陳 梅 張 昱 李冬梅 張文靜,3

1 昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院(昆明 650500) 2 云南省第一人民醫(yī)院，昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科(昆明 650032) 3 云南省第一人民醫(yī)院，昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科(昆明 650032)

胃癌(gastric cancer，GC)是最常見的消化道惡性腫瘤之一。幽門螺桿菌(helicobacte rpylori，Hp)感染是GC發(fā)生的獨立危險因素[1- 2]，盡管根除Hp能夠顯著降低GC的發(fā)生率，但對于已經(jīng)發(fā)生癌變的患者來說，根治Hp對胃癌的治療并無明顯幫助；而且約一半以上的患者初次就診時已是中晚期，失去了根治性手術(shù)切除的機會。雖然針對人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor- 2，HER- 2)的靶向療法聯(lián)合化療對HER2陽性的胃癌患者帶來了一定的臨床獲益[3- 5]；相比于單獨化療，程序性細胞死亡-1/程序性細胞死亡配體1(programmed cell death protein 1/ programmed cell death protein ligand 1, PD-1/PD-L1)抑制劑聯(lián)合化療也提高了高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite-high，MSI-H)的晚期胃癌患者的客觀緩解率[6- 7]，但僅有極少數(shù)患者存在HER2陽性或MSI-H，而且治療后均存在耐藥現(xiàn)象。基于上述原因，目前晚期胃癌患者的總生存期(overall survival，OS)仍不盡如人意。因此，尋找新的預(yù)后和治療靶點，能夠為制定臨床決策提供一定的理論幫助。

NOTCH信號通路參與胃癌的多個生物學(xué)過程，包括細胞增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移以及血管形成。Mastermind-like 1(MAML1)是一種轉(zhuǎn)錄共激活因子，能夠與所有哺乳動物均有的四個NOTCH受體錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域結(jié)合，與ICN和RBP-Jkappa形成DNA結(jié)合復(fù)合物，并放大NOTCH誘導(dǎo)的HES1轉(zhuǎn)錄，從而充當(dāng)NOTCH信號的轉(zhuǎn)錄共激活因子[8- 9]。然而，MAML1在胃癌中的表達、生物學(xué)功能及潛在分子機制目前罕有報道。本研究應(yīng)用生物信息學(xué)方法分析MAML1在胃癌中的表達及與胃癌患者臨床特征及預(yù)后的相關(guān)性，并預(yù)測了MAML1的潛在關(guān)聯(lián)基因、信號通路及腫瘤浸潤淋巴細胞。為進一步體外研究MAML1在胃癌中的生物學(xué)功能及分子機制提供了一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 MAML1在胃癌組織和正常組織中的表達

癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫是大型癌癥基因組計劃的免費數(shù)據(jù)門戶[10]。我們從TCGA數(shù)據(jù)庫獲取了具有RNA-Seq表達和相匹配臨床病理信息的胃癌患者數(shù)據(jù)。通過The Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫中MAML1在胃癌和正常胃組織中的免疫組化結(jié)果觀察其表達和分布情況。

1.2 MAML1在GSE15459數(shù)據(jù)集中的表達水平與預(yù)后的關(guān)系

從GEO數(shù)據(jù)庫下載數(shù)據(jù)集GSE15459，該數(shù)據(jù)集芯片信息如下：GLP570(Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Array)，包含200例原發(fā)性胃癌的基因表達信息[11]。根據(jù)MAML1的中位表達水平，將胃癌患者分為MAML1高表達組(MAML1-high)和MAML1低表達組(MAML1-low)，使用Kaplan-Meier進行對其總生存期(overall survival, OS)進行分析，以探索MAML1表達水平與胃癌患者生存期之間的關(guān)系。

1.3 蛋白質(zhì)相互作用分析

使用在線工具STRING探索與MAML1可能存在相互作用的蛋白[12]，設(shè)置Pearson相關(guān)系數(shù)>0.5，預(yù)測的蛋白數(shù)量為50。

1.4 MAML1相關(guān)基因的功能注釋

利用Funrich在線工具分析MAML1相關(guān)基因所富集的功能和通路[13]。

1.5 TIMER 數(shù)據(jù)庫分析

腫瘤免疫浸潤評估資源(tumor immune estimation resource，TIMER)涵蓋 32 種癌癥類型并包含來自 TCGA 數(shù)據(jù)庫的10 897個樣本[14-15]。通過TIMER數(shù)據(jù)庫評估胃癌患者中 MAML1的表達水平與六種浸潤免疫細胞(CD8+T 細胞、CD4+T 細胞、B 細胞、樹突狀細胞巨噬細胞和中性粒細胞)豐度的相關(guān)性，并評估MAML1表達水平與腫瘤純度之間的關(guān)系，聯(lián)合GEPIA數(shù)據(jù)庫分析MAML1表達與腫瘤浸潤免疫細胞之間的關(guān)系。P<0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MAML1在胃癌中的表達水平

首先，TCGA數(shù)據(jù)庫在線分析結(jié)果提示：MAML1的表達水平在膽管癌(cholangiocarcinoma，CHOL)、食管癌(esophageal carcinoma，ESCA)、多形成性膠質(zhì)細胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)、頭頸鱗狀細胞癌(head and neck squamous cell carcinoma，HNSC)、腎乳頭狀細胞癌(kidney renal papillary cell carcinoma，KIRP)、急性髓細胞樣白血病(acute myeloid leukemia，LAML)、低級別腦膠質(zhì)瘤(brain lower grade glioma，LGG)、胰腺癌(pancreatic adenocarcinoma，PAAD)、肉瘤(sarcoma，SARC)、胃癌(stomach adenocarcinoma，STAD)、胸腺癌(thymoma，THYM)等多種惡性腫瘤顯著高于相匹配的正常組織(圖1A，P<0.05)。在The Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫中免疫組化染色提示(圖1B)：MAML1在胃癌組織中呈高表達，且以細胞核分布為主。與上述結(jié)果類似，MAML1 mRNA在胃癌組織中的表達水平同樣高于正常胃組織(圖1C，P<0.001)。

2.2 MAML1高表達的患者預(yù)后較低表達患者差

隨后，下載GSE15459數(shù)據(jù)并進生存曲線分析，結(jié)果提示：與MAML1-low組胃癌患者相比，MAML1-high患者的生存期更短(圖2A，P=0.01)。在亞組分析中，臨床III期的胃癌患者在MAML1-low和MAML-high人群間顯示出總體生存率的顯著差異(P=0.02，圖2D)，而在I、II和IV期患者中未見顯著性差異(P>0.05，圖2B、C、E)。在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，MAML1-low組的OS明顯優(yōu)于MAML-high組(圖2G)，而無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者未見顯著性差異(圖2F)。相反，在無遠處轉(zhuǎn)移的患者中，MAML1-low組的患者OS優(yōu)于MAML1-high組(圖2H)，但有遠處轉(zhuǎn)移的患者中未見顯著性差異(圖2I)。另外，無論患者是進行手術(shù)切除還是進行了術(shù)后以5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil，5-FU)為基礎(chǔ)的化療，均存在MAML1-low組的患者生存顯著優(yōu)于MAML-high組患者(圖2J、K)。以上結(jié)果提示，MAML1高表達的胃癌患者提示較短的生存期，且MAML1表達水平可能與III期胃癌患者的OS及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在正相關(guān)，而與患者是否接受手術(shù)治療或化療無明顯關(guān)系。

圖2 MAML1表達水平在胃癌患者的預(yù)后分析注：MAML1表達水平與(A)總體人群、(B)臨床I期、(C)II期、(D)III期、(E)IV期患者、(F)無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移N0、(G)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N1+2+3)、(H)無遠處轉(zhuǎn)移(M0)、(I)有遠處轉(zhuǎn)移(M1)、(J)僅接受手術(shù)治療、(K)接受時候輔助化療的患者OS的相關(guān)性。

2.3 MAML1相關(guān)作用蛋白的預(yù)測及功能和信號通路富集分析

為探討MAML1的高表達導(dǎo)致胃癌患者預(yù)后差的分子機制，我們應(yīng)用STRING數(shù)據(jù)庫分析了相關(guān)系數(shù)位居前50的MAML1作用蛋白(圖3A)。其中，位居前十位的分別是：NOTCH1、RBPJ、EP300、NOTCH2、HEY1、NOTCH4、HES5、MAML2、MYC和HEY2。其相關(guān)系數(shù)均大于0.94，而且大多數(shù)是NOTCH信號通路成員。

隨后，F(xiàn)UNRICH軟件對上述50個預(yù)測基因進行生物學(xué)功能和信號通路的富集分析顯示：90.2%的MAML1相關(guān)基因分布在細胞核中，34.1%位于核仁(圖3B)；分子功能方面，22.4%的基因參與轉(zhuǎn)錄因子活性，16.3%的基因參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性(圖3C)；在信號通路富集方面，38.5%的基因參與雄激素受體途徑(P<0.001)、30.8%參與C-MYB轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控途徑(P<0.05)、23.1%參與HIF- 2-alpha 轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)等途徑(圖3D)；生物功能過程方面，44.9%的基因參與核堿基、核苷、核苷酸和核酸代謝的調(diào)節(jié)(圖3E)。上述發(fā)現(xiàn)表明，與MAML1相關(guān)的基因大多位于細胞核中，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能，可能扮演激活劑或共激活劑的轉(zhuǎn)錄協(xié)同因子的作用。

圖3 胃癌組織中MAML1的潛在作用蛋白及其富集分析注：(A)按相關(guān)系數(shù)排名的前50個MAML1潛在關(guān)聯(lián)蛋白的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建；50個關(guān)聯(lián)蛋白在(B)細胞分布、(C)分子生物學(xué)功能、(D)生物學(xué)信號通路和(E)生物學(xué)功能方面的富集分析。

2.4 MAML1表達水平與腫瘤浸潤免疫細胞表達的相關(guān)性分析

研究表明，腫瘤浸潤淋巴細胞的高低與免疫檢查點抑制劑的療效有一定的相關(guān)性。因此，我們進一步分析了MAML1表達水平與六種浸潤性免疫細胞(CD8+T 細胞、CD4+T 細胞、B 細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞和中性粒細胞)和腫瘤純度的相關(guān)性。結(jié)果顯示(圖4)：MAML1與B細胞(r=0.133，P=0.001)、CD4+T細胞(r=0.298，P<0.001)、巨噬細胞(r=0.119,P=0.002)的表達水平存在顯著的正相關(guān)關(guān)系，但與腫瘤純度、CD8+T細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞無顯著相關(guān)性(P>0.05)。

圖4 MAML1與胃癌純度、不同浸潤免疫細胞(B細胞、CD8+T細胞、CD4+ T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞)間的相關(guān)性分析

隨后，我們應(yīng)用GEPIA分析了MAML表達水平與B細胞、巨噬細胞及各種功能性T細胞基因標記之間的關(guān)系。其中，GEPIA數(shù)據(jù)庫中功能性T細胞包括 Th1、Th2、Th9、Th17、Th22、Tfh、T細胞耗竭和Treg細胞。見表1：在胃癌中，MAML1表達水平與大多數(shù)免疫細胞標記物相關(guān)。MAML1表達水平與PD-1、TIM3、CTLA4等T細胞耗竭的細胞標志物顯著相關(guān)；還與STAT3、STAT6、STAT5A顯著相關(guān)。以上發(fā)現(xiàn)提示：MAML1的表達水平可能與腫瘤免疫逃逸、PD-1/PD-L1/CTLA1抑制劑治療的療效有關(guān)。

表1 MAML1與GEPIA 中免疫細胞基因標記之間的相關(guān)性

3 討論

靶向治療和免疫檢查點抑制劑治療為HER2陽性和MSI-H的晚期胃癌患者的治療帶來了新的曙光。然而，HER2陽性或MSI-H的胃癌患者不足10%，絕大部分患者并無明確的治療靶點；而且胃癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移涉及復(fù)雜多變的分子網(wǎng)絡(luò)及調(diào)控機制。因此，尋找新的分子標記物并探討其與腫瘤微環(huán)境的關(guān)系顯得尤其重要。本研究探索了NOTCH信號通路中的一個關(guān)鍵分子——MAML1在胃癌中的表達水平和其相關(guān)蛋白及腫瘤免疫浸潤細胞的關(guān)系，不僅拓展了NOTCH信號通路的研究內(nèi)容，而且為MAML1有可能成為胃癌預(yù)后指標、潛在治療靶點及免疫治療療效指標提供了理論基礎(chǔ)。

據(jù)報道，MAML1在食管鱗癌中異位過表達，且與食管癌患者的不良預(yù)后、腫瘤浸潤深度、腫瘤分化程度和腫瘤分期顯著相關(guān)[16-17]。敲低MAML1能夠下調(diào)CD44+腫瘤干細胞(cancer stem cells, CSCs)的遷移能力，并降低細胞對5-FU的耐藥性[18]，表明MAML1有可能成為靶向CSCs的食管癌治療靶點。該研究中，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)MAML1在胃癌組織中呈異常高表達，并且與較差的總體生存率密切相關(guān)。既往研究表明，NOTCH信號通路參與多種惡性腫瘤干細胞的自我更新、細胞增殖和分化[19- 20]，并介導(dǎo)了化療和靶向藥物的耐藥性[21- 22]。而MAML1作為NOTCH信號通路中的重要組成部分，介導(dǎo)了該途徑下游基因的激活和腫瘤的發(fā)生發(fā)展。此外，MAML1還是β-連環(huán)蛋白(β-catenin)，核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)和p53途徑的激活因子[23- 25]。Wnt/β-catenin、NF-κB和p53信號通路參與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、腫瘤耐藥及干細胞特性，其上述功能的發(fā)揮主要是通過在細胞核內(nèi)積聚，從而影響下游癌基因或抑癌基因的轉(zhuǎn)錄水平。該研究通過富集分析發(fā)現(xiàn)，MAML1相關(guān)蛋白主要分布在細胞核，并主要參與轉(zhuǎn)錄功能，與上述報道的機制及功能方向基本一致。由此可見，MAML1能夠介導(dǎo)多種信號通路和多種生物反應(yīng)之間的相互影響，有可能在胃癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和耐藥過程中發(fā)揮一定的生物學(xué)作用。

STRING分析發(fā)現(xiàn)細胞周期蛋白依賴性激酶8(cyclin-dependent kinase 8，CDK8)是MAML1的相互作用蛋白之一；同時，CDK8是急性粒細胞白血病的治療靶標[26]。SEL120- 34A是一種新型的CDK8抑制劑，能夠通過抑制STAT1 S727和STAT5 S726反式激活的磷酸化，從而抑制細胞增殖并影響干細胞特性[27]。該研究中，GEPIA分析發(fā)現(xiàn)MAML1表達水平與STAT3、STAT6、STAT5A顯著相關(guān)，或許也可能參與了SEL120- 34A的藥理作用，但需要進一步的體外和體內(nèi)實驗驗證。有研究表明，在人黑色素瘤細胞系M537中，敲低MAML1的表達能夠增加transwell小室中的NK和CD8+T細胞數(shù)量，從而影響腫瘤細胞的遷移能力[28]。該研究發(fā)現(xiàn)，MAML1的表達水平與B細胞、CD4+T細胞、巨噬細胞的浸潤水平具有顯著一致的相關(guān)性。對免疫細胞標志物的進一步分析表明，MAML1與PD-1、TIM3、CTLA4等T細胞耗竭的標志物之間亦存在顯著相關(guān)性。以上發(fā)現(xiàn)提示：MAML1可能參與調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，從而影響PD-1/PD-L1/CTLA4抑制劑的療效，因此有可能將來成為免疫治療的療效預(yù)測指標之一。

總之，我們首次揭示了MAML1在GC患者中異常高表達，可能是預(yù)后不良的預(yù)測因素。MAML1的作用蛋白參與多種分子生物學(xué)過程和信號通路，還可能在分子轉(zhuǎn)錄層面和調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境方面發(fā)揮了重要作用。深入研究MAML1及相關(guān)蛋白在胃癌中的功能及分子調(diào)控機制將有利于進一步了解胃癌的發(fā)病和耐藥機制，為尋找新的胃癌預(yù)后和治療靶標提供了理論依據(jù)。