鄭德斌，馬 超，劉張倩，欒 凱，陳 衛(wèi)，劉克奉

（天津市水產(chǎn)研究所 天津 300221）

引言

漁業(yè)資源調(diào)查是保護和管理漁業(yè)資源的重要手段。傳統(tǒng)的調(diào)查方法包括捕撈調(diào)查、捕撈統(tǒng)計和水生生物監(jiān)測等。然而，傳統(tǒng)方法通常具有操作繁瑣、耗時長、成本高等問題，很難獲取全面準確的數(shù)據(jù)，特別是對于水體中的隱蔽魚類或少量目標種的調(diào)查。因此，尋找一種快速、準確且非侵入性的漁業(yè)資源調(diào)查方法具有重要意義。

環(huán)境DNA 技術作為一種新興的非入侵性調(diào)查方法，已經(jīng)在漁業(yè)資源調(diào)查中得到廣泛應用。所謂環(huán)境DNA技術，指利用對環(huán)境中游離DNA分子研究和分析，從而檢測出存在的目標物種種類和布局，從而為漁業(yè)資源的保護和管理提供重要信息。環(huán)境DNA技術的應用研究在漁業(yè)資源調(diào)查中取得了一定的進展。研究人員通過收集不同水體中的樣本，如河流、湖泊、海洋等，利用環(huán)境DNA技術可以檢測到目標魚類的存在和相對豐度，從而研究其分布與數(shù)量變化。與傳統(tǒng)調(diào)查方法相比，環(huán)境DNA 技術具有快速、高效、準確的優(yōu)勢，且能夠發(fā)現(xiàn)隱蔽種、少量種和稀有種，為漁業(yè)資源的保護和管理提供了新的視角。此外，環(huán)境DNA 技術還可以用于評估魚類生存環(huán)境質(zhì)量和生態(tài)系統(tǒng)健康狀況。通過分析水體中的環(huán)境DNA，可以確定有害物質(zhì)的污染程度，評估環(huán)境對魚類的適應性，并提供有關生態(tài)系統(tǒng)功能和穩(wěn)定性的信息。

1 環(huán)境DNA水樣檢測方法

當前，可以通過三種取樣方法來調(diào)查魚類資源和檢測魚類資源，如：直接采集法、濾膜法和沉淀法等環(huán)境DNA技術。

（1）直接采集法：將采集的水樣直接保存起來，以收集其中的環(huán)境DNA。這種方法相對簡單，適用于場地條件較為便利的情況。

（2）濾膜法：將采集的水樣通過過濾的方式，將環(huán)境DNA 濾附于濾膜上，然后保存濾膜以采集DNA。濾膜法又可分為三種具體操作方式：①在線過濾：在野外進行實時過濾操作; ②采樣后過濾：在野外進行非實時過濾操作;③水樣采集-保存-實驗室過濾：采集水樣后將其保存，并在實驗室中進行過濾操作。在濾膜法中，常見的濾膜材料孔徑往往在0.22～1.5 μm 范圍之內(nèi)，有硝酸纖維膜、聚碳酸酯膜、玻璃纖維膜和尼龍膜等。據(jù)已有研究可知，不同濾膜的DNA回收率是不同的，回收效果最佳的是混合纖維濾膜。為保證DNA 的穩(wěn)定性，往往采用冷凍保存或脫水保存濾膜的方式。冷凍保存在-20℃，而脫水保存則是通過3 mol/L的乙酸鈉和95%的乙醇（或無水乙醇）混合液以進行脫水處理。

（3）沉淀法：沉淀法是一種分離和濃縮環(huán)境DNA的方法，分為乙醇沉淀法和異丙醇沉淀法。采集水樣時，將藥品和水樣按比例混合，然后在低溫條件下離心，去除上清后提取沉淀中的DNA。盧珊[1]通過實驗研究發(fā)現(xiàn)，與乙醇沉淀法相比，異丙醇沉淀法更高效、更穩(wěn)定，操作方法更簡便，需要試劑量少。但是，當野外采樣的水樣量較大，且目標距離較遠的時候，運輸和保存會有困難。濾膜法在這方面具有優(yōu)勢，可以過濾保存大量的水中游離的DNA。但是濾膜法也會丟失一些可溶性DNA，這些DNA可能會提高檢測率。

采集的環(huán)境DNA 水樣量通常在15 mL～10 L 之間，具體取決于水體類型和環(huán)境條件。海洋、江河、溪流、池塘和湖泊等水體一般采樣量為1～2 L，在選擇采樣方式的時候，應當參考目標物種的生活習性、種群密度和水體環(huán)境等因素。增加采樣次數(shù)、采樣點和采樣區(qū)域，同時在混合采樣前分層或河段取樣，可以顯著提高目標物種的檢測率。已有研究發(fā)現(xiàn)，重復采樣次數(shù)對物種的檢測率有顯著影響，減少重復次數(shù)會降低物種的檢測率。

環(huán)境DNA的降解速率會影響物種的檢測率和分布情況。一些研究發(fā)現(xiàn)，魚類離開水體后，水中的環(huán)境DNA半衰期為6.3 h；而其他研究發(fā)現(xiàn)，移除物種后，環(huán)境DNA在水中可存在3 d，還有研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境DNA的存在時間為8 d。這些不一致的結(jié)果表明，環(huán)境DNA降解速率受到多種因素的影響，如：酸堿性、溫度、光照和微生物等。這些因素通過環(huán)境DNA釋放和降解速度來影響生物量測量的準確性。但是，仍應當加強對環(huán)境DNA存在時間長短的研究和分析。

為了提高野外采集水樣物種檢出率，可以采取以下措施：（1）選擇合適的采樣方法和采樣地點：根據(jù)不同水體中的物種多樣性，選擇適宜的采樣方法，并在同一采樣位置的同一水體深度設置不同的水量梯度，以增加樣品的多樣性；（2）及時保存采集的樣品：采集的水樣需要及時保存，以防止DNA降解導致實驗誤差?？梢允褂美鋬霰４婊蛱砑颖Ｗo劑等方法來保護采集的樣品；（3）優(yōu)化環(huán)境DNA 提取方法：由于水樣中的DNA 含量少且成分復雜，尚無統(tǒng)一的環(huán)境DNA提取標準。常見的方法是使用微量DNA提取試劑盒進行提取。根據(jù)不同研究對象，可以選擇不同的組合方式，如水樣采集、水樣抽濾或離心沉淀以及DNA提取過程等，以提高提取效果；（4）引物設計和目標物種檢測：在環(huán)境DNA中，有多個生物的DNA，可通過特定引物來增加目標物種的DNA研究，利用二代測序技術檢測物種種類。在設計引物的時候，要聯(lián)系環(huán)境DNA復雜的環(huán)境條件，引物應適用于不同物種當中，且具備一定的特殊性。目前已經(jīng)設計出一些針對多種環(huán)境DNA的通用引物，為環(huán)境DNA技術在物種調(diào)查中的應用奠定了基礎。常用的引物包括D-Loop 區(qū)、16S rRNA 基因、12S rRNA基因、CO1基因和Cytb基因等。

2 檢測平臺

第1 代測序技術，如Sanger 測序，擁有高度準確和可靠的特點，但是成本較高，速度較慢。而第2代測序技術，如Roche/454 焦磷酸測序、Illumina/Solexa 聚合酶合成測序、ABI/SOLiD連接酶測序和IonPGM測序，則成為主要的測序方法。每種技術都有不同的測序原理，因此產(chǎn)量、質(zhì)量和成本也存在差異。Roche/454 焦磷酸測序具有最長的讀長，但通量較低；Illumina/Solexa聚合酶合成測序具有最高的通量，但讀長較短；ABI/SOLiD 連接酶測序適用于重測序，但讀長最短；IonPGM 測序則成本較低。Roche/454焦磷酸測序曾經(jīng)占據(jù)主要市場，但隨著其他測序技術的發(fā)展，這一優(yōu)勢不斷削弱。當下，Hiseq 測序平臺是第二代測序方法中使用頻率最高的，片段讀長較短是這一方法的一大短板。

當下，第三代測序技術正逐步發(fā)展壯大，其測序方法有并行單分子合成測序、基于熒光共振能量傳遞測序、納米孔單分子測序、單分子實時合成測序、半導體測序等單分子。不同于第二代測序技術，三代測序技術是基于SBS原理，即邊合成邊測序方法，這一方法大大優(yōu)化了文字構建流程，減少了對PCR擴增的依賴。此外，這一技術也減少了DNA擴增需求，大大提高了測序長度，可達到10～25 kb，并使后續(xù)的拼接工作更加簡單。

第三代測序技術不僅適用于已知基因組的測序，還可用于未知基因組的測序。然而，第三代測序技術也存在一定的局限性，如錯誤率較高，不適合重復測序。當下，采取的修正方法的基礎多為多次重復測序或第三代測序的長片段，使用第二代測序數(shù)據(jù)進行修正。盡管第三代測序技術各有優(yōu)勢和不足，但市場上仍主要使用第一、二代測序技術。

可以預見，未來隨著第三代測序技術的持續(xù)改進，可能會涌現(xiàn)出新的技術，為科學研究提供更為強大的支持。

3 環(huán)境DNA技術的研究現(xiàn)狀

環(huán)境DNA 監(jiān)測相較于傳統(tǒng)的物種調(diào)查方法更具優(yōu)勢，其中包括快速降解、實時反映生物狀態(tài)、短時間、低成本和高檢測率的特點。此外，環(huán)境DNA采樣方法和分析方法便于標準化，其受到工作人員和抽樣強度概率較低，且基本不會影響生態(tài)系統(tǒng)。此外，環(huán)境DNA對于獲得許可珍稀或瀕危物種的監(jiān)測更有利。對于監(jiān)測效果而言，環(huán)境DNA在監(jiān)測多樣性上效果明顯，能夠迅速獲得物種分布信息，應用前景廣闊。

3.1 環(huán)境DNA技術國外研究現(xiàn)狀

環(huán)境DNA 在2008 年首次被Ficetola 應用于水域入侵物種的監(jiān)測，即監(jiān)測美國牛蛙（Rana catesbeiana）。此后，便被廣泛應用于研究淡水生態(tài)系統(tǒng)的生物，尤其是用于對入侵物種的研究。Ogram A 等[2]研究者表明，在靈敏性和取樣效果方面，環(huán)境DNA研究效果明顯好于傳統(tǒng)形態(tài)學識別檢測方法。J Yoccoz等研究表明，相較于傳統(tǒng)漁業(yè)監(jiān)控方法，環(huán)境DNA檢測方法在研究河流系統(tǒng)中的亞洲鯉魚效果更佳，并且對北美五大湖的這兩種入侵物種進行了擴展研究，進一步證明了環(huán)境DNA在監(jiān)測敏感度方面優(yōu)于傳統(tǒng)的魚類資源調(diào)查方法。此外，Mahon等[3]利用環(huán)境DNA檢測到河流中低密度下的入侵物種鯉科魚類，并采取了相應的清除措施。

Martellini A 等[4]使用環(huán)境DNA 技術對日本內(nèi)陸和周圍島嶼上的藍鰓太陽魚進行了評估，發(fā)現(xiàn)了這種入侵物種的存在情況，與傳統(tǒng)的視覺檢測相比，環(huán)境DNA 檢測方法更為有效，并通過克隆法和Cytb 部分序列法檢測河流中魚類時，成功發(fā)現(xiàn)了4 種魚類。環(huán)境DNA 技術發(fā)展水平越高，應用范圍也越來越廣，被用于研究和評估生物量中，其研究對象范圍也不斷擴大，包括兩棲類、魚類、哺乳類、爬行類和腹足類。隨著測序技術的不斷進步，環(huán)境DNA 技術現(xiàn)在可以在動物群水平進行物種鑒定，而不僅僅局限于單個物種。Ficetola等[5]利用環(huán)境DNA技術在日本近海檢測到了128 種魚類，比較了在魚類和兩棲類物種多樣性研究中，環(huán)境DNA 技術和傳統(tǒng)調(diào)查方法的優(yōu)劣。他們發(fā)現(xiàn)，根據(jù)多數(shù)采樣點結(jié)果顯示，在魚類種數(shù)檢測方面，環(huán)境DNA檢測水平明顯不低于傳統(tǒng)方法。而在兩棲類動物檢測方面，環(huán)境DNA檢測成功率明顯高于傳統(tǒng)方法。

3.2 環(huán)境DNA技術國內(nèi)研究現(xiàn)狀

雖然我國在水環(huán)境DNA研究方面起步較晚，但近年來取得了一些重要的研究成果。例如，劉軍等[6]選擇了根據(jù)魚類5 個線粒體基因設計的環(huán)境DNA 通用引物，以鯉科魚類為研究對象，評估不同引物檢測效果可知，在適用性方面，16SrRNA 基因引物明顯更符合我國魚類群落結(jié)構環(huán)境DNA研究。徐念等[7]檢測到了長江中下游干流的24個采樣點中的10種魚類序列，并開發(fā)了適用于長江魚類的環(huán)境DNA檢測體系。馬竹欣[8]則利用環(huán)境DNA的方法研究了元陽梯田中克氏原螯蝦的分布情況，為監(jiān)測其擴散動態(tài)提供了基礎數(shù)據(jù)。趙夢迪[9]使用12SrRNA 引物研究了黃海近海水域魚類群落，共檢測出571種魚類，大多數(shù)種類是常見或被歷史記錄過的種類。并對水環(huán)境中游離DNA進行了系統(tǒng)研究，通過高通量測序方法全面分析研究了水環(huán)境中的DNA情況，是研究水環(huán)境DNA的重要前提和基礎。吳昀等[10]的研究，則是通過使用環(huán)境DNA 檢測技術監(jiān)測長江江豚，江豚曾出現(xiàn)的地方中均可檢測到其DNA序列，其中33.33%采樣點是沒有觀測過江豚的采樣點發(fā)現(xiàn)了江豚序列。綜上可知，在物種監(jiān)測方面，環(huán)境DNA比傳統(tǒng)監(jiān)測方法更具優(yōu)勢，準確性、可靠性和靈敏性上更高。由此可知，在魚類資源調(diào)研方面，環(huán)境DNA技術為之提供了新方法和新路徑。

4 環(huán)境DNA技術的優(yōu)勢

對比傳統(tǒng)調(diào)查方法，環(huán)境DNA技術更加依賴實驗室內(nèi)工作，大幅的壓縮了野外調(diào)查和取樣的工作。不僅如此，環(huán)境DNA在成本和檢測效果方面有著更大優(yōu)勢。

4.1 成本優(yōu)勢

4.1.1 采樣成本低

相比傳統(tǒng)的漁業(yè)資源調(diào)查方法，環(huán)境DNA調(diào)查的采樣成本較低。傳統(tǒng)的漁業(yè)資源調(diào)查方法通常需要大量的人力和物力投入，例如使用漁網(wǎng)、羅盤和魚餌等工具，需要耗費大量的時間和人力來捕捉目標魚類。而環(huán)境DNA調(diào)查只需采集水樣即可，無需進行物種特異性的捕捉，從而節(jié)省了大量的人力和物力成本。

4.1.2 測序成本逐漸降低

隨著高通量測序技術的不斷發(fā)展和成本的降低，環(huán)境DNA 調(diào)查的后續(xù)分析和檢測成本也在逐漸降低。通過測序分析，可以從采集到的水樣中提取出環(huán)境DNA并進行物種鑒定。過去，測序成本較高，限制了環(huán)境DNA調(diào)查的廣泛應用。然而，隨著測序技術的成熟和成本的降低，現(xiàn)在可以通過高通量測序平臺進行大規(guī)模的環(huán)境DNA分析，降低了每個樣本的檢測成本。

4.1.3 數(shù)據(jù)處理成本低

環(huán)境DNA 調(diào)查生成的數(shù)據(jù)量較大，但相對而言，數(shù)據(jù)處理成本較低。傳統(tǒng)的漁業(yè)資源調(diào)查方法可能需要對大量的樣本進行人工鑒定和統(tǒng)計分析，這需要耗費大量的時間和人力成本。而環(huán)境DNA 調(diào)查可以通過計算機程序自動化地進行物種鑒定和數(shù)據(jù)分析，大大降低了數(shù)據(jù)處理的時間和成本。此外，環(huán)境DNA調(diào)查還可以利用現(xiàn)有的物種DNA數(shù)據(jù)庫進行物種鑒定，進一步節(jié)省了數(shù)據(jù)處理的成本。

4.2 檢測效果優(yōu)勢

檢測水生生物的入侵對于及早采取控制和消除措施非常重要。但是，早期水域入侵動物數(shù)量并不多，且水域當中有著較多的障礙物，這就影響了傳統(tǒng)檢測方法監(jiān)測效果，其實用率較低，難以發(fā)現(xiàn)一些個體較小的動物。以曹英華等[11]研究為例，他們比較傳統(tǒng)監(jiān)測方法和環(huán)境DNA 技術在檢測入侵法國西南部的美洲牛蛙的靈敏性。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在38 個采樣地點中，環(huán)境DNA 技術檢測到了美洲牛蛙的存在，而傳統(tǒng)調(diào)查方法只有7 個地點發(fā)現(xiàn)，由此可知，傳統(tǒng)方法大大低估了美洲牛蛙的分布情況。在調(diào)查美國五大湖中鰱和鳙的入侵情況時也發(fā)生類似的情況。

4.3 其他優(yōu)勢

環(huán)境DNA 相較于傳統(tǒng)的捕撈或電擊調(diào)查等監(jiān)測方式具有較少的環(huán)境破壞性。傳統(tǒng)調(diào)查方法在進行監(jiān)測時可能會對環(huán)境和生物造成損傷，但是，環(huán)境DNA 僅需要環(huán)境水樣，對生物和環(huán)境的影響程度較低。另外，由于互聯(lián)網(wǎng)技術發(fā)展和進步，后期環(huán)境DNA能夠充分利用無人設備、分子探針等新技術，實現(xiàn)分析、監(jiān)測和預警自動化，從而減少對人力和分類學家的依賴。這些優(yōu)勢使得環(huán)境DNA成為一種無可比擬的監(jiān)測方式。

5 環(huán)境DNA的未來發(fā)展方向

5.1 結(jié)合空間分析

使用環(huán)境DNA技術調(diào)查水生生物時，不僅關注物種是否存在和生物量，也重視入侵物種的區(qū)域分布和潛在入侵區(qū)域。研究表明，當結(jié)合環(huán)境DNA技術和統(tǒng)計模型后，能夠提高監(jiān)測入侵物種環(huán)境DNA的效率。某一研究就通過聯(lián)系環(huán)境DNA和物種空間分布預測模型，成功檢測出引入物種牛鱒的分布情況，也較好地應用在泥鰍、小口黑鱸等入侵物種的監(jiān)測中。另外，遙感技術的應用也提高入侵范圍和潛在入侵地研究效率。對于環(huán)境DNA而言，空間分析、統(tǒng)計模型的應用提高了其可探測性，也大大提高了檢測結(jié)果的準確度，實現(xiàn)了空間預測和分析。所以，這也是環(huán)境DNA技術研究的方向和前景。

5.2 檢測設備研發(fā)

環(huán)境DNA技術的發(fā)展在便攜設備和快速檢測方面帶來了許多好處。對于環(huán)境DNA現(xiàn)場分析時，可以充分應用便攜式qPCR 儀、納米孔測序儀等設備，從而降低樣品被污染和被降解的概率，也為環(huán)境DNA在復雜水域環(huán)境的研究提供助力。但是，我們很難在現(xiàn)有市場當中發(fā)現(xiàn)一套針對性強、準確度高的環(huán)境DNA檢測裝置。

在監(jiān)測入侵物種方面，跨學科技術的結(jié)合為環(huán)境DNA 的快速檢測提供了新思路。例如，結(jié)合光透射光譜和環(huán)境DNA技術，在印第安納港口附近，研究人員成功檢測到了斑馬貽貝，高效快速地檢測出壓艙水和港口水域的入侵物種情況。這也提高了環(huán)境DNA的應用效果，為之提供了堅實的技術基礎[12]。

隨著技術的發(fā)展，環(huán)境DNA 應當重視分析方法的改進和升級，比如：制度科學的采樣制度、研發(fā)高分辨率的引物序列和完善本地物種數(shù)據(jù)庫等，這才能大大提高環(huán)境DNA應用效果。另外，環(huán)境DNA的應用應當充分聯(lián)系新技術和新方法，通過人工智能、遙感技術和大數(shù)據(jù)等跨學科研究工具，拓寬環(huán)境DNA適用范圍，提高其準確度、科學性和智能化。