劉瑾如，邱衛(wèi)華

（1.中國科學(xué)院過程工程研究所生化工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100190；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院農(nóng)業(yè)工程系，北京 100083）

近年來，全球范圍內(nèi)糖尿病的發(fā)病率逐年增高，預(yù)計到2045年，全球?qū)薪邇|糖尿病患者[1]。我國的糖尿病患者人數(shù)居世界首位，其中90%～95%為II型糖尿病[2-4]。α-葡萄糖苷酶抑制劑可通過抑制糖苷酶活性降低和延緩餐后血糖的上升，并且能有效延緩糖尿病前期患者向II型糖尿病的發(fā)展[5]。目前臨床上常用的α-葡萄糖苷酶抑制劑藥物主要是阿卡波糖、伏格列波糖、米格列醇等。但是這些藥物普遍會產(chǎn)生一些副作用，如低血糖、水腫、乳酸中毒、胃腸道不耐受，甚至對肝臟的不良影響等[6-7]。因此，開發(fā)新型多靶點(diǎn)、安全價廉、高效的α-葡萄糖苷酶抑制劑成為研究的熱點(diǎn)[8]。

桑葉在我國分布廣泛，含有黃酮類、生物堿類、多糖類、氨基酸類等多種生物活性物質(zhì)，是典型的藥食兩用資源[9-10]。作為桑葉的主要功能成分之一，黃酮類物質(zhì)是桑葉發(fā)揮降血糖、降血壓、抗氧化、抗衰老等作用的主要成分[11-13]。近年來，國內(nèi)外開展了大量桑葉黃酮（mulberry leaf flavonoids，MLF）對 II型糖尿病治療作用的研究，并發(fā)現(xiàn)MLF具有抑制α-葡萄糖苷酶活性、降低胰島素抵抗、增加葡萄糖消耗和骨骼肌線粒體功能等作用[14-17]。因此，MLF在糖尿病治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。但是，現(xiàn)有桑葉的研究大都是基于干制品開展的。在干燥過程中，黃酮等熱敏性活性物質(zhì)的含量和活性都會有不同程度損失。多部醫(yī)藥古籍中也有關(guān)于“生者優(yōu)良”的觀點(diǎn)，即在新鮮狀態(tài)下可以更好地保持植物中活性成分的活性和功效[18-19]。因此，開展新鮮桑葉的相關(guān)研究有助于拓寬桑葉的應(yīng)用前景。

冠突散囊菌（Eurotium cristatum）亦稱之為“金花”，是屬于散囊菌目發(fā)菌科散囊菌屬的一種無毒且安全的益生真菌，已被廣泛應(yīng)用于福磚黑茶[20]、沙棘葉[21]、紅豆[22]等的生物和風(fēng)味化合物的形成或轉(zhuǎn)化中。據(jù)報道它在植物的發(fā)酵過程中可分泌包括α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、纖維素酶、蛋白酶等多種酶。這些酶不僅可以促進(jìn)原料中易發(fā)酵物質(zhì)的降解，增加植物中活性成分的含量，還可以改善活性成分的功能[23-24]。目前已有許多關(guān)于冠突散囊菌發(fā)酵提高原料中總黃酮含量的報道，包括桑葉、銀杏葉、葛根、黑豆等[24-27]。因此，本文以自行篩選得到的冠突散囊菌E.cristatum CY-1進(jìn)行鮮桑葉的固態(tài)發(fā)酵，研究了發(fā)酵對桑葉黃酮的含量及其對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響，以期達(dá)到通過微生物發(fā)酵實(shí)現(xiàn)桑葉中黃酮物質(zhì)的富集，并提高其抗血糖功效的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冠突散囊菌E.cristatum CY-1：中國科學(xué)院過程工程研究所生化工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自行篩選得到；鮮桑葉：市售；α-葡萄糖苷酶（酵母來源）、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）、4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，pNPG，純度≥99%）、氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（純度≥99%）：上海源葉生物科技有限公司；二硝基水楊酸、乙酰丙酮、對二氨基苯甲醛、亞硝酸鈉、硝酸鋁、NaOH、無水乙醇（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MB-96B型酶標(biāo)分析儀：蘇州聘懷科技有限公司；H2050R-1型高速冷凍離心機(jī)：湘儀離心機(jī)儀器有限公司；754PC型紫外-可見分光光度計：上海菁華科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 冠突散囊菌E.cristatum CY-1的固態(tài)發(fā)酵

土豆汁-葡萄糖液體（potato dextrose broth，PDB）培養(yǎng)基的制備：稱取200 g馬鈴薯，去皮切碎，加水煮20 min后，紗布過濾取土豆汁，加入20 g葡萄糖，定容至1 000 mL，121℃滅菌20 min，冷卻后備用。

E.cristatum CY-1種子液的制備：接種E.cristatum CY-1孢子于無菌的土豆汁-葡萄糖液體培養(yǎng)基中，在28℃～30℃以 180 r/min～200 r/min振蕩培養(yǎng) 2 d～3 d，得到冠突散囊菌種子液。

桑葉發(fā)酵培養(yǎng)基的制備：稱取洗凈瀝干水分的鮮桑葉500 g，分批加入到植物攪碎機(jī)中，加入適量蒸餾水進(jìn)行攪碎，最終蒸餾水的加入體積為100 mL。收集攪碎后的鮮桑葉。按照與鮮桑葉質(zhì)量比1∶10加入麩皮，自然pH值下攪拌均勻，得到桑葉固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。在250 mL三角瓶中加入上述30 g桑葉固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)，于121℃滅菌20 min后，冷卻，用于E.cristatum CY-1的固態(tài)發(fā)酵。以10%接種量接種E.cristatum CY-1種子液，攪拌均勻后，置于28℃～30℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。每2 d取樣，樣品置于4℃冰箱冷藏備用。每組試驗(yàn)設(shè)置3個平行。

1.3.2 冠突散囊菌生物量的測定

桑葉固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)中冠突散囊菌生物量的測定采用氨基葡萄糖法[28]。首先在520 nm測定氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品含量與吸光度的關(guān)系，并建立其標(biāo)準(zhǔn)曲線。以E.cristatum CY-1純菌體進(jìn)行氨基葡萄糖的提取，在520 nm測定該提取液的吸光度，根據(jù)上述氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品含量與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線得出提取液中所含氨基葡萄糖的量，并建立E.cristatum CY-1中氨基葡萄糖含量與其生物量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。經(jīng)E.cristatum CY-1固態(tài)發(fā)酵的桑葉培養(yǎng)物在60℃烘干至恒重后用于氨基葡萄糖的提取與測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程（1）計算提取液中氨基葡萄糖含量，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程（2）換算得到發(fā)酵基質(zhì)中E.cristatum CY-1的生物量。

式中：Y0為提取液中氨基葡萄糖的含量，mg；X0為提取液中氨基葡萄糖的吸光度；Y1為換算得到的菌體生物量，mg。

E.cristatum CY-1純菌體的制備方法：將E.cristatum CY-1接種至土豆汁-葡萄糖液體培養(yǎng)基，在28℃～30℃以180 r/min～200 r/min振蕩培養(yǎng)7 d。以紗布過濾發(fā)酵產(chǎn)物，并以蒸餾水充分洗滌，收集固體剩余物，烘干至恒重即得E.cristatum CY-1純菌體。

1.3.3 冠突散囊菌發(fā)酵過程中桑葉基質(zhì)失重率分析

取適量經(jīng)E.cristatum CY-1固態(tài)發(fā)酵的剩余物，在60℃干燥至恒重后，按式（3）計算其含水率（%）。然后按式（4）計算發(fā)酵前后桑葉基質(zhì)的失重率。

式中：R1和R2分別為發(fā)酵剩余物干燥前與干燥后的質(zhì)量，g。

式中：W0和Wt分別為發(fā)酵前鮮桑葉基質(zhì)和不同發(fā)酵時間桑葉基質(zhì)的質(zhì)量，g；R0和Rt分別為發(fā)酵前鮮桑葉基質(zhì)和不同發(fā)酵時間桑葉基質(zhì)的含水率，%。

1.3.4 桑葉總黃酮與總多糖的提取及其含量的測定

桑葉總多糖的提取及測定[29]：稱取發(fā)酵前后的桑葉樣品（濕重），按照料液比 1∶30（g/mL）加入蒸餾水，混勻后于80℃水浴超聲輔助提取20 min，抽濾收集桑葉總多糖提取液。該多糖提取液以6 mol/L鹽酸于沸水浴中水解30 min，冷卻后調(diào)節(jié)pH值至8.0，得到桑葉多糖水解液。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用二硝基水楊酸法測定該水解液中還原糖含量（mg/g干桑葉）。由于多糖水解為單糖時，每斷裂一個糖苷鍵需加入一分子水，故在計算單糖含量時需乘以0.9計算桑葉中總多糖含量。

桑葉總黃酮的提取及測定[30]：稱取發(fā)酵前后的桑葉樣品（濕重），按照料液比1∶10（g/mL）加入70%的乙醇溶液，50℃水浴超聲輔助提取40 min，8 000 r/min離心10 min，收集上清液。沉淀物再按上述步驟重復(fù)提取1次，合并上清液，即得桑葉總黃酮提取液。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-NaOH比色法于510 nm處測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=13.09X-0.057 7（R2=0.991 3）計算桑葉黃酮提取液中總黃酮含量（mg/g干桑葉）。

1.3.5 ɑ-葡萄糖苷酶抑制率分析

桑葉黃酮對ɑ-葡萄糖苷酶的抑制率分析在96孔板上進(jìn)行[31-32]。共設(shè)置4個組別：空白組、對照組、樣品空白組、樣品組。其中，對照組為ɑ-葡萄糖苷酶與底物pNPG反應(yīng)組；樣品組中加入以pH6.8磷酸緩沖液（0.2 mol/L）稀釋至0.001 mg/mL～0.040 mg/mL的桑葉黃酮提取物作為抑制劑。每個試驗(yàn)組所加入的試劑及添加順序如表1所示。在反應(yīng)結(jié)束時，加入1 mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng)，然后于405 nm波長下，以酶標(biāo)分析儀測定吸光度。

表1 不同試驗(yàn)組中各反應(yīng)物添加量和順序Table 1 The adding volume and order of reagents in different experimental group μL

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，按式（5）計算抑制劑對ɑ-葡萄糖苷酶的抑制率。并對經(jīng)E.cristatumCY-1固態(tài)發(fā)酵4、8d和10d所得的桑葉的黃酮提取物進(jìn)行濃度（0.001 mg/mL～0.040 mg/mL）與ɑ-葡萄糖苷酶抑制率（%）的非線性擬合，根據(jù)擬合曲線計算半抑制劑濃度（IC50）。

式中：AB為pNPG自動分解得到的吸光度；AC為pNPG自動分解和酶促分解得到的吸光度和；ASB為樣品和pNPG自動分解得到的吸光度和；AS為樣品、pNPG自動分解、酶促分解及抑制劑抑制分解所得到的吸光度總和。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有結(jié)果數(shù)據(jù)都設(shè)立至少3個平行組。采用Origin 9.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及圖形繪制。采用One-way ANOVA進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析，在95%置信區(qū)間被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 E.cristatum CY-1桑葉固態(tài)發(fā)酵的細(xì)胞生長及桑葉基質(zhì)失重率

采用E.cristatum CY-1進(jìn)行桑葉固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵過程中E.cristatum CY-1的細(xì)胞生長及桑葉基質(zhì)的失重率見圖1。

圖1 以鮮桑葉為基質(zhì)的冠突散囊菌細(xì)胞生長曲線及桑葉基質(zhì)失重率Fig.1 The cell growth curve of E.cristatum CY-1 using mulberry leaves as substrate and the weight loss of mulberry leaf medium

由圖1可知，就細(xì)胞生長而言，以ML固態(tài)發(fā)酵細(xì)胞干重隨著發(fā)酵時間的延長而增加，且生長情況要優(yōu)于以PDB液態(tài)發(fā)酵。在E.cristatum CY-1固態(tài)發(fā)酵桑葉基質(zhì)的第8天，生物量達(dá)到最高值，為378.2 mg，之后生長趨于穩(wěn)定。而隨著E.cristatum CY-1的生長，桑葉培養(yǎng)基的失重率也增加，在發(fā)酵進(jìn)行到第8天時，桑葉培養(yǎng)基的失重率達(dá)到19.64%，之后趨于穩(wěn)定，這和E.cristatum CY-1的生長曲線趨勢是一致的。

2.2 發(fā)酵過程中桑葉總黃酮含量的變化

桑葉總黃酮含量隨E.cristatum CY-1發(fā)酵的變化見圖2。

圖2 桑葉總黃酮含量隨E.cristatum CY-1發(fā)酵的變化Fig.2 The total flavonoids content in mulberry leaves during the fermentation of E.cristatum CY-1

通過研究E.cristatum CY-1固態(tài)發(fā)酵對桑葉總黃酮含量的影響發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵后桑葉總黃酮的含量隨著發(fā)酵時間的延長而不斷增加，在第8天達(dá)到峰值3.289mg/g干桑葉，相對于未經(jīng)發(fā)酵桑葉中總黃酮的含量提高了78.72%（圖2）?？傸S酮含量的升高主要?dú)w因于冠突散囊菌發(fā)酵過程中分泌的多種酶，如苯丙氨酸解氨酶、纖維素酶等均可破壞細(xì)胞壁的致密結(jié)構(gòu)、降低細(xì)胞壁對黃酮類化合物溶出的阻滯作用，從而增加了總黃酮類物質(zhì)的含量[27]。另一方面，通過分析發(fā)酵基質(zhì)中總多糖含量的變化發(fā)現(xiàn)，雖然在發(fā)酵0～2 d，總多糖含量出現(xiàn)短暫的升高，但此后，隨著發(fā)酵的進(jìn)行總多糖含量快速降低，在第10天時基質(zhì)中的總多糖含量由第2天的165.71 mg/g干桑葉降低至39.44 mg/g干桑葉，降解率達(dá)到79.52%。這說明基質(zhì)中易發(fā)酵的多糖類物質(zhì)作為營養(yǎng)源被E.cristatum CY-1用于維持生長與代謝。而隨著多糖等物質(zhì)的降解，發(fā)酵剩余物中黃酮類物質(zhì)的相對含量顯著提高[27，33]。另外，發(fā)酵過程中微生物可能通過生物轉(zhuǎn)化促進(jìn)黃酮類物質(zhì)的生成，如申春莉等[34]發(fā)現(xiàn)在靈芝菌發(fā)酵豆渣的發(fā)酵前期，豆渣中的糖苷型異黃酮轉(zhuǎn)化為苷元型異黃酮，這也可能造成發(fā)酵桑葉中黃酮類物質(zhì)含量升高。

但是，發(fā)酵8 d后桑葉發(fā)酵剩余物中總黃酮含量迅速降低，在發(fā)酵第10天黃酮含量降至1.725 mg/g干桑葉，相對于第8天減少了約47.6%。造成發(fā)酵桑葉中總黃酮含量減少的原因，一方面是由于微生物發(fā)酵過程中分泌的次級代謝產(chǎn)物可與黃酮類化合物發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致黃酮類化合物的減少[34]。另一方面，在發(fā)酵后期，隨著可發(fā)酵營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，黃酮類化合物可被微生物分泌的酶降解，并作為營養(yǎng)基質(zhì)參與微生物的生長及代謝，從而造成黃酮含量的降低[33]。

2.3 發(fā)酵對桑葉中總黃酮α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響

許多研究發(fā)現(xiàn)E.cristatum具有提高底物營養(yǎng)價值和生物活性的巨大潛力，如E.cristatum可以增強(qiáng)黑豆發(fā)酵過程中酚類化合物積累的抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制活性[24]，E.cristatum發(fā)酵葛根的抗氧化活性優(yōu)于未發(fā)酵葛根[27]；E.cristatum發(fā)酵的豆渣提取物可作為潛在的α-葡萄糖苷酶抑制劑，并可以明顯降低餐后血糖水平[35]。通過體外試驗(yàn)評價，研究了不同發(fā)酵時間所得到的MLF的α-葡萄糖苷酶抑制活性差異，結(jié)果見圖3。

圖3 E.cristatum CY-1發(fā)酵的桑葉黃酮提取物對α-葡萄糖苷酶抑制率Fig.3 The inhibition efficiency of α-glucosidase of flavonoids extracted from the fermented mulberry leaf of E.cristatum CY-1

由圖3可以看出，發(fā)酵后的MLF對α-葡萄糖苷酶的抑制率均明顯升高，當(dāng)MLF濃度約為50 μg/mL時，未經(jīng)發(fā)酵桑葉的MLF對α-葡萄糖苷酶的抑制率為66.76%，而發(fā)酵10 d的桑葉MLF對α-葡萄糖苷酶的抑制率則達(dá)到90.54%。

對不同發(fā)酵時間所得MLF濃度與ɑ-葡萄糖苷酶抑制率進(jìn)行擬合，結(jié)果表明ExpDec1模型的擬合效果較好，其擬合方程及R2見表2。

表2 發(fā)酵桑葉的黃酮提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制率擬合參數(shù)Table 2 Fitting parameters of inhibition rate of flavonids extracted from fermented mulberry leaves on the α-glucosidase

發(fā)酵后的MLF對ɑ-葡萄糖苷酶的IC50均發(fā)生了明顯的降低，且發(fā)酵時間越長，IC50值越低，其中經(jīng)E.cristatum CY-1發(fā)酵10 d的桑葉黃酮提取物對α-葡萄糖苷酶的IC50由未發(fā)酵MLF的25.955 μg/mL降至4.925 μg/mL。這說明E.cristatum CY-1發(fā)酵可以有效地改善MLF對α-葡萄糖苷酶的抑制能力。雖然E.cristatum CY-1發(fā)酵桑葉在第10天時MLF（10）含量相對于發(fā)酵第8天的MLF（8）最高值減少了47.6%，但是它對α-葡萄糖苷酶的IC50值為11.670 μg/mL，明顯高于MLF（10）。這可能是在發(fā)酵后期，微生物及其酶的作用使得黃酮類物質(zhì)分解形成了新的結(jié)構(gòu)及產(chǎn)物，而后者具有更強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶的抑制能力[33-34]。

3 結(jié)論

論文研究了冠突散囊菌E.cristatum CY-1固態(tài)發(fā)酵對新鮮桑葉中總黃酮含量及其α-葡萄糖苷酶的抑制活性等的影響，取得了如下主要結(jié)論：E.cristatum CY-1能夠以新鮮桑葉為發(fā)酵基質(zhì)進(jìn)行生長，并在發(fā)酵第8天趨于穩(wěn)定，發(fā)酵30 g鮮桑葉E.cristatum CY-1的生物量達(dá)到378.2 mg。發(fā)酵過程中，桑葉的總黃酮含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在第8天桑葉黃酮含量相對于未發(fā)酵桑葉提高了78.72%，但之后明顯降低。經(jīng)E.cristatum CY-1發(fā)酵后的桑葉，其黃酮提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制率隨發(fā)酵時間的延長而不斷升高，半抑制濃度（IC50）則明顯降低。發(fā)酵10 d的桑葉，其黃酮提取物和未發(fā)酵桑葉的黃酮提取物對α-葡萄糖苷酶的 IC50值分別為 4.925 μg/mL 和 25.995 μg/mL。由此可見，冠突散囊菌發(fā)酵可以有效地增強(qiáng)桑葉黃酮對α-葡萄糖苷酶的抑制能力。