翟崇凱，毛福超，張賀偉

（河南省動物疫病與公共衛(wèi)生工程研究中心，洛陽職業(yè)技術學院食品與藥品學院，河南洛陽 471003）

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS），是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）感染所致的一種豬急性高度接觸性傳染病。PRRSV 主要在豬肺泡和淋巴器官巨噬細胞中復制，引起母豬繁殖障礙、仔豬與育肥豬呼吸系統(tǒng)疾病，是我國優(yōu)先防治和重點防范的動物疫病之一[1]。近年來，高致病性豬繁殖與呼吸綜合征（HP-PRRS）頻發(fā)、死亡率高，嚴重影響?zhàn)B殖業(yè)發(fā)展[2]。PRRS 在全球大多數(shù)國家廣泛流行，流行毒株為PRRSV-1（歐洲種）和PRRSV-2（美洲種）。這兩種基因型的核苷酸序列同源性約為60%，同一種屬內(nèi)不同毒株核苷酸序列的變異率高達20%[3]。PRRSV 不同種之間存在顯著的抗原性差異，交叉反應少。PRRSV 具有毒株多樣性、基因易重組、抗體依賴增強效應（antibody-dependent enhancement，ADE）、中和抗體延遲效應、免疫抑制等復雜特點，導致目前PRRS 防控存在巨大困難和挑戰(zhàn)[4]。專家學者對PRRSV 病原學、進化和宿主免疫反應等進行了深入研究，但不斷出現(xiàn)的新PRRSV 變異毒株，使得目前獲得許可的疫苗在安全性和有效性方面存在一些問題，如毒力返強，不能產(chǎn)生針對異源病毒的交叉保護性免疫[5]。因此，只有密切關注PRRSV 流行變異情況，深入探究其免疫逃避和調(diào)節(jié)的分子機制，才能靶向開發(fā)出更安全更有效的疫苗。本文歸納了PRRSV 誘導宿主的免疫應答機制，總結了目前PRRSV 疫苗研究進展和面臨的挑戰(zhàn)，以期為PRRSV 新型疫苗研發(fā)提供參考。

1 國內(nèi)外流行毒株的重組進化和抗原變異

至今，PRRSV的起源仍然是未知的。北美（1987年）最早報道了PRRS，西歐（1990年）緊隨其后也暴發(fā)了PRRS。此后，PRRS 隨著商貿(mào)交通運輸?shù)韧緩窖杆僭谌澜绶秶鷥?nèi)廣泛流行[5]。1991年，荷蘭首次分離鑒定了PRRSV?；仡櫺匝芯勘砻鳎琍RRSV 抗體陽性樣本早在1979年就已存在，證實了PRRSV 在PRRS 被報道之前就已在豬群中傳播多年。自PRRSV 被報道以來，PRRSV 毒株不斷進化，其毒力和致病性各不相同[6]。PRRSV-1和PRRSV-2 在豬群中不斷進化，逃避宿主免疫系統(tǒng)，并不斷重組變異產(chǎn)生新的毒株，導致疫情新發(fā)。盡管PRRSV-1 的多樣性不如PRRSV-2，但進化方式基本相同，一些毒株的致病性也越來越強[7]。1996年PRRSV-2 強毒株VR2385 在原型毒株VR2332 報道后不久便被分離出來，其核苷酸序列與VR2332 的變異率約為8%[8]。2001年，美國鑒定出高毒力MN184 毒株，基因組核苷酸變異率約為14.5%[9]。2006年，中國南部和越南北部以及印度等地發(fā)現(xiàn)了HP-PRRSV。2008年美國首次發(fā)現(xiàn)了PRRSV-2 NADC30 毒株，隨后我國也分離出了類NADC30 毒株[10-11]。2010年，研究人員發(fā)現(xiàn)我國流行的PRRSV-1 高致病性毒株與PRRSV-1 原型毒株Lelystad 的核苷酸同源性僅為87%[11]。2020年，美國新發(fā)現(xiàn)了“高致病性”PRRSV 毒株（即PRRSV 1-4-4 L1C），該毒株具有RFLP 模式1-4-4，作為1C 譜系中的新型變體，與我國NADC34 毒株屬于同一亞型分支，致死率達17.5%[12]。

目前我國流行的PRRSV 以PRRSV-2 毒株為主，其致病性和基因組變異呈現(xiàn)多樣性。PRRSV-2至少可以分為5 個亞群，其中大多數(shù)毒株屬于亞群3[13]。1996年我國首次分離到PRRSV-2 毒株CH-1a[14]。2012年我國首次報道類NADC30 毒株[15]，2015年我國首次分離到類NADC30 毒株JL580[16]，并對其致病性進行了分析研究；自2016年以來，類NADC30 毒株已經(jīng)成為我國最主要的流行毒株，檢出率超過60%，類HP-PRRSV 次之[17]。此外，我國類NADC30 毒株基因組復雜，容易與類HP-PRRSV 毒株發(fā)生重組，且部分毒株為高致病性毒株，這大大增加了類NADC30 毒株感染的防控難度[18-20]。2017年我國首次報道在遼寧省豬群出現(xiàn)類NADC34 PRRSV 感染病例，隨后在黑龍江、福建、遼寧和河南4 個省份相繼發(fā)現(xiàn)類NADC34 PRRSV 感染病例[21-22]。近年來類NADC34 PRRSV 檢出比例在持續(xù)增加，從2017—2019年的陽性檢出率不足3%，驟升至2020年的11.5%，2021年高達28.6%，與類NADC30（35.4%）和HP-PRRSV（31.2%）共同成為我國的主要流行毒株[21，23]。研究[21]表明，我國部分新發(fā)類NADC34 PRRSV 與國內(nèi)流行毒株類NADC30 和類HPPRRSV 發(fā)生了復雜的基因重組，這可能是導致類NADC34 毒株在我國快速蔓延的原因之一。綜上所述，近來報道的致病性類NADC30 和類NADC34毒株在我國廣泛傳播，且變異重組速率較快。因此，需要對新發(fā)PRRSV 加大監(jiān)測力度和防控措施，從而降低新發(fā)毒株對養(yǎng)豬業(yè)的危害。

2 毒株生物學特性及中和抗原表位

PRRSV 是一種正鏈包膜RNA 病毒，屬于套式病毒目動脈病毒科β 動脈炎病毒屬[24]。PRRSV基因組大小約為15 kb，有10 個開放閱讀框（ORF），復制酶基因位于5'端，結構蛋白基因位于3'端。非結構蛋白編碼基因ORF1a 和ORF1b 占病毒基因組全長的2/3，分別編碼具有病毒復制酶和RNA聚合酶功能的2 個復制酶多聚蛋白（replicase pp1a and pp1ab），隨后在體內(nèi)多聚蛋白被蛋白水解酶裂解為16 個非結構蛋白（non-structural protein，NSP）：NSPlα、NSP1β、NSP2、NSP2TF、NSP2N、NSP3、NSP4、NSP5、NSP6、NSP7α、NSP7β 和NSP8～12。這些蛋白大多數(shù)組裝形成與膜相關的復制和轉錄復合物。PRRSV 結構蛋白包括包膜糖蛋白（glycoprotein，GP）、膜蛋白（membrane，M）和核衣殼蛋白（nucleocapsid，N），其中GP 包括GP2a-b、GP3、GP4、GP5 和GP5a。PRRSV 編碼的7 種糖蛋白中4 種為GP，即GP2a（ORF2a）、GP3（ORF3）、GP4（ORF4）和GP5（ORF5）[25]。

中和抗體是機體抵御病毒入侵的一類免疫球蛋白，也是疫苗發(fā)揮作用的主要效應分子。宿主和病毒結構/非結構蛋白的相互作用會影響病毒基因組的復制、轉錄以及免疫逃逸，只有更好地了解PRRSV 免疫應答和免疫逃避的分子機制，才能設計出更有效的疫苗。病毒結構蛋白和細胞受體之間的相互作用決定了病毒的組織嗜性和宿主范圍。目前PRRSV 的感染機制還不清楚。PRRSV 感染宿主細胞依靠特定的細胞受體和內(nèi)吞作用來完成病毒的生命周期。目前已報道了4 種PRRSV 細胞受體，即唾液酸黏附素、硫酸乙酰肝素、波形蛋白和清道夫受體CD163（cluster of differentiation 163，CD163）。唾液酸黏附素介導PRRSV 的內(nèi)化，它與M/GP5 復合物相互作用；硫酸乙酰肝素作為PRRSV 主要的附著因子，吸附PRRSV 到巨噬細胞上；CD163 協(xié)助波形蛋白促進病毒脫殼和內(nèi)化，在PRRSV 感染過程中發(fā)揮重要作用[26-28]。研究[29]發(fā)現(xiàn)，CD163 單克隆抗體能夠通過阻斷受體和抑制轉錄來降低PRRSV 的感染程度。PRRSV 感染豬2～4 周后才能檢測到中和抗體，表明病毒可以利用各種途徑逃避宿主的免疫監(jiān)控，延遲宿主免疫應答。感染豬體內(nèi)的PRRSV 要完全被清除需要150 d 或更長的時間[30-32]。

GP5 是一種高度糖基化蛋白，被認為是誘導中和抗體產(chǎn)生的主要蛋白靶點，也是第一個被鑒定出線性病毒中和表位的蛋白（37～45 aa），隨后在該蛋白的N 端胞外域也發(fā)現(xiàn)了具有中和活性的表位（32～34、38～39 和57～59 aa）[33]。病毒主要的中和作用關鍵位點在GP5 蛋白上的N 端功能區(qū)，而該功能區(qū)能夠通過“誘騙”表位和異質的糖基化作用隱藏關鍵性中和作用位點，從而阻礙或降低了機體針對病毒GP5蛋白中和表位的體液免疫反應。這種N 端聚糖遮蔽中和作用的特點是病毒免疫逃避及形成持續(xù)性感染的主要機制之一[34]。GP5 是誘導產(chǎn)生中和抗體能力最強的蛋白，此外其他結構蛋白如GP2、GP3、GP4 以及M 都存在病毒中和表位，具有病毒中和能力[35-36]。

前期研究[37]認為，PRRSV 感染早期由非結構蛋白2（non-structural protein 2，NSP2）和N 蛋白誘導產(chǎn)生的抗體不具有中和能力。但越來越多的研究[38-40]表明，NSP2 除了參與病毒復制和變異，還參與宿主免疫調(diào)控和誘導中和抗體產(chǎn)生。NSP2作為PRRSV 最大的非結構蛋白，變異性較高，特別是中間高變區(qū)域。PRRSV-1 和PRRSV-2 毒株均能夠發(fā)生NSP2 高變區(qū)氨基酸缺失，該現(xiàn)象與PRRSV 毒株進化和抗原變異密切相關。與PRRSV其他結構蛋白和非結構蛋白相比，NSP2 含有多個免疫顯性線性B 細胞表位，這些表位與病毒自然缺失或插入以及多變性有關，推測這些區(qū)域還有可能存在T 細胞表位[41-42]。NSP2 雖不是結構蛋白，但在病毒粒子內(nèi)部和表面均發(fā)現(xiàn)NSP2 亞型分子結構，尤其是在病毒雙膜囊泡（double-membrane vesicle，DMV）中的成熟和組裝過程中發(fā)揮著重要作用[43]。

NSP9 蛋白N 端與NSP8 相連，包含1 個與腺病毒RdRp 相關的核苷酸轉移酶結構域（NiRAN），C 端包含RdRp 結構域，其在PRRSV 的復制和毒力中起著至關重要的作用[44]。NSP9 序列高度保守，具有較強的免疫原性，含有T 細胞表位，有利于未來疫苗的開發(fā)。Parida等[45]在NSP9 中發(fā)現(xiàn)了兩個高度保守的七肽T 細胞表位，這為開發(fā)能夠對各種PRRSV 毒株提供廣泛交叉保護的免疫制劑提供了重要參考。此外，NSP9 的晶體結構作為肽疫苗研究的靶點，在新型肽疫苗開發(fā)中發(fā)揮著重要的作用[46]。PRRSV 結構/非結構蛋白的功能及其誘導中和抗體的作用見表1。

表1 PRRSV 結構/非結構蛋白的功能及其誘導中和抗體的作用

3 已獲批準的商業(yè)疫苗和正在研究的疫苗

PRRSV 疫苗主要包括改良活病毒疫苗（modified live virus，MLV）、滅活病毒疫苗、基因工程疫苗和免疫佐劑疫苗等。然而，已獲許可的商用疫苗的持久性和有效性均存在較多問題。尤其是，疫苗對國內(nèi)新發(fā)類NADC30 和類NADC34毒株保護作用有限。此外，2021年在山東省新發(fā)現(xiàn)的TZJ2134 毒株，經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)它是由2 株商業(yè)PRRSV-1 活疫苗（Amervac 疫苗株和DV 疫苗株）基因重組后的新毒株類DV+Amervac 重組亞群。目前MLV 1 疫苗不允許在我國使用，提示國內(nèi)PRRSV-1 流行防控也面臨著巨大壓力[47]。鑒于PRRSV 高頻突變和重組，致使變異毒株不斷出現(xiàn)，現(xiàn)有疫苗無法提供完全保護，使得PRRSV 在全球范圍內(nèi)廣泛流行。因此，需要繼續(xù)開發(fā)新的有效的疫苗來靶向不斷進化的PRRSV，這是重要的PRRS 防控措施。近年來，多種新技術被用于開發(fā)新型PRRSV 疫苗，尤其是嵌合疫苗、肽疫苗和納米疫苗，為未來PRRSV 疫苗設計提供了新思路。已獲批準的商業(yè)疫苗和正在研究的PRRSV 疫苗詳見表2。

表2 已獲批準的商業(yè)疫苗和正在研究的PRRSV 疫苗

3.1 MLV 疫苗

1994年，北美首次引入了基于PRRSV-2 的MLV 疫苗，幾年后歐洲引入了基于PRRSV-1 的MLV 疫苗?；赑RRSV-1 開發(fā)的MLV 1 疫苗，主要在西歐PRRSV-1 流行的國家獲得許可。而基于PRRSV-2 開發(fā)的MLV 2 疫苗，主要在美國、中國和韓國等PRRSV-2 流行國家獲得許可[48]。MLV疫苗免疫作為控制PRRSV 感染的主要手段，已經(jīng)在臨床上應用了20 多年。盡管MLV 疫苗對部分毒株具有良好的保護效果，但疫苗的免疫原性、交叉保護效果和安全性仍是臨床上十分突出的問題，其對PRRS 防控效果有限[49-50]。

MLV 疫苗能夠對同源PRRSV 毒株引起的感染提供有效但滯后的保護，而對異源毒株僅提供部分保護或完全沒有保護，其保護效力取決于PRRSV 毒株的生物學特性[51-52]。MLV 疫苗的毒力返強和持續(xù)傳播感染在臨床上受到高度關注，這可能會加速病毒突變或重組以適應宿主并逃避免疫反應，增加致病風險。目前已證實接種MLV 疫苗的豬群會出現(xiàn)長達4 周的病毒血癥期，導致疫苗毒在未接種豬群間垂直和水平傳播[53]。此外，有報道[54-56]稱，MLV 疫苗株能夠與野生毒株發(fā)生基因重組，這加劇了MLV 疫苗潛在的生物安全性問題。

大多數(shù)亞洲國家（如中國和韓國）的PRRSV-1 和PRRSV-2 均為致病性流行毒株，如果聯(lián)合接種MLV 1 和MLV 2 疫苗，可能會顯著降低MLV 2 疫苗的保護效力[48]。因此，需要科學制定MLV 疫苗的接種程序。研究[57]表明，弱毒疫苗免疫豬群后攻毒PRRSV，未觀察到ADE 效應。但由于PRRSV 存在ADE 效應，因此部分學者依然認為MLV 疫苗可能誘導ADE 效應，增加豬群PRRSV 的感染風險[58-59]。MLV 疫苗接種后首先產(chǎn)生的PRRSV 特異性抗體大多是非中和性抗體，可能存在潛在ADE 的窗口期。若在ADE 窗口期發(fā)生PRRSV 感染，這些免疫早期產(chǎn)生的非中和性抗體可能會誘發(fā)ADE 并加劇感染程度，目前MLV疫苗誘導ADE 的機制尚不清楚[5]。

將國內(nèi)流行的類NADC30 SD 毒株在Marc-145 細胞中連續(xù)傳代獲得減毒SD-R 毒株，將其免疫接種豬群2 周后，用類NADC30 PRRSV 攻毒未發(fā)現(xiàn)明顯發(fā)熱，免疫組病理病變程度較攻毒對照組更輕，病毒滴度明顯低于攻毒對照組[60]。上述結果提示，可以通過定向減弱特定地區(qū)流行毒株來進行PRRSV 疫苗毒株的篩選，從而使疫苗能為特定流行地區(qū)的仔豬提供完全的臨床保護，以抵抗區(qū)域性PRRSV 傳播。另有研究[61]表明，Prevacent PRRS MLV 疫苗對NC174 或NADC30（均為譜系1）、VR2332（譜系5）或NADC20（譜系8）PRRSV-2 毒株中的3 種（NADC20、NADC30 和VR2332）均誘導產(chǎn)生了中和抗體，但未能完全保護豬群免受感染。盡管目前使用的MLV 疫苗免疫后均無法完全阻止PRRSV 感染，交叉保護效力不足，但其能在一定程度上降低病毒滴度，縮短排毒時間。

為了提高MLV 疫苗的免疫保護效力，評估了多種策略的增強效果，如佐劑類型和細胞因子調(diào)節(jié)劑（如中藥提取物）。Montanide TM gel01 佐劑能夠誘導產(chǎn)生更高的PRRSV 特異性中和抗體，增強疫苗對同源PRRSV 的保護效果。新型肽納米纖維水凝膠能夠誘導機體產(chǎn)生更高滴度的中和抗體和更強的IFN-γ 細胞免疫反應，使得新型肽納米纖維水凝膠成為MLV 疫苗的良好佐劑[62]。魚腥草提取物顯著提高了PRRSV-1 MLV 疫苗IFN mRNA 表達水平，并降低HP-PRRSV-2 攻毒后的病毒血癥[63]。此外，目前常用的另一種增強策略是通過基因工程構建嵌合疫苗，從而定制MLV 疫苗。

3.2 滅活疫苗

滅活疫苗盡管安全性較高，已在世界范圍內(nèi)獲得許可，但其對同源和異源病毒的保護效力卻非常有限。研究[64]發(fā)現(xiàn)，滅活疫苗不足以激發(fā)機體產(chǎn)生足夠的特異性中和抗體，中和抗體滴度通常低于8，且無法誘導或僅誘導微弱的細胞免疫反應，不能有效清除病毒。因此，美國等多數(shù)西方國家均不再提供該類疫苗[51]。但有研究[65]表明，滅活疫苗在防控PRRS 的垂直和水平傳播中發(fā)揮著重要作用。PRRSV 血清陽性的母豬反復暴露或長期免疫滅活病毒能夠增強機體抗PRRSV 免疫力，且能夠顯著提高母豬繁殖性能。與活疫苗相比，滅活疫苗具有更安全、更穩(wěn)定、更容易儲存等特點[66]。養(yǎng)殖場自家滅活疫苗能夠有效減輕臨床癥狀，縮短病毒血癥期。部分科學家對PRRSV 滅活疫苗充滿了信心，通過嘗試不同的病毒滅活策略、佐劑、基于納米顆粒的疫苗傳遞系統(tǒng)及接種方式等，以期研發(fā)出高效的PRRSV 滅活疫苗。

將PRRSV 滅活疫苗與CpG 寡脫氧核苷酸佐劑共同免疫豬群，可誘導動物機體產(chǎn)生高水平的中和抗體、細胞免疫應答以及促進IFN-γ 和IL-6 的分泌[67]。研究[68]表明：將通過紫外線照射和二乙基亞胺（BEI）不同滅活途徑滅活的PRRSV 與水包油佐劑混合后制成的滅活疫苗均能夠誘導機體產(chǎn)生中和抗體；而通過BEI 滅活的PRRSV 與不完全弗氏佐劑制成的滅活疫苗能夠誘導機體產(chǎn)生高滴度的中和抗體，且能夠將病毒血癥期縮短1 周。目前尚無理想的PRRSV 滅活疫苗，主要是因為PRRSV滅活疫苗無法高效遞呈抗原至免疫系統(tǒng)。近年來，納米技術在疫苗研發(fā)中被廣泛應用，這是利用了納米技術能夠提高抗原遞呈效率的特點，從而大大提升PRRSV 滅活疫苗的保護效力。Binjawadagi等[69]利用納米顆粒包裹PRRSV 滅活毒株與佐劑聚乳酸-乙醇酸或結核分枝桿菌裂解物制成納米滅活疫苗，鼻內(nèi)接種免疫豬群后能夠對異源PRRSV毒株產(chǎn)生較好的交叉保護效果。Chaikhumwang等[70]也研究證實了聚乳酸（PLA）納米顆粒能夠增強滅活疫苗的免疫效果。因此，基于納米顆粒的疫苗傳遞系統(tǒng)為增強滅活PRRSV 疫苗的免疫效果提供了新思路。

3.3 嵌合疫苗

自1998年PRRSV 反向遺傳系統(tǒng)被報道以來，研究人員通過定點誘變，刪除病毒基因或基因片段，插入外源基因，以及在PRRSV 毒株之間或PRRSV 與其他病原之間交換基因片段，已經(jīng)構建了眾多的PRRSV 感染性cDNA 克隆以及嵌合毒株。嵌合疫苗能有效解決PRRSV 異源毒株交叉保護率低的問題，與其他毒株重組率低，較MLV 疫苗更安全。

PC 嵌合疫苗含有鑒別診斷（DIVA）的基因標記，能夠鑒別PRRSV 野毒和疫苗株。通過將PRRSV SP 經(jīng)典株的非結構蛋白基因和HP-PRRSV GD 毒株的結構蛋白基因整合，利用反向遺傳技術拯救出PRRSV 嵌合疫苗株。PC 疫苗安全性良好，未見水平傳播、排毒和毒力返強現(xiàn)象，是一種較為安全的PRRSV 嵌合疫苗[71]。將假單胞菌氨基酸序列KDEL（K3）整合入PRRSV 基因片段中，構建的嵌合疫苗PE-K13 能夠有效誘導豬產(chǎn)生特異性中和抗體和細胞免疫[72]。將低致病性PPRSV HB-1/3.9 株非結構蛋白 NSP2、以及結構蛋白GP5 和M 與高致病性PRRSVJXwn06 株對應區(qū)域的蛋白相互置換，發(fā)現(xiàn)構建的嵌合株 HB-1/3.9/JXwn06 可以產(chǎn)生針對HB-1/3.9 和JXwn06 株的交叉中和反應[39]。Tian等[73]將6 株異源PRRSV 毒株的ORF 3～6 重組到PRRSV-VR2385 骨架中，發(fā)現(xiàn)構建的新型嵌合病毒對多種異源毒株表現(xiàn)出更好的交叉保護功效。Choi等[74]將PRRSV-2 LMY毒株的結構蛋白基因替換FL12 相應結構蛋白基因，構建了基因工程嵌合疫苗K418DM。攻毒結果顯示：K418DM 對同源攻毒可提供高水平保護效果，顯著降低3 dpc 和7 dpc 時病毒血癥水平和肺損傷程度；對異源攻毒提供了延遲保護效果，顯著降低14 dpc 時病毒血癥水平。另有研究[75]針對韓國流行毒株PRRSV-1，利用逆向遺傳學技術將KU-PRRSV-2020-002 毒株的GP5 外域區(qū)域替換為CSNA11 的GP5 外域區(qū)域，從而開發(fā)出低糖基化嵌合病毒候選疫苗株vCSL1-GP5-N33D。該嵌合株vCSL1-GP5-N33D 滅活疫苗能夠誘導產(chǎn)生高水平的中和抗體滴度，表明vCSL1-GP5-N33D 嵌合疫苗是一種前景廣闊的候選疫苗，可有助于控制韓國PRRSV-1 的流行。

因此，嵌合疫苗可以應用于新發(fā)PRRSV 毒株的疫苗開發(fā)研究。盡管嵌合疫苗具有良好的異源交叉保護效力，但這種保護往往不足以完全預防高變異的PRRSV 感染，因此開發(fā)出一種有效的候選嵌合疫苗還有很長的路要走，但嵌合疫苗為未來疫苗開發(fā)提供了一種新方法，具有廣闊的應用前景。

3.4 基因工程疫苗

新型PRRSV 基因工程疫苗主要包括DNA 疫苗、亞單位疫苗、肽疫苗以及多種病毒載體和細菌載體疫苗。目前多數(shù)基因工程疫苗具有一定的保護作用，其保護效力不及MLV 疫苗，與較理想疫苗仍存在較大差距。DNA 疫苗和亞單位疫苗有望成為MLV 疫苗和滅活疫苗的增強劑，能夠在一定程度上提高疫苗的保護作用。表達PRRSV N 蛋白DNA 質?；騺唵挝灰呙缁虿《据d體疫苗可用于增強MLV 疫苗的特異性免疫反應，增加中和抗體和特異性IFN-γ 滴度[76]。GP5 DNA 疫苗免疫豬群后誘導產(chǎn)生了特異性抗體和IFN-γ，但未能提供完全保護[70]。重組PRRSV GP3 和GP5 DNA 疫苗pVAX-GP35 與佐劑皂苷提取物-水-油-水混合后免疫接種豬群，誘導產(chǎn)生了較高水平的中和抗體和IL-4、IFN-γ、IL-2、IL-10[77]。

基于重組病毒基因組的PRRSV 病毒載體疫苗成為除嵌合疫苗外的另一種MLV 疫苗優(yōu)化方案。病毒疫苗載體能夠誘導黏膜免疫，為PRRSV 黏膜疫苗的研究和開發(fā)奠定了理論基礎。目前常用的病毒載體主要包括偽狂犬病病毒、傳染性胃腸炎病毒、痘病毒、腺病毒。傳染性胃腸炎病毒載體能夠高水平表達PRRSV 外源蛋白GP5 和M，誘導IFN-α分泌和產(chǎn)生較低水平的中和抗體，攻毒后保護效果有限[78]。其他病毒載體疫苗的免疫效果相當，均未能完全保護豬群免受感染。病毒載體疫苗免疫效果有限的主要原因可能是病毒載體對PRRSV 抗原的表達不穩(wěn)定，需要進一步篩選穩(wěn)定表達中和抗原表位的抗原小結構域，從而提高疫苗抗原遞呈總量。PRRSV 含有T 細胞表位的結構/非結構蛋白（如M、NSP9 和NSP5），是開發(fā)肽疫苗的關鍵靶標分子[79]，但其免疫保護效力需要深入研究評估。

3.5 干擾素誘導激活的疫苗

為了解決PRRSV 的免疫逃逸問題，研究者開發(fā)出干擾素誘導激活的PRRSV 候選疫苗，該疫苗能夠特異性誘導干擾素產(chǎn)生，增強疫苗免疫保護效力。PRRSV-A2MC2 作為中等毒性的候選疫苗株，與VR-2332 和Ingelvac PRRS MLV 的同源性高達99.8%。PRRSV-A2MC2 能夠在Marc-145 和PAM細胞中誘導IFN，但A2MC2 誘導IFN 的分子機制尚不清楚[80]。將PRRSV-A2MC2 在Marc-145 細胞中連續(xù)傳代90 次，獲得致弱毒株A2MC2-P90；A2MC2-P90 不僅保留了PRRSV-A2MC2 誘導IFN的能力，且能夠誘導更高水平的中和抗體，還能夠保護豬群免受同源毒株VR-2385 的攻擊[81]。A2MC2-P90 對異源毒株的研究[82]結果表明，在強毒攻擊仔豬后，A2MC2-P90 疫苗誘導了快速的體液免疫反應，產(chǎn)生的中和抗體滴度更高，顯著降低了病毒血癥水平，對HP-PRRSV 毒株XJA1 具有良好的保護作用。A2MC2-P90 作為一種新型候選疫苗毒株，對異源PRRSV 毒株具有廣泛的保護譜。

PRRSV-con 由59 個野生型PRRSV-2 高頻序列經(jīng)人工合成而來，其復制效率與原型毒株FL12一致。PRRSV-con 與A2MC2 的特性相似，也能夠在細胞中誘導產(chǎn)生IFN，但誘導IFN 的分子機制不同。PRRSV-con 接種豬群后，誘導機體產(chǎn)生更廣泛的異源保護水平[83]。其他研究者[84]開發(fā)的MLV-129p-IFNmix 候選疫苗株也能夠快速誘導IFN合成。因此，具有干擾素誘導激活的A2MC2、PRRSV-Con 和MLV-129p-IFNmix 的候選毒株對未來PRRSV 疫苗開發(fā)設計提供了新材料。

3.6 納米疫苗

納米疫苗作為一種新型疫苗載體，在治療或者預防傳染病和腫瘤中具有廣泛的應用前景。納米疫苗顆粒粒徑一般在1～1 000 nm，更易于集中在淋巴結、脾臟等淋巴器官中，此外納米粒徑與病原體相近，使得納米疫苗更容易被抗原呈遞細胞攝取，并且可以將抗原靶向遞送至特異性免疫細胞。同時，納米疫苗能夠激活特異性T 細胞，繼而可以殺傷病變細胞。目前常用的納米疫苗材料主要包括脂質納米顆粒、自組裝蛋白質納米顆粒、聚合物納米顆粒、無機納米載體和仿生納米顆粒。自組裝蛋白質納米顆粒包括鐵蛋白家族蛋白質、丙酮酸脫氫酶（E2）和病毒樣顆粒（VLP），近年來被廣泛應用于納米疫苗的開發(fā)應用。有研究[85]將GP5 和鐵蛋白融合表達后構建了GP5m-鐵蛋白納米顆粒疫苗，并證實該GP5m-鐵蛋白疫苗誘導的血清抗體滴度顯著高于PRRSV 滅活疫苗，表明使用多個抗原拷貝的納米疫苗能夠產(chǎn)生更有效和持久的免疫反應。此外，該納米疫苗還能夠促進Th1 主導的細胞免疫反應并增強特異性T 淋巴細胞免疫反應。

馬賽克（Mosaic）疫苗利用鑲嵌的方式進行設計，通過向免疫系統(tǒng)呈現(xiàn)密集的抗原表位陣列，有效刺激機體的體液免疫和細胞免疫，從而產(chǎn)生持久的免疫。將PRRSV GP5-Mosaic 序列制備脂質體DNA Mosaic 納米疫苗免疫豬群后，可以顯著提高IFN-γ mRNA 轉錄水平和中和抗體水平，能夠部分免受VR2332、NADC9、NADC30 和SDSU73感染，提示GP5-Mosaic 疫苗能夠對不同毒株產(chǎn)生部分交叉保護[86]。有研究[87]開發(fā)了冠狀病毒“Mosaic-8”多功能納米疫苗，通過將SARSCoV-2 和其他7 種類似SARS 的乙型冠狀病毒的刺突蛋白片段置于蛋白質納米顆粒結構上，誘導產(chǎn)生廣泛的交叉反應抗體，從而保護人們免受新冠病毒未來變種、SARS、MERS 等冠狀病毒新毒株的影響。在SARS Mosaic 和HIV Mosaic 納米疫苗的啟發(fā)下，結合PRRSV 易突變和高重組的特點，以期開發(fā)出一種包括來自多種PRRSV 毒株的多結構蛋白的多拷貝Mosaic 嵌合納米疫苗，預期對PRRSV多種異源毒株具有良好的交叉保護效果[88]。綜上，自組裝納米疫苗和Mosaic 納米疫苗為PRRSV 新型疫苗研究指明了新方向。

4 小結與展望

PRRS 作為全球流行性豬病，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失。自20 世紀80年代以來，研究人員對PRRSV 免疫保護機制和疫苗改進策略進行了深入研究，但至今理想的PRRSV 疫苗仍未研發(fā)成功。PRRSV 高頻突變和重組，導致變異毒株不斷涌現(xiàn)，這增加了PRRS 的防控難度，阻礙了疫苗研究進展。PRRSV 毒株中和性表位、中和表位糖基屏蔽、異源毒株共同中和表位以及免疫保護分子機制仍不十分清楚，這極大限制了新型疫苗的研發(fā)速度。MLV 疫苗仍然是目前控制PRRSV 感染的最優(yōu)選擇。特別是干擾素誘導激活的PRRSV MLV疫苗候選疫苗株的出現(xiàn)，為開發(fā)具有異源交叉保護能力的PRRSV 新型嵌合疫苗奠定了基礎。自組裝蛋白質納米顆粒制備簡單，抗原遞送效率高，被廣泛應用于各類疾病防治，為新型PRRSV 疫苗研發(fā)提供了新思路。盡管當前PRRSV 疫苗在安全性和異源保護效力方面有諸多局限性，但是通過改良佐劑，改進接種方式，改良MLV 疫苗和滅活疫苗，基于蛋白組學開發(fā)肽疫苗，基于蛋白納米遞送系統(tǒng)以及外泌體遞送系統(tǒng)等開發(fā)新型PRRSV 疫苗，將有望加快終結PRRS 的全球流行。