王士博 ， 劉金娟

江蘇師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 徐州 221116

香蕉（Musa sapientum）是熱帶地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)作物，內(nèi)部果肉為主要的食用部位。2020年，世界香蕉總產(chǎn)量為119.83×109kg，我國香蕉總產(chǎn)量為11.87×109kg，并且呈逐年上升趨勢，我國已成為世界第二大香蕉生產(chǎn)國［1］。香蕉皮大約占果實(shí)重量的30%左右，大量香蕉皮的廢棄不僅造成資源浪費(fèi)，還會(huì)引起環(huán)境污染。研究表明，香蕉皮中含有豐富的淀粉、粗蛋白、粗脂肪和糖類、維生素、多酚類等物質(zhì)［2］，具有抗高血壓、抗癌、抗菌、抗氧化等活性［3-4］。香蕉皮中總黃酮對(duì)羥自由基、ABTS+自由基均有一定的清除能力及Fe3+還原能力［5］。Rebello等［6］發(fā)現(xiàn)香蕉皮粉因其總酚含量高而具有高抗氧化性。Akamine等［7］發(fā)現(xiàn)香蕉皮甲醇提取物對(duì)睪酮治療小鼠前列腺增生有抑制作用。Fu等［8］從香蕉皮提取物中分離得到的新化合物XJP-1能抑制ox-LDL誘導(dǎo)的單核細(xì)胞內(nèi)皮粘附。熊燕飛等［9］發(fā)現(xiàn)香蕉皮粗多糖可明顯抑制體內(nèi)實(shí)體瘤生長，體外對(duì)Hela細(xì)胞和前列腺癌PC-3M細(xì)胞有明顯的誘導(dǎo)凋亡作用，且隨時(shí)間的延長，凋亡率增加。目前，國內(nèi)對(duì)于香蕉皮的研究主要集中于多糖、多酚等物質(zhì)的提取方法和工藝，對(duì)其功能及深加工方面的研究相對(duì)不足。關(guān)于香蕉皮提取物在抗癌和抗氧化活性方面的研究少有系統(tǒng)報(bào)道。充分發(fā)揮香蕉皮的資源優(yōu)勢，對(duì)其進(jìn)行高值化開發(fā)利用，不僅可以減少對(duì)環(huán)境的污染，同時(shí)也能產(chǎn)生極大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)效益。因此，本文初步測定了香蕉皮提取物（banana peel extraction，BPE）中總黃酮和總多酚的含量，探究了BPE對(duì)DPPH和O2-自由基的清除能力以及對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用，以期為進(jìn)一步綜合利用香蕉皮提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑

香蕉購自本地大型超市，正常成熟度，表面洗凈晾干水分，取皮后用家用榨汁機(jī)取汁，12 000 r·min-1，4 ℃離心取上清，過濾除菌后-80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

Alamar Blue購自美國Sigma公司；Caspase-9、Caspase-3抗體購自美國Santa cruz公司；Bad、Bid、Bak、Apaf-1、Bax、Bcl-X、Bcl-2、p53和GAPDH抗體購自美國Bioworld公司；細(xì)胞裂解液、Caspase-9和Caspase-3活性檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；PARP抗體和Caspase-3抑制劑Ac-DEVDCHO購自碧云天生物技術(shù)研究所；Caspase-9抑制劑Z-LEHD-FMK購自Biovision公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 供試細(xì)胞株

人肝癌細(xì)胞HepG2購于上海中科院細(xì)胞庫，由本實(shí)驗(yàn)室復(fù)蘇、傳代、培養(yǎng)。

1.3 儀器與設(shè)備

IBE2000顯微鏡購自COIC公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自Thermo公司；微孔板檢測儀購自Bio-Teck公司；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板購自美國NEST公司；熒光顯微鏡購自德國Leica公司。

1.4 方法

1.4.1總多酚和總黃酮含量的測定 采用福林酚法和硝酸鋁比色法分別檢測總酚和黃酮含量［10］。提取物中總酚和總黃酮的含量以每升BEP中沒食子酸和蘆丁當(dāng)量表示。制作沒食子酸（0～200 μg·mL-1）標(biāo)準(zhǔn)曲線，按公式（1）計(jì)算BPE中總酚的含量：

其中y為吸收值；x為沒食子酸濃度。

制作蘆?。?～64 μg·mL-1）標(biāo)準(zhǔn)曲線，按公式（2）計(jì)算BPE中總黃酮的含量：

其中y為吸收值；x為蘆丁的濃度。

1.4.2DPPH自由基清除測定 參照鐘丘實(shí)等［11］測定方法，本研究使用的BPE為原液。

1.4.3超氧陰離子自由基清除測定 采用鄰苯三酚自氧化法，參照佀鳳為等［12］的方法，使用BPE原液進(jìn)行測定。

1.4.4細(xì)胞培養(yǎng)與體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn) 采用Alamar Blue法檢測BPE體外抗腫瘤活性，具體實(shí)驗(yàn)方法參照Liu等［13］的方法。

1.4.5Hoechst 33258染色 取形態(tài)均勻狀態(tài)良好的HepG2細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，加入BPE培養(yǎng)48 h后，用倒置相差顯微鏡觀察形態(tài)并拍照；細(xì)胞收集后，加入Hoechst33258染液（終濃度5 μg·mL-1），染色10 min，熒光顯微鏡下拍照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.6流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 實(shí)驗(yàn)步驟參照Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書。

1.4.7活性氧檢測 按照試劑盒的說明書進(jìn)行操作，10 μmol·L-1DCFH-DA染液37℃孵育20 min。激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm，熒光顯微鏡觀察。

1.4.8Western blot實(shí)驗(yàn) BPE處理HepG2細(xì)胞48 h后提取蛋白，SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，封閉后加入一抗過夜，二抗37 ℃孵育2 h，化學(xué)發(fā)光顯色拍照。

1.4.9Caspase酶活性的檢測 按照酶活性檢測試劑盒說明書進(jìn)行Caspase酶活性測定。

1.4.10抑制劑對(duì)BPE抗腫瘤活性的影響 HepG2細(xì)胞接種96孔板，貼壁后加入10 μmol·L-1Z-LEHD-FMK或20 μmol·L-1Ac-DEVD-CHO，孵育2 h后加入BPE繼續(xù)培養(yǎng)48 h，檢測細(xì)胞活性。

1.4.11數(shù)據(jù)分析 每個(gè)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因子方差分析，P＜0.05表示統(tǒng)計(jì)學(xué)上有差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 BPE中總黃酮和總多酚含量

使用福林酚法檢測BPE中總酚含量，結(jié)果為39.23±2.35 mg·L-1；采用硝酸鋁比色法檢測總黃酮量，結(jié)果為26.53±1.97 mg·L-1。

2.2 BPE自由基清除能力

通過研究BPE對(duì)DPPH·和O2-·的清除率評(píng)估其抗氧化活性，結(jié)果顯示BPE對(duì)DPPH和O2-自由基的清除率分別為65.31%±3.82%和51.29%±4.23%。

2.3 BPE對(duì)HepG2細(xì)胞增殖活性的影響

不同濃度（0～100 mL·L-1）BPE處理HepG2細(xì)胞48 h后，Alamar Blue檢測結(jié)果顯示（圖1），與對(duì)照組相比，隨著BPE濃度的增加，HepG2細(xì)胞的活性逐漸降低，說明BPE對(duì)HepG2細(xì)胞增殖活性的抑制具有一定濃度依賴性。當(dāng)BPE處理濃度為80 mL·L-1和100 mL·L-1時(shí)，HepG2細(xì)胞的活性分別為24%±4.37%和0.73%±0.06%，經(jīng)計(jì)算得到IC50為54.32±2.51 mL·L-1。IC50作為進(jìn)一步研究BPE抑制HepG2細(xì)胞增殖分子機(jī)制的濃度選擇。

2.4 BPE對(duì)HepG2細(xì)胞形態(tài)的影響

倒置顯微鏡下觀察顯示（圖2），與對(duì)照組相比，BPE（IC50）處理組HepG2細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)不規(guī)則，發(fā)生皺縮且有少量細(xì)胞漂浮。熒光顯微鏡觀察顯示，經(jīng)hoechst33258染色后，對(duì)照組細(xì)胞呈現(xiàn)均勻的藍(lán)色熒光，BPE處理的細(xì)胞顯示染色質(zhì)聚集和明亮的熒光，該結(jié)果提示BPE可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡。

圖 1 BPE對(duì)HepG2細(xì)胞活力的影響Fig. 1 The effect of BPE on cell viability of HepG2 cells

圖2 BPE對(duì)HepG2細(xì)胞形態(tài)的影響 (40×)Fig. 2 Mophology of HepG2 cells treated with BPE (40×)

2.5 BPE對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響

為進(jìn)一步驗(yàn)證hoechst33258染色的結(jié)果，流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，BPE處理組細(xì)胞凋亡率為22.21%±2.36%（P＜0.05，與對(duì)照組相比）（圖3），說明BPE確實(shí)可引起細(xì)胞的凋亡而發(fā)揮抗腫瘤活性。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測BPE對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響Fig. 3 Effect of BPE on cell apoptosis of HepG2 by flow cytometry

2.6 BPE對(duì)HepG2細(xì)胞中ROS水平的影響

研究表明，ROS在體內(nèi)的大量堆積會(huì)引起細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，導(dǎo)致細(xì)胞膜發(fā)生過氧化，增加膜通透性，降低細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性，損傷蛋白質(zhì)和DNA等物質(zhì)，最終誘導(dǎo)細(xì)胞加速凋亡［14］。如圖4所示，與對(duì)照組相比，BPE處理組中綠色熒光信號(hào)明顯增強(qiáng)，這說明BPE能夠明顯提高HepG2細(xì)胞的ROS水平。

圖4 BPE對(duì)HepG2細(xì)胞中ROS水平的影響Fig. 4 Effect of BPE on the ROS level in HepG2 cells

2.7 BPE對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)凋亡蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示（圖5），與對(duì)照組相比，BPE處理組中促凋亡蛋白Bax、Bid、Bak、p53的表達(dá)水平提高，而抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl的表達(dá)水平降低。PARP、Apaf-1、Caspase-3和Caspase-9在處理組中的表達(dá)水平也明顯升高。有研究表明，Caspase-9的激活、Bax、Bad和Bak的線粒體易位、MMP的去極化與隨后細(xì)胞色素c的釋放密切相關(guān)，后者與Apaf-1、ATP和Caspase-9結(jié)合，產(chǎn)生凋亡小體激活的Caspase-3，隨后PARP裂解，一旦特異性底物PARP被切斷，就會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［15］。

圖5 BPE處理48 h后對(duì)HepG2細(xì)胞中凋亡相關(guān)因子蛋白表達(dá)的影響Fig. 5 The expression of apoptosis-related factors in HepG2 cells treated with BPE for 48 h

2.8 BPE對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)Caspase-3、Caspase-9酶活性的影響

為了進(jìn)一步證實(shí)Caspase被激活，酶活性試劑盒檢測結(jié)果表明（圖6），BPE能夠顯著增加HepG2細(xì)胞中Caspase-3和Caspase-9的活性，進(jìn)一步驗(yàn)證了Western blot的結(jié)果。

圖6 BPE對(duì)HepG2細(xì)胞中Caspase活性的影響Fig. 6 Effect of BPE on Caspase enzyme activity in HepG2 cells

2.9 Caspase抑制劑對(duì)BPE促凋亡的影響

本研究利用Caspase-9和Caspase-3抑制劑（ZLEHD-FMK和Ac-DEVD-CHO）來評(píng)估Caspase-9和Caspase-3在BPE誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的作用。結(jié)果如圖7所示，采用Z-LEHD-FMK和Ac-DEVD-CHO預(yù)培養(yǎng)在一定程度上可顯著逆轉(zhuǎn)mActD對(duì)HepG2細(xì)胞的促凋亡作用，進(jìn)一步證實(shí)BPE通過線粒體介導(dǎo)的內(nèi)在凋亡途徑誘導(dǎo)了HepG2細(xì)胞凋亡。

圖7 抑制劑對(duì)BPE促HepG2細(xì)胞凋亡的影響Fig. 7 Effect of inhibitor on the proliferation of BPE in HepG2 cells

3 討論

近年來，研究發(fā)現(xiàn)多酚和黃酮廣泛存在于各種植物果皮中，具有較強(qiáng)的清除自由基和抗氧化活性，有助于延緩衰老、預(yù)防癌癥及抗炎癥等［15］。不同植物果皮中酚類和黃酮類的生物學(xué)活性受結(jié)構(gòu)和種類的影響，會(huì)顯示出不同的抗氧化活性［16-17］。鱷梨果皮中含有大量的多酚和黃酮類等物質(zhì)，對(duì)DPPH自由基具有明顯的清除能力［18］。利用超聲輔助法提取香蕉皮中的多酚，發(fā)現(xiàn)對(duì)花生油有較強(qiáng)的抗氧化效果［19］。采用有機(jī)溶劑浸提法提取香蕉皮中的總黃酮，在一定范圍內(nèi)對(duì)羥基自由基的清除率優(yōu)于同條件的維生素C［20］。本研究結(jié)果與上述文獻(xiàn)的結(jié)果一致，證明香蕉皮提取物中具有一定量的總多酚和總黃酮，進(jìn)一步的自由基清除實(shí)驗(yàn)證實(shí)了BPE的體外抗氧化清除能力，這為香蕉皮抗氧化產(chǎn)品的開發(fā)提供了重要的數(shù)據(jù)支撐。

研究發(fā)現(xiàn)，果皮提取物在癌癥治療和預(yù)防方面具有明顯的作用［21］。例如，柑橘皮中的黃酮在預(yù)防癌癥發(fā)生中發(fā)揮功能［22］；石榴皮提取物具有明顯的抗氧化活性以及對(duì)leukemia細(xì)胞的抗腫瘤和誘導(dǎo)凋亡活性［23］；富含多酚的山楂果皮提取物可誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞的凋亡［24］。與先前研究報(bào)道相一致，本研究在體外抗肝癌實(shí)驗(yàn)中，香蕉皮提取物可有效地抑制人肝癌HepG2細(xì)胞的增殖活性，并且通過線粒體介導(dǎo)的信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗肝癌細(xì)胞作用。但研究僅在體外探究了香蕉皮提取物作用于HepG2細(xì)胞的作用效果，未結(jié)合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，因此，后續(xù)將對(duì)香蕉提取物作用動(dòng)物的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究，以及在其他類型的腫瘤中探究其抗腫瘤活性。

綜上所述，香蕉皮提取物具有一定清除自由基的能力以及通過線粒體介導(dǎo)的信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗肝癌作用，研究結(jié)果可為香蕉皮提取物用于抗氧化產(chǎn)品開發(fā)及肝癌預(yù)防提供了數(shù)據(jù)支持。