李 巖 李成明 張明童 李冬華 馬 瀟

1.甘肅省藥品監(jiān)督管理局審核查驗(yàn)中心，甘肅 蘭州 730030；2.甘肅省中醫(yī)院藥學(xué)部，甘肅 蘭州 730050； 3.甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院(甘肅省中藏藥檢驗(yàn)檢測技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，國家藥品監(jiān)督管理局中藥材及飲片質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)，甘肅 蘭州 730070；

宣肺止嗽合劑收錄于2020年版《中國藥典》(一部)中，由蜜罌粟殼、荊芥、前胡、桔梗等10味中藥組成，具有疏風(fēng)宣肺、止咳化痰之功，用于治療風(fēng)邪犯肺證咳嗽，癥見咳嗽、咽癢、鼻塞流涕、惡寒發(fā)熱、咯痰[1]。該制劑中含有蜜罌粟殼，其主要成分為嗎啡、磷酸可待因、蒂巴因、鹽酸罌粟堿等多種生物堿成分。嗎啡具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)咳和抑制呼吸等藥理作用[2-4]，磷酸可待因、蒂巴因和鹽酸罌粟堿也具有顯著的止咳、鎮(zhèn)痛作用[5]，說明罌粟殼是通過多種成分發(fā)揮作用。但是，嗎啡及其其他生物堿成分連續(xù)服用易產(chǎn)生依賴性、癮癖，超劑量使用會出現(xiàn)呃逆、呼吸困難、昏迷等中毒癥狀。因此，為了確保制劑的安全性及有效性，需要確定可供質(zhì)量控制的特征成分，制定質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。2020年版《中國藥典》(一部)對宣肺止嗽合劑含量測定項(xiàng)中，采用高效液相色譜(HPLC)法控制蜜罌粟殼中的嗎啡含量，且前處理過程繁瑣、費(fèi)時，并易造成樣品中生物堿的損失，同時由于樣品中嗎啡含量較低，其他成分對其影響較大。因此，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法同時測定宣肺止嗽合劑中4種生物堿(嗎啡、磷酸可待因、蒂巴因、鹽酸罌粟堿)含量，以完善、提升宣肺止嗽合劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters e2695型高效液相色譜儀(美國Waters公司)；ME24-102型萬分之一電子天平、XS205DU十萬分之一型電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；KQ-250E數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 材料 嗎啡對照品(批號：171201-201324，含量≥93.9%)、磷酸可待因(批號:171203-200303，含量≥96.9%)、蒂巴因(批號:171216-200403，含量100.0%)、鹽酸罌粟堿(批號:171214-200404，含量≥99.9%)均購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈為色譜純，磷酸為優(yōu)級純，甲醇為分析純，水為超純水。宣肺止嗽合劑10批(甘肅普安制藥有限公司提供)。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液 精密稱取嗎啡0.01130 g、磷酸可待因0.01047 g，蒂巴因0.01660 g、鹽酸罌粟堿0.01088 g，分別置于25 mL量瓶中，加甲醇超聲使其溶解，并定容至刻度，搖勻，制成對照品儲備液。再各取適量置50 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，制得含嗎啡8.4886 μg·mL-1、磷酸可待因2.0293 μg·mL-1、蒂巴因0.3220 μg·mL-1、鹽酸罌粟堿0.5217 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液 精密量取宣肺止嗽合劑樣品1 mL，用氨試液10 mL調(diào)節(jié)pH值至10～11，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次25 mL，合并正丁醇液，回收溶劑至干，殘?jiān)恿鲃酉噙m量使溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL棕色量瓶中，加5%磷酸的20%甲醇至刻度，搖勻，即得。同時制得空白對照溶液。

2.2 色譜條件 色譜柱：安捷倫SB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相：乙睛-0.1%磷酸溶液(3∶97)；檢測波長：210 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。色譜圖如圖1所示。

(A)對照品色譜圖 (B)供試品色譜圖 (C)空白溶液色譜圖1.蒂巴因；2.嗎啡；3.鹽酸罌粟堿；4.磷酸可待因 圖1 HPLC 色譜圖

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品儲備液適量，加甲醇溶液配制成嗎啡含量為0.849 μg·mL-1、1.698 μg·mL-1、3.395 μg·mL-1、8.489 μg·mL-1、16.977 μg·mL-1、84.886 μg·mL-1，磷酸可待因含量為0.203 μg·mL-1、0.406 μg·mL-1、0.812 μg·mL-1、2.029 μg·mL-1、4.059 μg·mL-1、20.293 μg·mL-1，蒂巴因含量為0.033 μg·mL-1、0.066 μg·mL-1、0.133 μg·mL-1、0.332 μg·mL-1、0.664 μg·mL-1、3.320 μg·mL-1，鹽酸罌粟堿含量為0.052 μg·mL-1、0.104 μg·mL-1、0.209 μg·mL-1、0.522 μg·mL-1、1.043 μg·mL-1、5.217 μg·mL-16個梯度濃度的混合對照品溶液，按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件分析，分別進(jìn)樣10 μL。按外標(biāo)兩點(diǎn)法，以峰面積為橫坐標(biāo)，進(jìn)樣量(μg·mL-1)為縱坐標(biāo)，得出4種成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)r2及線性范圍，結(jié)果表明，各成分在各自濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。見表1。

表1 4種生物堿的回歸方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)表

2.3.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取濃度為嗎啡8.4886 μg·mL-1、磷酸可待因2.0293 μg·mL-1、帝巴因0.3320 μg·mL-1、鹽酸罌粟堿0.5217 μg·mL-1混合對照品溶液10 μL，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，測得峰面積積分值的RSD在0.22%～0.45%，表明儀器精密度良好。見表2。

表2 4種生物堿成分的精密度、重復(fù)性及穩(wěn)定性結(jié)果表 (n=6)

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取編號1的供試品溶液，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，“2.2”項(xiàng)下色譜條件分析測定，分別測定并計(jì)算各成分的含量。測定結(jié)果RSD在1.35%～2.11%，表明方法重復(fù)性良好。見表2。

2.3.4 穩(wěn)定性考試驗(yàn) 取編號1的供試品溶液，分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h進(jìn)樣10 μL進(jìn)行測定，測得各成分的含量RSD在0.56%～0.65%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。見表2。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 采用加樣回收法，取已知4種生物堿含量的宣肺止嗽合劑(編號1)樣品9份，分3組，取樣量各為1 mL，精密加入低、中、高(0.5倍、1倍、1.5倍)3個濃度的混合對照品，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算回收率。詳見表3。嗎啡、磷酸可待因、蒂巴因、鹽酸罌粟堿的平均加樣回收率分別為97.8%、96.9%、97.4%、97.5%，RSD分別為1.2%、1.2%、1.6%、1.4%。

表3 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表 (n=9)

表3(續(xù))

2.4 樣品的測定 取10批次宣肺止嗽合劑，分別精密量取2 mL，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，以“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，按外標(biāo)法計(jì)算樣品中嗎啡、磷酸可待因、蒂巴因、鹽酸罌粟堿的含量。結(jié)果見表4。

表4 樣品含量測定結(jié)果表 (n=4)

3 討論

3.1 供試品溶液制備條件的優(yōu)化 本方法采用加濃氨試液，在堿性條件下將生物堿鹽轉(zhuǎn)變成游離生物堿，用水飽和的正丁醇提取，去除脂溶性雜質(zhì)，再用含5%磷酸的20%甲醇溶液提取。為了優(yōu)化提取的條件,以A(供試品溶液取樣量)、B(氨試液使用量)和C(水飽和正丁醇提取量)為3個因素，設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)。各因素的3水平分別為:A(1 mL、2 mL、3 mL);B(5 mL、10 mL、15 mL);C(15 mL、25 mL、35 mL)。樣品液的制備:精密量取宣肺止嗽合劑樣品A取樣量，用氨試液提取量B調(diào)節(jié) pH 值至10～11，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次使用量C,合并正丁醇液，回收溶劑至干，殘?jiān)恿鲃酉噙m量使溶解,轉(zhuǎn)移至10 mL棕色量瓶中，加5%磷酸的20%甲醇至刻度，搖勻，即得。經(jīng)微孔濾膜(0.45 μm)過濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液進(jìn)行測定分析。極差(R)結(jié)果表明,3個因素中樣品量對提取率影響最大，其次是氨試液提取量，影響最小的是樣品水飽和正丁醇提取量。試驗(yàn)表明，以宣肺止咳合劑取樣量為1 mL，加入氨試液10 mL后用25 mL水飽和正丁醇提取量條件最佳，提取率最高，故確定為供試品制備方法 。

3.2 測定波長的選擇 通過DAD檢測器進(jìn)行全波長掃描(200～400 nm)，考察了4個組分的最大紫外吸收波長，結(jié)果發(fā)現(xiàn)嗎啡、磷酸可待因、蒂巴因都在210 nm波長處有最大吸收、鹽酸罌粟堿250 nm波長處具有最大吸收，考慮可待因與蒂巴因含量較低，為獲得更大靈敏度，最終確定210 nm作為檢測波長，四種生物堿均有良好的響應(yīng)，靈敏度較高。

3.3 流動相的優(yōu)化 中國藥典選用0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液-0.005 moL/L庚烷磺酸鈉溶液-乙腈(5∶5∶2)作為流動相，考慮到庚烷磺酸鈉對色譜系統(tǒng)污染較大，并且樣品對色譜柱的要求較高。因此通過優(yōu)化方法降低了對色譜系統(tǒng)的污染。經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料[6-10]，本實(shí)驗(yàn)主要考察了甲醇-0.05%磷酸水、乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.1%磷酸的0.01 moL·L-1磷酸二氫鉀緩沖液、乙腈-0.1%甲酸的0.02 mol·L-1乙酸銨溶液4種流動相，結(jié)果表明，乙睛-0.1%磷酸溶液樣品中，雖然嗎啡和鹽酸罌粟堿的色譜峰出峰時間較為接近，但各色譜峰的分離度均大于1.5，且各色譜峰的峰形較好，故以此流動相比例進(jìn)行測定，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步對流動相進(jìn)行優(yōu)化。

3.4 結(jié)果分析 10批宣肺止嗽合劑測定結(jié)果顯示，嗎啡的含量為0.078～0.160 mg·mL-1、磷酸可待因的含量為0.008～0.025 mg·mL-1、蒂巴因的含量為0.0002～0.0013 mg·mL-1、鹽酸罌粟堿的含量為0.010～0.025 mg·mL-1，且4種成分間存在一定的變化趨勢：即嗎啡含量高，其他3個成分的含量也隨之增加；可見《中國藥典》以嗎啡的含量測定對宣肺止嗽合劑質(zhì)量進(jìn)行控制，具有一定的意義，但不夠用全面。本研究建立了高效液相色譜同時測定宣肺止嗽合劑中4種成分的含量測定方法，具有前處理簡單，靈敏度高的特點(diǎn)，為較為全面的控制宣肺止嗽合劑質(zhì)量，提供了數(shù)據(jù)支持，同時對修訂完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，保證藥品有效性和安全性提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。