徐詩琪，周倩雯，扶雄，黃強(qiáng)，張斌

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）

人類腸道菌群是一種相當(dāng)復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，約由1013~1014種菌群所構(gòu)成，維持機(jī)體代謝平衡[1]。腸道菌群的形成受宿主和環(huán)境因素共同影響，涉及生活環(huán)境、食物、用藥習(xí)慣等，而飲食結(jié)構(gòu)是其中最重要的因素之一[2]。腸道菌群與人類是互利共生的關(guān)系：人類為微生物群落提供營養(yǎng)和保護(hù)，同時(shí)微生物群落也對(duì)人類免疫、神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)起到了一定的效果，幫助調(diào)節(jié)腸道健康[3]。腸道菌群參與生理調(diào)節(jié)的過程，普遍是基于酵解所產(chǎn)生的有益代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸（Short Chain Fatty Acids，SCFAs）來實(shí)現(xiàn)的。SCFAs通過激活活性物質(zhì)和神經(jīng)系統(tǒng)間接影響外部組織和器官，從而在調(diào)節(jié)宿主代謝、免疫和細(xì)胞增殖等功能發(fā)揮重要作用[4]。

抗性淀粉（Resistant Starch，RS）是指淀粉和部分淀粉制品在通過胃腸道時(shí)，120 min內(nèi)α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶的消化產(chǎn)生抵抗的部分，但可在大腸中作為底物被結(jié)腸菌群完全或部分發(fā)酵[5]。目前，RS根據(jù)來源和抗性機(jī)理的不同，主要分物理包埋淀粉（Type 1 Resistant Starch，RS1）、天然抗性淀粉（Type 2 Resistant Starch，RS2）、老化淀粉（Type 3 Resistant Starch，RS3）、化學(xué)改性淀粉（Type 4 Resistant Starch，RS4）和淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物（Type 5 Resistant Starch，RS5）等五類，其中RS5是一種新型抗性淀粉，它是由直鏈淀粉與脂質(zhì)等配體復(fù)合而成的單螺旋結(jié)構(gòu)，具有良好的熱穩(wěn)定性和抗酶解性等特點(diǎn)[6]?？剐缘矸蹖?duì)結(jié)腸具有重要作用，能夠降低腸道內(nèi)pH值，促進(jìn)益生菌增長，產(chǎn)生高濃度的SCFAs以及降低腸道性疾病的發(fā)生等生理功能[7]。淀粉和脂質(zhì)都是人體重要的能量來源和營養(yǎng)物質(zhì)，它們?cè)谌梭w內(nèi)具有特定的生理功能，而當(dāng)?shù)矸酆椭|(zhì)形成穩(wěn)定的單螺旋結(jié)構(gòu)后將擁有熱穩(wěn)定性、抗消化性等功能特性和控制肥胖、調(diào)節(jié)血糖、調(diào)控腸道菌群等營養(yǎng)特性[8-10]。例如，Annor等[11]通過測定血糖生成指數(shù)，發(fā)現(xiàn)小米淀粉與棕櫚酸、油酸和亞油酸形成的復(fù)合物血糖生成指數(shù)顯著低于小米淀粉。目前，已有大量研究報(bào)道了淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物的形成機(jī)理、結(jié)構(gòu)和功能特性（如糊化、粘彈性和消化）[9,12,13]，但研究多局限于 RS5的制備方法、加工特性等問題。鑒于淀粉和脂肪的種類豐富、結(jié)構(gòu)多樣化，而不飽和脂肪酸被認(rèn)為具有重要的營養(yǎng)價(jià)值，對(duì)于維持人類健康、預(yù)防脂質(zhì)相關(guān)疾病和發(fā)育至關(guān)重要，因此將不飽和脂肪酸與淀粉進(jìn)行復(fù)合后能否產(chǎn)生更多協(xié)同效應(yīng)，將是值得探討的關(guān)注點(diǎn)。另一方面，不飽和脂肪酸的復(fù)合物的體外發(fā)酵特性以及微生物結(jié)構(gòu)的變化等方面的研究仍未夠深入，特別是不同特定結(jié)構(gòu)的RS5之間發(fā)酵特性的比較。

本文選用高直鏈玉米淀粉和飲食中各種常見的脂肪酸即硬脂酸、油酸、亞油酸和亞麻酸作為原料，采用堿液分散法得到不同飽和度的淀粉-脂肪酸復(fù)合物。采用X射線衍射（X-Ray Diffraction，XRD）、差示掃描量熱儀（Differential Scanning Calorimeter，DSC）等表征手段和測定樣本的復(fù)合率和含量對(duì)樣品結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析。利用體外大腸發(fā)酵實(shí)驗(yàn)和16S rRNA基因測序，揭示樣品的發(fā)酵特性和菌群結(jié)構(gòu)變化。本文旨在明確RS5的發(fā)酵特性與微生物反應(yīng)同復(fù)合物的脂肪酸飽和度之間的關(guān)系，為針對(duì)性開發(fā)益生元產(chǎn)品和以淀粉為基礎(chǔ)的功能性食品配料提供了新的可能。

1 材料與方法

1.1 材料

高直鏈玉米淀粉（HylonⅤ），美國Ingredion公司；低聚果糖，美國Ingredion公司；亞油酸、亞麻酸、豬胰α淀粉酶（EC號(hào)：232-468-9；活性：8×USP/mg）、淀粉轉(zhuǎn)葡萄糖苷酶（EC號(hào)：3.2.1.3（BRENDA，IUBMB）；活性：≥260 units/mL），美國Sigma-Aldrich公司；硬脂酸，阿拉丁化學(xué)試劑公司；油酸，阿拉丁化學(xué)試劑公司；其他試劑或藥品均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

HYQX-Ⅱ型厭氧箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械公司；MR-Hei-Tec型加熱型磁力攪拌器，德國Heidoiph公司；LDZH-100KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械公司；DL-5-B型離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器公司；FE20型數(shù)顯pH計(jì)，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；DSC3型差示掃描量熱儀，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；D/Max-1200型X-射線衍射分析儀，日本Rigaku公司；DYY-6C型電泳儀，北京六儀公司；2720型PCR擴(kuò)增儀，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；E6090型TBS-380熒光計(jì)，北京原平皓生物技術(shù)有限公司；NanoDrop-ND-1000分光光度計(jì)，美國賽默飛公司；2100生物分析儀，美國安捷倫公司；Illumina PE250型NovaSeq高通量測序儀，美國Illumina公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 淀粉-不飽和脂肪酸復(fù)合物制備

本文制備淀粉-不飽和脂肪酸復(fù)合物的方法參考Karkalas等[14]方法進(jìn)行修改。將6 g高直鏈淀粉玉米淀粉溶于400 mL 0.1 mol/L的KOH溶液，在300 r/min下恒定攪拌至充分溶解，然后將溫度快速升高到90 ℃保持1 h得到糊化淀粉。同樣，將0.6 g脂肪酸溶解于600 mL 0.1 mol/L的KOH溶液，在90 ℃加熱并持續(xù)攪拌至完全溶解。在 90 ℃下將脂肪酸與淀粉溶液混合均勻并充分?jǐn)嚢?0 min，用2.0 mol/L的HCl溶液將混合溶液的pH值調(diào)至4.6~4.7，維持90 ℃繼續(xù)加熱1 h，冷卻至室溫，在3 000 r/min下離心15 min得到的沉淀即為淀粉-不飽和脂肪酸復(fù)合物。將所得的沉淀物冷凍干燥48 h得到樣品，粉碎過篩，置于冰箱中密封保存。對(duì)照組除了不加脂肪酸外，其余處理步驟一致。樣品分別命名為HAMS，高直鏈玉米淀粉；GS，糊化淀粉；GS-SA，淀粉-硬脂酸復(fù)合物；GS-OA，淀粉-油酸復(fù)合物；GS-LA，淀粉-亞油酸復(fù)合物；GS-ALA，淀粉-亞麻酸復(fù)合物；SA，硬脂酸；OA，油酸；LA，亞油酸；ALA，亞麻酸。

1.3.2 X-射線衍射測定

將待測樣品平衡水分，隨后平鋪于樣品池中過夜，然后放入XRD儀的樣品臺(tái)中進(jìn)行測試。測試條件為波長0.154 0 nm、測試管電壓40 kV、電流30 mA。掃描的區(qū)域?yàn)?4~30 °2θ、掃描速度 2 °/min。通過對(duì)比圖譜，確定淀粉顆粒結(jié)晶性質(zhì)。相對(duì)結(jié)晶度計(jì)算方法參照Nara等[15]提出的方法計(jì)算，通過Jade軟件對(duì)結(jié)晶區(qū)域和總面積部分分別進(jìn)行積分計(jì)算，所得比值即為相對(duì)結(jié)晶度（Relative Crystallinity，RC）。

式中：

Ac——結(jié)晶區(qū)域面積；

Aa——非結(jié)晶區(qū)域面積。

1.3.3 熱力學(xué)性質(zhì)測定

準(zhǔn)確稱取3 mg淀粉干基與去離子水均勻混合成水分含量為70%的混合物，密封高壓盤，在室溫下平衡過夜后，用DSC檢測樣品，掃描溫度為30~140 ℃，掃描速率為10 ℃/min[16]。用STARe軟件分別計(jì)算熱力學(xué)曲線中的起始溫度（To）、峰值溫度（Tp）、終止溫度（Tc）和焓值（ΔH）。

1.3.4 復(fù)合指數(shù)測定

采用Jia等[17]的方法測定樣品的復(fù)合指數(shù)，用CI值表示淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物的形成程度。準(zhǔn)確稱取淀粉干基300 mg，懸浮于5 mL去離子水中，在沸水浴中加熱攪拌30 min，冷卻至室溫，在2 000 r/min下離心8 min，取50 μL上清液與2 ml含有m=1.3% I2和m=2%KI的碘溶液進(jìn)行混合。用紫外-可見分光光度計(jì)在690 nm處測定配合物和對(duì)照物的吸光度并用下式計(jì)算：

式中：

ABSreference——原淀粉吸光值；

ABSsample——樣品吸光值。

1.3.5 抗性淀粉含量測定

抗性淀粉含量測定參照Xie等[18]的體外模擬小腸消化方法。準(zhǔn)確稱取0.6 g淀粉樣品干基于50 mL離心管中，分別加入20 mL 0.1 mol/L的醋酸鈉緩沖液和磁子，渦旋混勻后置于37 ℃磁力攪拌水浴鍋中震蕩。加入5 mL豬胰酶和淀粉葡萄糖苷酶的混合酶解液后開始計(jì)時(shí)。在反應(yīng)2 h后，從每個(gè)試管中各取0.25 mL上清液與10 mLφ=66%的乙醇混合停止酶解反應(yīng)。于4 300 r/min下離心5 min，取0.1 mL上清液與3 mL的GOPOD混合均勻，測定510 nm處吸光值，具體計(jì)算方法如下：

式中：

RS——抗性淀粉含量，%；

G120——酶水解2 h后產(chǎn)生的葡萄糖含量，%；

TG——樣品總葡萄糖含量，%。

1.3.6 體外大腸發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

體外大腸發(fā)酵實(shí)驗(yàn)參考相關(guān)文獻(xiàn)[18-20]。制備微量元素溶液和碳酸-磷酸緩沖液，并在使用前滅菌。將0.25 g/L的半胱氨酸酸加入到碳酸-磷酸緩沖液中，通入CO2氣流去除氧氣。準(zhǔn)確稱取每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的發(fā)酵樣品50 mg于厭氧瓶中，然后將各厭氧瓶和碳酸-磷酸緩沖液轉(zhuǎn)移到厭氧培養(yǎng)箱中過夜。實(shí)驗(yàn)以低聚果糖（Fructooligosaccharide，F(xiàn)OS）作為陽性對(duì)照，以HAMS、GS和SA、OA、LA、ALA作為陰性對(duì)照。

體外發(fā)酵實(shí)驗(yàn)已獲得廣州市第一人民醫(yī)院（華南理工大學(xué)第二附屬醫(yī)院）倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)為K-2021-085-01），征得3名志愿者的知情同意。于發(fā)酵試驗(yàn)當(dāng)天收集糞便到無菌離心管中，并立即轉(zhuǎn)移至厭氧培養(yǎng)箱中備用。志愿者必須滿足以下條件：（1）年齡在20~25歲，BMI值處于正常范圍（18.5~23.9 kg/m2）；（2）身體健康，無胃腸道方面的疾??；（3）試驗(yàn)前兩周內(nèi)沒有服用任何含益生菌的產(chǎn)品，試驗(yàn)前三個(gè)月內(nèi)沒有服用任何含抗生素的藥物。包含新鮮糞便樣本的無菌管迅速轉(zhuǎn)移置厭氧培養(yǎng)箱中，將三名志愿者的糞便與碳酸-磷酸緩沖液按1:3的比例混合均勻，然后過濾得到菌液。在每個(gè)厭氧瓶中加入4 mL碳酸-磷酸緩沖液和1 mL菌液，然后用橡膠塞和鋁蓋密封。在37 ℃水浴中發(fā)酵4、8、12和24 h后，立即取出相應(yīng)的厭氧瓶，用帶有刻度的注射器測量產(chǎn)氣量。收集發(fā)酵后的上清液進(jìn)行短鏈脂肪酸分析、沉淀物進(jìn)行16S rRNA基因測序，所有上清液和沉淀物均保存在-80 ℃以作進(jìn)一步分析。

1.3.7 短鏈脂肪酸含量測定

短鏈脂肪酸的產(chǎn)量參考Wang等[21]的方法，使用氣相色譜儀測定。將不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)的樣品以12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，分離得到上清液。以4-甲基戊酸配制內(nèi)標(biāo)混合物，將200 μL的內(nèi)標(biāo)混合物加入至800 μL的上清液中，混合均勻，注入氣相色譜儀。樣品中的短鏈脂肪酸通過毛細(xì)管柱（Zebron，ZB-FFAP，30 m×0.25 mm×0.25 μm）和氫離子火焰檢測器，在流速為1 mL/min的氮?dú)庵蟹蛛x后測定濃度。具體條件為：分流比 10:1，進(jìn)樣器和檢測器溫度為230 ℃，初始柱溫為80 ℃，以8 ℃/min升溫至192 ℃，保持3 min。程序結(jié)束后，記錄出峰面積，通過校正內(nèi)標(biāo)的峰面積對(duì)樣品中的目標(biāo)短鏈脂肪酸進(jìn)行定量計(jì)算。

1.3.8 DNA的提取與序列分析

使用QIAamp? DNA試劑盒，從不同時(shí)間點(diǎn)的酵解樣品中提取DNA，并在-20 ℃下保存用于測序分析。對(duì)DNA進(jìn)行定量，以及瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的提取質(zhì)量。隨后對(duì)純化合格的DNA樣本，添加樣本特異性 Barcode序列，使用正向和反向引物對(duì)細(xì)菌16S rRNA V3-V4區(qū)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熒光定量。按照每個(gè)樣本的測序量需求，匯聚等量的擴(kuò)增子，對(duì)各樣本按相應(yīng)比例進(jìn)行混合，采用Illumina公司的MiSeq測序儀進(jìn)行高通量雙端測序，對(duì)應(yīng)試劑盒為MiSeq Reagent Kit V3。

1.3.9 16 S rRNA基因序列分析

采用DADA2方法對(duì)序列進(jìn)行去噪，并以100%的相似度去重、聚類得到ASVs序列。依據(jù)Greengenes數(shù)據(jù)庫和Classify-sklearn算法對(duì)每個(gè)ASV進(jìn)行物種注釋，并借助基因云平臺(tái)進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化和繪制（https://www.genescloud.cn/login）。

1.3.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用單因素方差分析和Turkey’s多重檢測綜合評(píng)價(jià)試驗(yàn)組之間的差異，采用p＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用GraphPad Prism 7.0版本進(jìn)行作圖和SPSS 20.0版本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 X-射線衍射分析

通過X-射線衍射手段分析HAMS和飽和度不同的淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物的結(jié)晶特性，結(jié)果如圖1所示。HAMS 在 5.6°、17.1°、22.1°和 24.0 °處均有特征峰出現(xiàn)，表明HAMS是典型的B型結(jié)晶結(jié)構(gòu)[22,23]，而樣品GS的B型結(jié)晶特征峰顯著減弱，僅在17.1°和20.0°處出現(xiàn)微弱的特征峰。高鏈玉米淀粉-不飽和脂肪酸復(fù)合物在圖中7.3°、13.1°和20.0°處均出現(xiàn)了特征峰，這是V型結(jié)晶結(jié)構(gòu)特有的特征峰的出現(xiàn)位置。有文獻(xiàn)報(bào)道認(rèn)為環(huán)境中的客體分子能夠通過疏水相互作用力進(jìn)入到單螺旋淀粉鏈的疏水性空腔中形成具有穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的淀粉V型結(jié)晶[24]，從圖中也證實(shí)了淀粉單螺旋和幾種脂肪酸成功復(fù)合并形成了相應(yīng)的復(fù)合物。但是除GS-OA外，隨著脂肪酸不飽和度增加，V型特征峰逐漸減弱，呈現(xiàn)GS-SA＞GS-LA＞GS-ALA的趨勢。此外，GS-SA在21.6°和24.1°均出現(xiàn)了較為尖銳的特征峰，這是未被洗脫的游離脂肪酸的特征峰，由于不飽和脂肪酸常溫下是液態(tài)，容易被φ=50%的乙醇溶液沖洗干凈，而中長鏈飽和脂肪酸在常溫下是固態(tài)，分散性較差，在常溫下難以被φ=50%的乙醇溶液洗脫完全，因此出現(xiàn)了尖銳的脂肪酸特征峰[25]。

圖1 淀粉-不飽和脂肪酸復(fù)合物的X-射線衍射圖譜Fig.1 X- ray diffraction pattern of starch-unsaturated fatty acid complex

高鏈玉米淀粉-不飽和脂肪酸復(fù)合物和HAMS的V型、B型結(jié)晶的含量及總結(jié)晶度如表1所示。XRD圖譜中特征峰的尖銳程度和強(qiáng)度可以表明樣品復(fù)合程度的大小，通過Jade軟件對(duì)XRD圖譜中的結(jié)晶峰進(jìn)行積分，發(fā)現(xiàn)GS-OA的V型結(jié)晶含量最高34.87%，其次是GS-SA為32.43%、GS-LA為32.93%、GS-ALA為30.42%。此結(jié)果與先前的文獻(xiàn)報(bào)道一致，當(dāng)脂肪酸碳鏈長度相同時(shí)，不飽和脂肪酸的分散性優(yōu)于飽和脂肪酸，而含有一個(gè)不飽和雙鍵的油酸比含有兩個(gè)不飽和雙鍵的亞油酸和亞麻酸產(chǎn)生的空間位阻更少[26]，因此當(dāng)鏈長相同時(shí)，淀粉與單不飽和脂肪酸最容易形成復(fù)合物，其次是飽和脂肪酸，最后才是多不飽和脂肪酸。另一方面，樣品GS-SA的總結(jié)晶度為38.73%?？偨Y(jié)晶度計(jì)算包括了B型、V型結(jié)晶和游離脂肪酸在內(nèi)，由于長鏈脂肪酸在常溫下是固態(tài)難以洗脫，因此GS-SA的總結(jié)晶度計(jì)算中有一部分是未由洗脫的脂肪酸產(chǎn)生的。

表1 淀粉-不飽和脂肪酸復(fù)合物中V型、B型結(jié)晶的含量及總結(jié)晶度(%)Table 1 V-type, B-type and total crystallinity for starch-unsaturated fatty acidcomplex

2.2 熱力學(xué)性質(zhì)分析

通過DSC進(jìn)行高鏈玉米淀粉-不飽和脂肪酸的熱力學(xué)性質(zhì)分析，結(jié)果如表2所示。樣品GS-SA有兩個(gè)吸熱峰，其中，第一個(gè)峰代表未和淀粉發(fā)生復(fù)合且沒被洗脫掉的硬脂酸，第二個(gè)峰代表淀粉-硬脂酸復(fù)合物。同樣地，Zhang等[27]對(duì)高直鏈玉米淀粉與月桂酸的復(fù)合物進(jìn)行DSC分析，也發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)峰出現(xiàn)了未洗脫的月桂酸。淀粉與油酸、亞油酸、亞麻酸形成的復(fù)合物未出現(xiàn)脂肪酸吸熱峰，因?yàn)槌叵虏伙柡椭舅釣橐簯B(tài)，容易洗脫完全。淀粉與油酸、亞油酸、亞麻酸形成的復(fù)合物未出現(xiàn)脂肪酸吸熱峰，因?yàn)槌叵虏伙柡椭舅釣橐簯B(tài)，容易洗脫完全。此外，這三個(gè)樣品都只出現(xiàn)了一個(gè)復(fù)合物吸熱峰，且溫度大概在91~114 ℃范圍內(nèi)，這是由于為避免不飽和脂肪酸氧化分解，采用復(fù)合溫度較低的堿液分散法進(jìn)行淀粉和脂肪酸的復(fù)合，因此形成的復(fù)合物也主要為較低溫度下形成的 I型復(fù)合物，而結(jié)構(gòu)更加緊密的Ⅱ型復(fù)合物則需要在高溫長時(shí)間加熱的環(huán)境下才能形成[28,29]。當(dāng)?shù)矸叟c不同飽和度的脂肪酸復(fù)合后，隨著不飽和度的增加，To、Tp、Tc逐漸降低。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，這可能是由于不飽和脂肪酸的雙鍵構(gòu)成空間阻力，削弱了化合物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，且不飽和雙鍵數(shù)量越多穩(wěn)定性越差[29]。淀粉-油酸復(fù)合物的焓值略高于淀粉-硬脂酸復(fù)合物，推測是因?yàn)閱尾伙柡椭舅嵊退嵩诔叵率且簯B(tài)且分散性好，更利于形成復(fù)合物。但隨著不飽和度的增加，GS-LA和GS-ALA的ΔH逐漸降低，雖然亞油酸和亞麻酸常溫下同為液態(tài)易分散于溶液中，但因?yàn)椴伙柡玩I的增多導(dǎo)致其空間位阻變大并阻礙復(fù)合物的形成[30]，這點(diǎn)與上述XRD結(jié)果一致。

表2 淀粉-不飽和脂肪酸復(fù)合物的熱力學(xué)性質(zhì)Table 2 Thermodynamic properties of starch-unsaturated fatty acid complex

2.3 復(fù)合指數(shù)和抗性淀粉含量分析

表3展示了高鏈玉米淀粉-不飽和脂肪酸復(fù)合物的復(fù)合指數(shù)CI值。CI值表征的是淀粉對(duì)碘結(jié)合能力的降低程度，它測量游離淀粉的可用性，并間接測量已整合到復(fù)合物中的脂肪酸的數(shù)量。在相同處理?xiàng)l件下，復(fù)合指數(shù)呈現(xiàn)樣品 GS-OA＞GS-SA＞GS-LA＞GS-ALA的規(guī)律，這是因?yàn)橛退岱稚⑿愿?，容易擴(kuò)散到直鏈淀粉的疏水空腔內(nèi)形成復(fù)合物，但由于其含有一個(gè)不飽和雙鍵，而不飽和雙鍵的存在會(huì)增加立體障礙造成空間位阻，對(duì)其進(jìn)入淀粉的螺旋內(nèi)部造成一定的困難，進(jìn)而導(dǎo)致形成的復(fù)合物效果較差，因此CI值僅略高于樣品GS-SA[27]。已有報(bào)道證明，隨著淀粉雙螺旋數(shù)量的增加，空間位阻變大，形成的復(fù)合物越少，因此CI值也逐漸降低[26]。

表3 淀粉-不飽和脂肪酸復(fù)合物的復(fù)合指數(shù)及抗性淀粉含量Table 3 CI and RS value of starch-unsaturated fatty acid complex

未經(jīng)加工處理的HAMS是一種典型的RS2，具有較高的抗酶解特性，其RS含量為62.41%。然而，糊化后的樣品GS抗性淀粉含量大大降低，僅約28.79%，可能是糊化后，淀粉致密的結(jié)構(gòu)被大量破壞，生成了許多直鏈淀粉單螺旋，導(dǎo)致RS含量大大降低，但仍存在28.79%左右的抗性淀粉，是因?yàn)樵诶鋮s過程中，淀粉單螺旋結(jié)構(gòu)重結(jié)晶形成了老化淀粉，這與圖1的XRD結(jié)果一致，GS樣品僅在B型結(jié)晶特征峰處出現(xiàn)了較微弱的特征峰。高鏈玉米淀粉-不飽和脂肪酸復(fù)合物中脂肪酸的加入，在一定程度上降低了淀粉單螺旋重結(jié)晶，并形成了V型晶體和增加疏水性。這些物理變化的協(xié)同作用降低了高鏈玉米淀粉-不飽和脂肪酸復(fù)合物的酶催化作用，因此具有較高的抗酶解特性，具體 RS含量的順序?yàn)?GS-OA＞GS-SA＞GS-LA＞GS-ALA，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明RS含量與CI值密切相關(guān)[26]。

2.4 體外大腸發(fā)酵產(chǎn)氣量

高鏈玉米淀粉-不飽和脂肪酸復(fù)合物體外大腸發(fā)酵產(chǎn)氣量如圖2所示。陽性對(duì)照FOS在整個(gè)發(fā)酵過程中顯示出最高的發(fā)酵速率，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，但過快的發(fā)酵速率容易導(dǎo)致脹氣等不適癥狀[31]。與FOS相比，HAMS在整個(gè)發(fā)酵過程中具有緩慢的發(fā)酵速率。而與FOS相比，高鏈玉米淀粉-不飽和脂肪酸復(fù)合物樣品GS-SA、GS-OS、GS-LA、GS-ALA 在整個(gè)過程的發(fā)酵速率都較為緩慢，但彼此間無顯著性差異（p＞0.05），復(fù)合物在發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)的產(chǎn)氣量基本一致（13.8~14.2 mL），因此推斷，高鏈玉米淀粉-不飽和脂肪酸復(fù)合物能夠降低發(fā)酵速率，緩慢并穩(wěn)定地釋放發(fā)酵產(chǎn)物，但其產(chǎn)氣特性與復(fù)合物中的脂肪酸飽和度無關(guān)。此外，膳食纖維在結(jié)腸微生物酵解的過程中，主要產(chǎn)生氫氣、甲烷、二氧化碳等氣體。其中二氧化碳能由所有細(xì)胞產(chǎn)生，但只有細(xì)菌可以通過代謝產(chǎn)生氫氣和二氧化碳，因此總氣體產(chǎn)量可以作為膳食纖維發(fā)酵速率的反映并表征微生物群的活躍性[32]。Candido等[33]的研究發(fā)現(xiàn)腸道微生物幾乎不能在厭氧的環(huán)境中分解利用游離脂肪酸。脂肪酸樣品SA、OA、LA、ALA在整個(gè)發(fā)酵過程中產(chǎn)氣量都很低，這意味著脂肪酸難以被微生物分解利用。這些結(jié)果表明與FOS這類快速發(fā)酵的益生元相比，RS5具有緩慢發(fā)酵的特性，但這種特性與復(fù)合物中的脂肪酸飽和度聯(lián)系不大。

圖2 淀粉-不飽和脂肪酸復(fù)合物進(jìn)行24 h體外發(fā)酵過程中產(chǎn)氣量情況（mL/50 mg碳水化合物）Fig.2 Gas production (mL/50 mg carbohydrate) during in vitro fecal fermentation time course

2.5 短鏈脂肪酸產(chǎn)量和組成

短鏈脂肪酸是腸道菌群發(fā)酵的主要有益代謝產(chǎn)物，乙酸、丙酸和丁酸具有各自不同的作用，短鏈脂肪酸的產(chǎn)量也常被用作判斷膳食纖維發(fā)揮益生作用的功能指標(biāo)之一[34]。高鏈玉米淀粉-不飽和脂肪酸復(fù)合物的乙酸、丙酸和丁酸產(chǎn)量如圖3a~3c所示。本文以FOS作為陽性對(duì)照，以HAMS、GS和SA、OA、LA、ALA作為陰性對(duì)照。FOS在發(fā)酵各時(shí)間點(diǎn)的乙酸和丙酸的濃度最高。與FOS相比，HAMS和GS在整個(gè)發(fā)酵過程中乙酸和丙酸的產(chǎn)量較低。發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)，HAMS產(chǎn)生了 22.42 mmol/L的丁酸，這與之前報(bào)道的結(jié)果一致[35]。發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)，高鏈玉米淀粉-不飽和脂肪酸復(fù)合物 GS-SA、GS-OA、GS-LA、GS-ALA 產(chǎn)生 60.25~63.73 mmol/L的乙酸和21.22~24.81 mmol/L的丙酸，均高于樣品HAMS和GS，說明在淀粉中引入脂肪酸能夠提高發(fā)酵過程中部分SCFAs的產(chǎn)量，尤其是乙酸和丙酸。而各種脂肪酸在發(fā)酵終點(diǎn)的總酸產(chǎn)量基本一致，這可能是由于在厭氧環(huán)境中脂肪酸難以被微生物分解，因此腸道中發(fā)酵產(chǎn)生的 SCFAs含量很低[33]。圖3d為體外糞便發(fā)酵過程中高鏈玉米淀粉-不飽和脂肪酸復(fù)合物的總酸產(chǎn)量。FOS在發(fā)酵前12 h的產(chǎn)酸速率最快并且在整個(gè)發(fā)酵過程中的總酸產(chǎn)量最高。高鏈玉米淀粉-不飽和脂肪酸復(fù)合物的總酸產(chǎn)量均高于樣品HAMS和GS，但是高鏈玉米淀粉-不飽和脂肪酸復(fù)合物之間產(chǎn)酸含量差異不顯著，進(jìn)一步說明復(fù)合物中的脂肪酸飽和度不是影響短鏈脂肪酸產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。

圖3 淀粉-不飽和脂肪酸復(fù)合物在發(fā)酵不同時(shí)間點(diǎn)的乙酸(a)、丙酸(b)、丁酸(c)及總酸(d)濃度Fig.3 Acetate (a), propionate (b), butyrate (c) and total SCFA (d) concentration produced during in vitro fecal fermentation

2.6 腸道菌群物種豐度變化

通過16S rRNA測序，在門水平和屬水平上進(jìn)一步研究了發(fā)酵終點(diǎn)的腸道微生物群落的相對(duì)豐度，其中門水平上結(jié)果如圖4a所示。與空白相比，HAMS和 GS促進(jìn)了 Bacteroidetes的相對(duì)豐度，抑制了Firmicutes的相對(duì)豐度。高鏈玉米淀粉-不飽和脂肪酸復(fù)合物隨著復(fù)合物中脂肪酸不飽和度的增加，Bacteroidetes的相對(duì)豐度不斷增加。而所有的脂肪酸樣品均提高了 Proteobacteria的相對(duì)豐度。有報(bào)道稱Proteobacteria相對(duì)豐度升高可能與腸道炎癥性疾病有關(guān)[36]，這說明所有的脂肪酸樣品具有潛在的不良效果，可能會(huì)引起機(jī)體的腸道方面的疾病。在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，高鏈玉米淀粉-不飽和脂肪酸復(fù)合物對(duì)Bacteroidetes和Firmicutes的豐度表現(xiàn)出不同的影響。具體而言，樣品GS-SA在門水平上的發(fā)酵特性與GS最為接近，這表明GS與GS-SA的發(fā)酵特性最為相似，而GS-OA，GS-LA和GS-ALA的Bacteroidetes豐度均比GS-SA和GS高，可能與丙酸濃度有關(guān)[37]。

樣品在屬水平上的變化如圖4b所示。與空白相比，F(xiàn)OS顯著促進(jìn)Prevotella和Bacteroides的相對(duì)豐度，抑制了Roseburia、Faecalibacterium、Blautia、unidentifiedRuminococcus和Dialister的生長。研究表明Bacteroides能夠通過一系列糖苷水解酶和碳水化合物代謝途徑產(chǎn)生豐富的乙酸和丙酸[37]，這與前面FOS顯著提高乙酸和丙酸濃度的結(jié)果一致（圖3a~3b）。與空白相比，HAMS和 GS顯著提高了Prevotella和Bacteroides的相對(duì)豐度；與FOS相比，HAMS和GS明顯增加了Roseburia和unidentifiedLachnospiraceae，這與前面 SCFAs數(shù)據(jù)（圖3c）一致。Roseburia和Lachnospiraceae具有良好的產(chǎn)丁酸效應(yīng)，能有效增強(qiáng)腸道屏障功能，進(jìn)一步改善結(jié)腸相關(guān)的疾病[38,39]。值得注意的是，高鏈玉米淀粉-不飽和脂肪酸復(fù)合物顯著促進(jìn)了Prevotella的增加，并且隨著脂肪酸不飽和度的增加，Prevotella的相對(duì)豐度逐漸升高。據(jù)相關(guān)研究，Prevotella能夠促進(jìn)多糖降解從而實(shí)現(xiàn)高乙酸和丙酸的產(chǎn)量[40]，這與前文高鏈玉米淀粉-不飽和脂肪酸復(fù)合物產(chǎn)乙酸（圖3a）數(shù)據(jù)一致。與空白相比，樣品SA、OA、LA 均顯著促進(jìn)了Faecalibacterium、Blautia、unidentifiedRuminococcus和Oscillospira的相對(duì)豐度，樣品ALA顯著促進(jìn)的Bacteroides的生長，其中樣品SA還促進(jìn)了Prevotella相對(duì)豐度的增加。

圖4 淀粉-不飽和脂肪酸復(fù)合物經(jīng)體外糞便發(fā)酵24 h后腸道菌群門水平(a)和屬水平(b)物種豐度變化Fig.4 Phylum level (a) andgenus level (b) of starch-unsaturated fatty acid complex after 24 h in vitro fecal fermentation

為了進(jìn)一步比較樣品之間的物種組成差異，可以突出樣品種物種豐度分布的趨勢，對(duì)樣品中平均豐度大于6 000的ASVs進(jìn)行豐度分析，根據(jù)類群間的相關(guān)性繪制了聚類熱圖（圖5），二維空間的長度大于描述符的平衡圓半徑的ASVs列為關(guān)鍵ASVs，并以綠色標(biāo)注，關(guān)鍵ASVs將在決定細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)起到至關(guān)重要作用的ASVs。從圖中可以看到，F(xiàn)OS明顯促進(jìn)了12種ASVs的相對(duì)豐度。與空白相比，GS-OA、GS-LA、GS-ALA均能夠促進(jìn)12種ASVs（ASV23395、ASV17067、ASV6097、ASV8028、ASV295、ASV10495、ASV13556、ASV7621、ASV5458、ASV14314、ASV16282和ASV8140Prevotellacopri）的相對(duì)豐度，這與FOS能夠促進(jìn)的菌一致，但GS-SA與GS能夠促進(jìn)的菌群結(jié)構(gòu)更為相似，這意味著淀粉-硬脂酸復(fù)合物與所復(fù)合的淀粉對(duì)菌群調(diào)控具有相似作用。研究表明，Prevotellacopri是腸道的常見菌之一，能夠?qū)⒍嗵墙到鉃楸岷顽晁?，并促進(jìn)肝糖原的儲(chǔ)存[41,42]。樣品SA能夠促進(jìn)3種ASVs（ASV14115、ASV17039和ASV14843Faecalibacterium prausnitzii）相對(duì)豐度升高。Faecalibacterium prausnitzii是健康成人結(jié)腸中最豐富的細(xì)菌種類之一，占細(xì)菌總數(shù)的 5%以上，是人類腸道健康的主要參與者和生物傳感器，并且能夠生產(chǎn)具有抗炎作用的SCFAs[43]。樣品OA能夠促進(jìn)5種ASVs相對(duì)豐度升高，其中ASV15724 unidentifiedDialister是厚壁菌門中的一類細(xì)菌，常存在于健康人體內(nèi)[42]。樣品 LA 能夠促進(jìn) ASV15724 unidentifiedDialister和ASV6837 UnidentifiedRoseburia相對(duì)豐度的升高，而樣品 ALA似乎在促進(jìn) ASV14306 UnidentifiedBacteroides生長方面具有突出貢獻(xiàn)，這與之前屬水平（圖4）的結(jié)果一致。為淀粉-油酸復(fù)合物；GS-LA 為淀粉-亞油酸復(fù)合物；GS-ALA 為淀粉-亞麻酸復(fù)合物；SA為硬脂酸；OA為油酸；LA為亞油酸；ALA為亞麻酸。熱圖方塊的顏色由藍(lán)變紅表示ASV物種豐度由低變高；不同樣品的同一ASV物種豐度與空白對(duì)照相比的顯著性標(biāo)注，*表示p<0.05；**表示p<0.01；***表示p<0.001。

圖5 淀粉-不飽和脂肪酸復(fù)合物經(jīng)體外糞便發(fā)酵24 h后腸道菌群ASV水平物種豐度變化Fig.5 Heatmap from 16S rRNA gene sequencing of the starch-unsaturated fatty acid complex after 24 h in vitro fecal fermentation

2.7 腸道菌群結(jié)構(gòu)多樣性分析

PCA分析能夠確定各樣本間微生物群落的結(jié)構(gòu)差異，判斷樣品間菌群相似度。采用key ASV對(duì)發(fā)酵24 h后的樣品微生物群落進(jìn)行PCA分析，如圖6所示。兩個(gè)主軸表示了樣本間88.7%的總方差（PC1：66.2%，PC2：22.5%），這說明樣品間的微生物結(jié)構(gòu)具有顯著差異。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，對(duì)照組與復(fù)合物組之間存在顯著差異。從圖中發(fā)現(xiàn)ASV10495、ASV16282、ASV17067、ASV8104Prevotellacopri與樣品GS-SA、GS-OA、GS-LA、GS-ALA、HAMS、DS之間顯著相關(guān)，由于Prevotellacopri能促進(jìn)丙酸的產(chǎn)生，這種顯著相關(guān)可能與前面測定高濃度的丙酸產(chǎn)生有關(guān)[40,41]。另外，樣品 SA、OA、LA 與空白發(fā)生了聚類現(xiàn)象，促進(jìn) ASV14843、ASV17039Faecalibacterium prausnitzii的相對(duì)豐度的增加，與高鏈玉米淀粉-不飽和脂肪酸復(fù)合物相比，這幾種脂肪酸對(duì)菌群構(gòu)成的影響較小，對(duì)菌群的調(diào)控作用不顯著。值得注意的是，樣品ALA作為一種不飽和脂肪酸對(duì)菌群的影響十分特殊，與前面所述的三種脂肪酸樣品不同的是，樣品ALA能夠促進(jìn)ASV14306 UnidentifiedBacteroides和ASV19479 UnidentifiedFusobacterium的增加，這與熱圖（圖5）的結(jié)果一致。LA為亞油酸；ALA為亞麻酸。

圖6 淀粉-不飽和脂肪酸復(fù)合物經(jīng)體外糞便發(fā)酵24 h后腸道菌群ASV水平的主成分分析結(jié)果Fig.6 PCA from 16S rRNA gene sequencing of the starch-unsaturated fatty acid complex after 24 h in vitro fecal fermentation

3 結(jié)論

本文利用堿液分散法，使用四種飽和度不同的脂肪酸為原料，制備了四種淀粉-不飽和脂肪酸復(fù)合物，并通過體外批式發(fā)酵模型探究了復(fù)合物的體外發(fā)酵產(chǎn)氣量、短鏈脂肪酸產(chǎn)量及菌群豐度的變化。通過結(jié)構(gòu)表征，發(fā)現(xiàn)除淀粉-油酸復(fù)合物以外，隨著脂肪酸不飽和度增加，淀粉與各脂肪酸復(fù)合程度逐漸降低。在體外發(fā)酵過程中，高鏈玉米淀粉-不飽和脂肪酸復(fù)合物具有相似的發(fā)酵速率但彼此間無顯著性差異（p＞0.05），表明脂肪酸的飽和度并不是控制總體發(fā)酵速率的關(guān)鍵因素。發(fā)酵結(jié)束時(shí)高鏈玉米淀粉-不飽和脂肪酸產(chǎn)生的乙酸和丙酸濃度，均高于樣品HAMS和GS，說明在淀粉中引入各種脂肪酸能夠提高發(fā)酵過程中部分SCFAs的產(chǎn)量，尤其是乙酸和丙酸，但其產(chǎn)量在各復(fù)合物之間無顯著性差異（p＞0.05）。通過 16S rRNA測序發(fā)現(xiàn)高鏈玉米淀粉-不飽和脂肪酸復(fù)合物與HAMS和 GS的菌群結(jié)構(gòu)更為相似，且明顯促進(jìn)了Prevotella的相對(duì)豐度，這可能與淀粉類樣品能夠顯著促進(jìn)丙酸濃度有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)高鏈玉米淀粉-不飽和脂肪酸復(fù)合物作為RS5的一種，具有調(diào)節(jié)發(fā)酵代謝產(chǎn)物和腸道微生物構(gòu)成以及改善結(jié)腸健康的潛力。本實(shí)驗(yàn)為定向設(shè)計(jì)促進(jìn)腸道健康的食品配料提供了理論支撐。