1/2 MIC、MIC，以不添加香葉醇為對(duì)照組。處理6 h后，取少量菌絲體于2 mL離心管中，加入10 μL CFW試劑處理10 s，再加入等體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% NaOH溶液，于Eclipse 90i正置生物顯微鏡下觀察。

1.3.5.2 AKP活力測(cè)定

參照1.3.5.1節(jié)方法處理0、3、6、9、12 h后收集不同處理組和對(duì)照組的菌絲體，加入提取液，充分研磨，4 ℃、10000 r/min離心10 min，取上清液根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟測(cè)定AKP活力。

1.3.6 酸腐病菌菌絲體細(xì)胞膜完整性分析

1.3.6.1 PI染色

參考Ouyang Qiuli等[19]的方法稍作改動(dòng)觀察酸腐病菌菌絲體細(xì)胞膜的完整性。參照1.3.5.1節(jié)方法處理菌絲體6 h，取少量菌絲體于2 mL離心管中，加入500 μL PI染色液，37 ℃水浴避光染色10 min，用PBS沖洗3 次，去除多余染色液，于Eclipse 90i正置生物顯微鏡下觀察。

1.3.6.2 相對(duì)電導(dǎo)率測(cè)定

參考Wang Wenjun等[20]的方法稍作改動(dòng)測(cè)定酸腐病菌菌絲體的胞外相對(duì)電導(dǎo)率。取0.5 mL 1.3.2節(jié)1h 106個(gè)/mL酸腐病菌孢子懸浮于50 mL PDB中，搖床培養(yǎng)2 d，5000 r/min離心20 min收集菌絲體，稱(chēng)取1 g菌絲于50 mL離心管中，加入30 mL去離子水重懸菌絲，加入香葉醇使其終質(zhì)量濃度分別為1/2 MIC、MIC，以不添加香葉醇為對(duì)照組。用DDS-307A電導(dǎo)率儀測(cè)定0、2、4、6、8、10、12 h酸腐病菌的胞外電導(dǎo)率L/（μS/cm），初始電導(dǎo)率為L(zhǎng)0/（μS/cm），12 h后將其煮沸10 min后冷卻至室溫，再次測(cè)定電導(dǎo)率L’/（μS/cm）。并按式（2）計(jì)算相對(duì)電導(dǎo)率。

1.3.6.3 核酸泄漏水平測(cè)定

參考Wu Yalan等[21]的方法稍作改動(dòng)測(cè)定酸腐病菌菌絲體核酸的泄漏情況。參照1.3.5.1節(jié)方法處理菌絲體0、2、4、6、8、10、12 h后取上清液于12000 r/min離心10 min，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定260 nm波長(zhǎng)處吸光度，以表征菌絲體核酸的泄漏情況。

1.3.7 透射電子顯微鏡觀察

取0.5 mL 1.3.2節(jié)1h 106個(gè)/mL孢子懸浮液于50 mL PDB中，搖床振蕩培養(yǎng)24 h，加入香葉醇使其終質(zhì)量濃度為MIC，以不添加香葉醇為對(duì)照組，繼續(xù)振蕩24 h，收集菌絲并將其加入到體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛溶液中固定，使用透射電子顯微鏡觀察。

1.3.8 酸腐病菌菌絲體丙二醛含量測(cè)定

參照1.3.5.1節(jié)方法處理0、3、6、9、12 h后收集不同處理組和對(duì)照組的菌絲體，根據(jù)MDA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作測(cè)定酸腐病菌菌絲體內(nèi)MDA的含量。

1.3.9 酸腐病菌菌絲體活性氧水平測(cè)定

參照1.3.5.1節(jié)方法處理6 h后收集不同處理組和對(duì)照組的菌絲體，根據(jù)DCFH-DA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)菌絲體胞內(nèi)活性氧水平。

1.3.10 柑橘果實(shí)活體接種效果分析

參考Wang Wenjun等[22]的處理方法，選取體積、質(zhì)量相近且無(wú)明顯機(jī)械損傷的柑橘果實(shí)，先用自來(lái)水沖洗1 次，然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的次氯酸鈉溶液浸泡3 min，最后用蒸餾水沖洗3 次，室溫下于超凈臺(tái)中自然晾干。在每個(gè)果實(shí)赤道附近用接種針刺出3 個(gè)等距離的傷口（直徑約為5 mm，深度約為3 mm）。用無(wú)菌水配制菌藥混合液（含1h 105個(gè)/mL酸腐病菌孢子懸浮液和不同質(zhì)量濃度（MIC、10 MIC、20 MIC）香葉醇）。吸取10 μL菌藥混合液接種于傷口處，待傷口自然吸收，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組（10 μL 1h 105個(gè)/mL酸腐病菌孢子懸浮液）。將接種后的果實(shí)放置于經(jīng)體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液消毒處理的保鮮盒（30 cmh 21 cmh 12 cm）中，果實(shí)底部用無(wú)菌塑料蓋或玻璃小皿支撐，保鮮盒中加入適量無(wú)菌水以控制相對(duì)濕度。將保鮮盒室溫放置7 d，每隔24 h觀察果實(shí)發(fā)病情況，計(jì)算第3、4、5、6、7天的果實(shí)發(fā)病率（病果數(shù)/總果數(shù)×100%）并測(cè)定發(fā)病果實(shí)的病斑直徑。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)平行，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)用Excel 2016軟件和SPSS Statistics 25軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著，采用Excel 2016軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 香葉醇處理對(duì)酸腐病菌抑菌活性的影響

如圖1所示，不同質(zhì)量濃度的香葉醇處理對(duì)酸腐病菌有不同程度的抑制作用，且抑制作用隨處理質(zhì)量濃度的升高而增強(qiáng)。對(duì)照組培養(yǎng)5 d后菌落直徑達(dá)到（74.57f 1.39）mm，而0.125、0.250 g/L香葉醇處理組菌落直徑僅分別為（48.62f 1.47）、（40.66f 2.25）mm，0.500、1.000 g/L香葉醇處理組酸腐病菌未生長(zhǎng)。培養(yǎng)2 d后，0.500 g/L的香葉醇處理即可顯著抑制酸腐病菌的生長(zhǎng)，表明香葉醇抑制酸腐病菌生長(zhǎng)的MIC為0.500 g/L；培養(yǎng)4 d后，0.500 g/L的香葉醇仍能完全抑制酸腐病菌的生長(zhǎng)，表明香葉醇抑制酸腐病菌生長(zhǎng)的MFC為0.500 g/L。

圖1 香葉醇處理對(duì)酸腐病菌菌絲體生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effect of geraniol treatment on mycelia growth in G.citri-aurantii

2.2 香葉醇處理對(duì)酸腐病菌孢子萌發(fā)的影響

如圖2所示，與對(duì)照組相比，不同質(zhì)量濃度的香葉醇處理后酸腐病菌孢子萌發(fā)率顯著降低（P＜0.05）。處理12 h后，對(duì)照組孢子萌發(fā)率達(dá)到（92.17f 1.88）%，而1/2MIC和MIC處理組的孢子萌發(fā)率僅分別為（5.07f 2.03）%和（3.28f 1.28）%，表明香葉醇處理可以顯著抑制酸腐病菌孢子的萌發(fā)。

圖2 香葉醇處理對(duì)孢子萌發(fā)的影響Fig.2 Effect of geraniol treatment on spore germination

2.3 香葉醇處理對(duì)酸腐病菌菌絲體細(xì)胞壁完整性的影響

2.3.1 CFW試劑染色觀察結(jié)果

CFW試劑能夠與真菌細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)結(jié)合產(chǎn)生藍(lán)色熒光，當(dāng)熒光減弱時(shí)，說(shuō)明真菌細(xì)胞壁完整性遭到破壞。如圖3所示，用1/2 MIC和MIC的香葉醇處理菌絲體6 h后，藍(lán)色熒光明顯減弱，而對(duì)照組藍(lán)色熒光明亮，表明經(jīng)香葉醇處理的菌絲體細(xì)胞壁完整性被破壞，細(xì)胞壁中的成分發(fā)生改變。

圖3 香葉醇處理對(duì)酸腐病菌菌絲體細(xì)胞壁的影響Fig.3 Effect of geraniol treatment on mycelial cell wall in G.citri-aurantii

2.3.2 AKP泄漏情況

如圖4所示，不同質(zhì)量濃度的香葉醇處理能夠引起酸腐病菌AKP活力發(fā)生明顯變化。培養(yǎng)3 h后，經(jīng)香葉醇處理后的酸腐病菌AKP活力顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），培養(yǎng)12 h后，對(duì)照組AKP活力仍處在較低水平，1/2 MIC香葉醇處理的AKP活力達(dá)到對(duì)照組的3.27 倍，MIC香葉醇處理的AKP活力達(dá)到對(duì)照組的6.86 倍，均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

圖4 香葉醇處理對(duì)酸腐病菌菌絲體AKP泄漏的影響Fig.4 Effect of geraniol treatment on leakage of AKP in G.citri-aurantii mycelia

2.4 香葉醇處理對(duì)酸腐病菌菌絲體細(xì)胞膜完整性的影響

2.4.1 PI染色觀察結(jié)果

細(xì)胞膜是真菌的基本組織結(jié)構(gòu)，能夠維持真菌正常的生理結(jié)構(gòu)，同時(shí)能夠有效調(diào)節(jié)菌絲體內(nèi)外環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。PI染色液不能穿過(guò)活細(xì)胞膜，而能穿過(guò)破損的細(xì)胞膜與雙鏈DNA結(jié)合產(chǎn)生紅色熒光[23]。如圖5所示，用1/2 MIC和MIC香葉醇處理菌絲體6 h后，通過(guò)熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)菌絲體產(chǎn)生紅色熒光，對(duì)照組無(wú)熒光產(chǎn)生，表明經(jīng)香葉醇處理的菌絲體細(xì)胞膜完整性被破壞。

圖5 香葉醇處理對(duì)菌絲體細(xì)胞膜的影響Fig.5 Effect of geraniol treatment on mycelia cell membrane

2.4.2 相對(duì)電導(dǎo)率變化

如圖6所示，不同質(zhì)量濃度的香葉醇處理后酸腐病菌相對(duì)電導(dǎo)率隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)而呈上升趨勢(shì)。處理2 h后，對(duì)照組與處理組之間存在顯著差異（P＜0.05）。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，不同質(zhì)量濃度香葉醇處理之間均存在顯著差異（P＜0.05），質(zhì)量濃度越高，相對(duì)電導(dǎo)率越高，表明對(duì)酸腐病菌細(xì)胞膜的破壞作用越大。

圖6 香葉醇處理對(duì)酸腐病菌菌絲體相對(duì)電導(dǎo)率的影響Fig.6 Effect of geraniol treatment on relative conductivity in G.citri-aurantii mycelia

2.4.3 核酸泄漏水平

如圖7所示，香葉醇處理會(huì)導(dǎo)致菌絲體核酸的泄漏。在0～12 h內(nèi)，對(duì)照組核酸無(wú)明顯泄漏情況，而經(jīng)香葉醇處理的菌絲體核酸泄漏量明顯上升，始終高于對(duì)照組，表明香葉醇處理破壞了菌絲體的細(xì)胞膜，促進(jìn)了菌絲體內(nèi)核酸的外泄。

圖7 香葉醇處理對(duì)酸腐病菌菌絲體核酸泄漏水平的影響Fig.7 Effect of geraniol treatment on leakage of nucleic acid in G.citri-aurantii mycelia

2.5 香葉醇處理對(duì)酸腐病菌菌絲體微觀結(jié)構(gòu)的影響

如圖8所示，香葉醇處理后酸腐病菌受到嚴(yán)重破壞。對(duì)照組細(xì)胞完整均勻，細(xì)胞壁與細(xì)胞膜緊密相連，可見(jiàn)明顯的細(xì)胞器，處理組菌絲體發(fā)生質(zhì)壁分離，細(xì)胞壁被破壞，且有增厚現(xiàn)象，細(xì)胞膜皺縮，細(xì)胞質(zhì)被降解，細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)空泡化。

圖8 香葉醇處理后酸腐病菌菌絲體透射電子顯微鏡圖Fig.8 TEM of G.citri-aurantii mycelia after geraniol treatment

2.6 香葉醇處理對(duì)酸腐病菌菌絲體丙二醛濃度的影響

MDA是膜脂過(guò)氧化的主要產(chǎn)物，能夠衡量菌絲體的膜脂過(guò)氧化水平。如圖9所示，對(duì)照組MDA濃度在12 h內(nèi)無(wú)明顯變化，與對(duì)照組相比，相同時(shí)間不同質(zhì)量濃度的香葉醇處理組酸腐病菌菌絲體MDA濃度顯著上升（P＜0.05），且香葉醇處理組MDA濃度維持在較高水平。

圖9 香葉醇處理對(duì)酸腐病菌菌絲體MDA濃度的影響Fig.9 Effect of geraniol treatment on malondialdehyde content in G.citri-aurantii mycelia

2.7 香葉醇處理對(duì)酸腐病菌菌絲體活性氧的影響

DCFH-DA本身無(wú)熒光，可以穿透細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞后，可以在細(xì)胞內(nèi)的酯酶作用下水解成2’,7’-二氯二氫熒光素，而2’,7’-二氯二氫熒光素不能穿透細(xì)胞膜，細(xì)胞內(nèi)的活性氧與2’,7’-二氯二氫熒光素反應(yīng)產(chǎn)生具有綠色熒光的2’,7’-二氯熒光素，且綠色熒光強(qiáng)度與活性氧水平成正比[16]。如圖10所示，用1/2 MIC和MIC香葉醇處理酸腐病菌菌絲體6 h后，菌絲體產(chǎn)生綠色熒光，而對(duì)照組無(wú)熒光產(chǎn)生，說(shuō)明經(jīng)處理后菌絲體內(nèi)活性氧水平增加。

圖10 香葉醇處理對(duì)酸腐病菌菌絲體活性氧的影響Fig.10 Effect of geraniol treatment on ROS levels of G.citri-aurantii mycelia

2.8 香葉醇處理對(duì)酸腐病菌侵染果實(shí)發(fā)病情況的影響

將香葉醇與柑橘酸腐病菌孢子懸浮液混合后立即接種于果實(shí)表面，如圖11所示，不同質(zhì)量濃度的香葉醇對(duì)果實(shí)表面酸腐病菌的抑菌效果存在差異。對(duì)照組果實(shí)在第2天開(kāi)始發(fā)病，處理組果實(shí)隨處理濃度的升高，發(fā)病時(shí)間越遲。接種3 d后，對(duì)照組果實(shí)病斑直徑達(dá)14.52 mm，MIC條件下果實(shí)病斑直徑達(dá)13.11 mm，與對(duì)照組之間無(wú)顯著差異（P＞0.05），而10 MIC、20 MIC條件下果實(shí)均未發(fā)病。隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組果實(shí)病斑直徑擴(kuò)展迅速，接種7 d后，對(duì)照組果實(shí)病斑直徑為39.99 mm，發(fā)病率達(dá)72.69%，MIC、10 MIC、20 MIC處理組病斑直徑依次為31.62、28.33、27.84 mm，發(fā)病率依次為45.83%、21.53%、11.11%，均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。說(shuō)明香葉醇處理能夠抑制果實(shí)柑橘酸腐病的發(fā)生。

圖11 香葉醇處理柑橘果實(shí)發(fā)病情況Fig.11 Effect of geraniol treatment on incidence of sour rot in citrus fruit

3 討論

本實(shí)驗(yàn)主要研究了香葉醇對(duì)酸腐病菌的抑菌機(jī)制。抑菌活性測(cè)定表明香葉醇對(duì)酸腐病菌具有明顯的抑制作用。香葉醇在質(zhì)量濃度為0.125～1.000 g/L之間對(duì)酸腐病菌具有不同程度的抑制作用，MIC為0.500 g/L，此時(shí)酸腐病菌孢子萌發(fā)率僅為（3.28f 1.28）%，基本抑制了酸腐病菌孢子的萌發(fā)。這與其他天然植物提取物的抑菌作用相似，例如檸檬醛和辛醛對(duì)酸腐病菌的MIC為0.50 μL/mL[24]，黑香菜油和茴香油在400 μL/L和600 μL/L時(shí)能夠完全抑制李子灰霉病菌的生長(zhǎng)，從而有效控制灰霉病對(duì)李子果實(shí)的感染[25]。

細(xì)胞壁是真菌抵抗外源物質(zhì)入侵的第一道屏障，細(xì)胞壁的完整性對(duì)維持真菌細(xì)胞的正常生命活動(dòng)至關(guān)重要，真菌細(xì)胞壁主要由幾丁質(zhì)、纖維素、葡聚糖和脫乙酰殼聚糖組成[26]。真菌細(xì)胞壁的破壞可以通過(guò)觀察幾丁質(zhì)的變化來(lái)驗(yàn)證，幾丁質(zhì)可以與CFW結(jié)合產(chǎn)生藍(lán)色熒光[27]，當(dāng)細(xì)胞壁被破壞，幾丁質(zhì)含量降低，CFW無(wú)法與幾丁質(zhì)結(jié)合，藍(lán)色熒光將減弱。本研究中，經(jīng)1/2 MIC和MIC香葉醇處理的酸腐病菌菌絲體藍(lán)色熒光強(qiáng)度減弱，表明處理后的酸腐病菌菌絲體細(xì)胞壁完整性被破壞。這與鹽酸小檗堿對(duì)指狀青霉細(xì)胞壁的作用一致[28]。AKP存在于細(xì)胞壁與細(xì)胞膜之間，本研究進(jìn)一步測(cè)定了AKP的泄漏情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組的酸腐病菌AKP泄漏量較低，12 h后胞外AKP活力僅為0.03 U/g，1/2 MIC和MIC香葉醇處理12 h后胞外AKP活力分別達(dá)到0.10 U/g和0.22 U/g，顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），且隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)，胞外AKP活力不斷升高，這與毛霉對(duì)指狀青霉和酸腐病菌的作用結(jié)果[29]相一致。

細(xì)胞膜是真菌組織結(jié)構(gòu)的一部分，能夠維持真菌正常的生理結(jié)構(gòu)，是細(xì)胞與外界環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換和信息傳遞的重要通道，能夠有效調(diào)節(jié)內(nèi)外環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，保障真菌的正常生命活動(dòng)[30]，同時(shí)，細(xì)胞膜是抗真菌劑藥物開(kāi)發(fā)的重要作用靶點(diǎn)[31]。已有研究表明，許多抗菌物質(zhì)均能夠通過(guò)改變真菌細(xì)胞膜的通透性來(lái)破壞真菌內(nèi)外環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，從而起到抑菌作用，例如苦參堿[16]、百里酚、水楊酸[32]以及碳酸銨[33]等，與本研究結(jié)果相同。經(jīng)香葉醇處理后，細(xì)胞膜被破壞，菌絲體胞外相對(duì)電導(dǎo)率顯著上升（P＜0.05），細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)，菌絲體細(xì)胞內(nèi)核酸發(fā)生外泄，且隨著處理質(zhì)量濃度的升高和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，核酸外泄增多，PI染色結(jié)果也證實(shí)了香葉醇對(duì)酸腐病菌細(xì)胞膜的破壞作用，這與El-Bassossy[10]以及Bound[34]等的研究結(jié)果相同，香葉醇通過(guò)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的泄漏來(lái)破壞細(xì)胞膜，以治療紅色毛癬菌的感染，萜類(lèi)物質(zhì)香芹酚及其2,3-不飽和1-O-葡萄糖苷對(duì)白念珠菌細(xì)胞有裂解作用，能夠破壞細(xì)胞膜的完整性。進(jìn)一步通過(guò)透射電子顯微鏡觀察也發(fā)現(xiàn)，香葉醇對(duì)酸腐病菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜以及細(xì)胞器均有破壞作用。

細(xì)胞膜的主要成分是脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，脂質(zhì)中含有不飽和雙鍵，易發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)[35]，MDA是膜脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的重要產(chǎn)物之一，其對(duì)生物膜具有損傷作用[36]?；钚匝跏巧矬w內(nèi)氧化代謝的產(chǎn)物，在調(diào)節(jié)生物體的各種生理功能中具有重要作用，但過(guò)高的活性氧水平會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生傷害，造成細(xì)胞死亡[37]。已有研究表明，經(jīng)碳酸氫鉀處理后灰霉菌體內(nèi)活性氧積累，對(duì)灰霉菌產(chǎn)生抑制作用[38]。Yang等[39]研究發(fā)現(xiàn)戊二醛處理誘導(dǎo)酸腐病菌細(xì)胞內(nèi)積累大量活性氧，且MDA含量顯著高于對(duì)照組，表明菌絲體發(fā)生了脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。這與本研究的結(jié)果相似，經(jīng)1/2 MIC和MIC香葉醇處理后，酸腐病菌菌絲體內(nèi)MDA含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），同時(shí)通過(guò)熒光顯微鏡可以觀察到明顯的綠色熒光，菌絲體內(nèi)活性氧發(fā)生積累，表明香葉醇處理后菌絲體發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，香葉醇處理能夠有效抑制酸腐病菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)，0.500 g/L的香葉醇可有效抑制酸腐病菌菌絲的生長(zhǎng)，孢子萌發(fā)率僅為（3.28f 1.28）%，能夠破壞菌絲體的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，增加細(xì)胞的通透性，同時(shí)造成活性氧積累，使菌絲體發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，導(dǎo)致菌絲體內(nèi)外環(huán)境失衡，影響菌絲體的正常生命活動(dòng)。香葉醇能夠顯著減少柑橘果實(shí)酸腐病的發(fā)生，降低果實(shí)的發(fā)病率及病斑直徑，本實(shí)驗(yàn)可為柑橘采后酸腐病的防治提供理論依據(jù)。